gDNA-Anreicherung für die NGS-Sequenzierung ist ein einfaches und leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung von konstitutionellen Mutationen. In diesem Artikel stellen wir das Verfahren vor, mit dem einfach die vollständige Sequenz von 11 Genen analysiert werden kann, die an der Reparatur von DNA-Schäden beteiligt sind.
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Methodenartikel
gDNA Enrichment durch eine Transposase-basierte Technologie für NGS-Analyse der gesamten Sequenz von BRCA1, BRCA2 Und 9 Gene in der DNA-Reparatur beteiligt Schäden
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der weit verbreitete Einsatz von Next Generation Sequencing hat neue Wege für die Krebsforschung und Diagnostik eröffnet. NGS werden riesige Mengen neuer Daten über Krebs, und vor allem Krebsgenetik zu bringen. Aktuellen Wissensstand und zukünftige Entdeckungen machen es notwendig, eine große Anzahl von Genen, die in einem genetischen Prädisposition für Krebs beteiligt sein könnten studieren. In diesem Zusammenhang haben wir eine Nextera Design bis 11 vollständige Gene in der DNA-Reparatur beteiligt sind Schäden zu untersuchen. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um sicher zu studieren 11 Gene (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80 und TP53) von Promotor zu 3'-UTR bei 24 Patienten gleichzeitig. Dieses Protokoll, basierend auf Transposase Technologie und gDNA Bereicherung, gibt einen großen Vorteil in Bezug auf die Zeit für die genetische Diagnostik durch Multiplexing zu probieren. Dieses Protokoll kann sicher mit Blut gDNA verwendet werden.
Einleitung
Im Jahr 2010 fast 1,5 Millionen Menschen (im wesentlichen Frauen) entwickelt weltweit Brustkrebs. Es wird geschätzt, dass 5 bis 10% dieser Fälle waren erblich. Vor fast 20 Jahren, BRCA1 und BRCA2 identifiziert wurden, wie in erblichen Brust-und Eierstockkrebs 1 beteiligt. Seit vor etwa 15 Jahren haben BRCA1-und BRCA2-codierenden Regionen wurden sequenziert, um die genetische Prädisposition für Brust-und Eierstockkrebs zu bestimmen. Veränderungen im BRCA1 und BRCA2 sind in 10 bis 20% der ausgewählten Familien 2 nahelegt, daß die Analyse dieser Bereiche ist nicht ausreichend für eine effektive Screening....
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Protokoll
1. Bewertung der gDNA (genomische DNA) Ertrag
- Quantifizieren frisch extrahierten gDNA vor der Herstellung der Bibliothek. Verwenden Sie die fluorometrischer Ertragsgutachten Methode, um intakte gDNA quantifizieren (vermeiden Sie mit einem Spektralphotometer für gDNA Ertragsgutachten). Messung der (260/280 nm) Verhältnis und sicherzustellen, dass sie zwischen 1,8 und 2 HINWEIS: 50 ng gDNA werden für das Experiment erforderlich ist.
2. gDNA Enrichment: Tag 1, Morgen
- Vor dem Start
- Von der DNA-Anreicherung Satz (siehe Tabelle der Materialien / Ausrüstung), Tau-DNA-Puffer (TD) und DNA-Enzym (Tde1) Lösungen ....
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Ergebnisse
Probe QC Ergebnisse
Die Fähigkeit dieses Verfahrens, um Sequenzen von Zielgenen zu bestimmen, ist von der Qualität der gDNA (2A) und der Qualität des tagmentation Schritt basiert. Wenn die tagmentation nicht ausreicht (2B oben), wird die Sequenzierung nicht zufriedenstellend. Wie oben erwähnt, nach der tagmentation Reinigung der gDNA sollte in Fragmente von 150 bp bis 1000 bp mit der Mehrzahl der Fragmente etwa 300 bp (2B, unteres Feld) tagment.......
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Diskussion
Der weit verbreitete Einsatz von NGS-Geräten und Technologien hat neue Möglichkeiten bei der Untersuchung von Krebs und genetische Erkrankungen vorgesehen. Neben der Sequenzierung ganzer Genome oder RNA-Sequenzierung, die Analyse einer großen Menge von ausgewählten gDNA-Sequenzen in zahlreiche Patienten bietet gleichzeitig große Perspektiven in Diagnose. Hier ein bestimmtes Design (auf Anfrage) mit Nextera Technologie, um 11 vollständige Gene bei 24 Patienten gleichzeitig mit einem mittleren Durchsatz-Sequenzierung Gerä.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.
Danksagungen
Wir danken der Ligue contre le Cancer de Côte d'Or und dem Centre Georges-François Leclerc für ihre finanzielle Unterstützung. Wir danken Philip Bastable für die Bearbeitung des Manuskripts.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| MiSeq | Illumina | SY-410-1001 | Sequenzier-/Mitteldurchsatzgerät |
| Nextera Anreicherungskit | Illumina | FC-123-1208 | Transposase-basierte Technologie |
| 300-Zyklus-Kartusche | Illumina | 15033624 | |
| AMPure-Kügelchen | Beckman Coulter | A63881 | Magnetische Aufreinigungskügelchen |
| Magnetisches Stativ | Alpaqua | A32782 | |
| 96-Well-Platten | Life Technologies | 4306737 | |
| MIDI 96-Well-Platten | Biorad | AB0859 | |
| Microseal A | Biorad | MSA-5001 | Diese Versiegelung ist nur für die PCR-Amplifikation erforderlich. Andere Standarddichtungen können während des gesamten Experiments verwendet werden |
| MiSeq | Illumina | Wird mit dem Sequenziergerät geliefert Experiment Manager Software Internetadresse: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new Tool auf der Website des Herstellers |
Referenzen
- Cornelisse, C. J., Cornelis, R. S., Devilee, P. Genes responsible for familial breast cancer. Pathol. Res. Pract. 192 (7), 684-693 (1996).
- Culver, J., Lowstuter, K., Bowling, L. Assessing breast cancer risk and BRCA1/2 carrier probability. Breast Dis. 27, 5-20 (2007).
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Nachdrucke und Genehmigungen
