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Biology

के पूरे दृश्य की NGS विश्लेषण के लिए एक Transposase आधारित प्रौद्योगिकी द्वारा gDNA संवर्धन Published: October 6, 2014 doi: 10.3791/51902
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology and Pathology of Tumors, Unit of Molecular Biology, Platform of Immunomonitoring and Genetics, Centre Georges-François Leclerc

Abstract

अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के व्यापक उपयोग कैंसर अनुसंधान और निदान के लिए नए रास्ते खोल दिए हैं. NGS विशाल कैंसर पर नया डेटा की मात्रा, और विशेष रूप से कैंसर जेनेटिक्स लाएगा. वर्तमान ज्ञान और भविष्य की खोजों यह आवश्यक कैंसर को एक आनुवंशिक गड़बड़ी में शामिल किया जा सकता है कि जीन की एक बड़ी संख्या का अध्ययन करने के लिए कर देगा. इस संबंध में, हम डीएनए की क्षति की मरम्मत में शामिल 11 पूर्ण जीन अध्ययन करने के लिए एक Nextera डिजाइन विकसित की है. इस प्रोटोकॉल को सुरक्षित रूप से एक साथ 24 रोगियों में 11 जीन (एटीएम, BARD1, बीआरसीए 1, बीआरसीए 2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, और TP53) प्रमोटर से 3'-UTR के लिए अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था. Transposase प्रौद्योगिकी और gDNA संवर्धन पर आधारित यह प्रोटोकॉल, बहुसंकेतन नमूने के लिए आनुवंशिक निदान धन्यवाद के लिए समय के मामले में एक महान लाभ देता है. इस प्रोटोकॉल को सुरक्षित रूप से रक्त gDNA के साथ प्रयोग किया जा सकता है.

Introduction

2010 में, (अनिवार्य रूप से महिलाओं) लगभग 15 लाख लोगों को दुनिया भर में स्तन कैंसर विकसित की है. यह इन मामलों में से 5 से 10% वंशानुगत थे कि अनुमान है. वंशानुगत स्तन और डिम्बग्रंथि के कैंसर 1 में शामिल के रूप में लगभग 20 साल पहले, बीआरसीए 1 और बीआरसीए 2 की पहचान की गई. लगभग 15 साल पहले के बाद से, बीआरसीए 1 और बीआरसीए 2 कोडिंग क्षेत्रों स्तन और अंडाशय कैंसर को आनुवंशिक गड़बड़ी का निर्धारण करने के लिए अनुक्रम निर्धारण किया गया है. बीआरसीए 1 और बीआरसीए 2 में बदलाव इन क्षेत्रों का विश्लेषण प्रभावी जांच के लिए पर्याप्त नहीं है, सुझाव है कि चयनित परिवारों को 2 से 10 से 20% में पता चला रहे हैं. हाल ही में, बीआरसीए 1 और बीआरसीए 2 के गैर कोडन दृश्यों (प्रमोटर, इंट्रोन्स, 3'UTR) के विश्लेषण के नए परिवर्तन / विविधताओं स्तन कैंसर 3-6 के एक उच्च जोखिम से जोड़ा जा सकता है कि प्रकाश डाला.

बीआरसीए 1 और बीआरसीए 2 प्रोटीन (मुताबिक़ पुनर्संयोजन मरम्मत में शामिल रहे हैंकई भागीदारों 7 से पूरा हो गया है, जो HHR),. बीआरसीए 1 या बीआरसीए 2 में परिवर्तन डीएनए की मरम्मत में दोष उत्पन्न करते हैं, अन्य भागीदारों को भी स्तन कैंसर के खतरे को प्रभावित कर सकता है. इस परिकल्पना BRIP1 8 के बाद से मान्य किया गया है प्रकट होता है और PALB2 9 क्रमशः, ग्रीवा और स्तन कैंसर पर एक सिद्ध प्रभाव पड़ता है. इसके अलावा, दो अन्य "मध्यम जोखिम" स्तन कैंसर का खतरा जीन, एटीएम और CHEK2, भी नियमित तौर पर 10 अध्ययन किया जा सकता है.

इन अध्ययनों से पर के बाद, हम एक साथ अपेक्षाकृत एक बहुत आसान और उपयोग कर 24 रोगियों में 11 जीन (एटीएम, BARD1, बीआरसीए 1, बीआरसीए 2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80, और TP53) का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित करने का फैसला एक मध्यम throughput डिवाइस पर संवर्धन और अनुक्रमण साथ Transposase प्रौद्योगिकी पर आधारित तेज प्रोटोकॉल,. धन्यवादइस तकनीक के लिए, हम 2,500 बीपी के एक intronic क्षेत्र में शामिल नहीं किया गया था, जिसके लिए RAP80, (: 176,381,588-176,390,180 Chr5) के अलावा, 3'-UTR के अंत करने के प्रमोटर के शुरू से ही पूरा जीन अनुक्रम. यह 2734 जांच के साथ अध्ययन के बारे में 1000300 बीपी के कुल का प्रतिनिधित्व करता है. आमतौर पर, बीआरसीए 1 और बीआरसीए 2 exonic दृश्यों कम से कम 20 रोगियों के लिए 1.5 महीने की जरूरत है जो सेंगर अनुक्रमण, से विश्लेषण कर रहे हैं. वर्तमान प्रोटोकॉल (चित्रा 1) के साथ, एक ही समय में, 75 से अधिक रोगियों के लिए 11 पूर्ण जीन विश्लेषण किया जा सकता है.

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Protocol

GDNA 1. आकलन (जीनोमिक डीएनए) यील्ड

  1. हौसले से पुस्तकालय की तैयारी से पहले gDNA निकाले यों. (GDNA उपज आकलन के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर उपयोग कर से बचने) बरकरार gDNA यों fluorometric उपज आकलन विधि का प्रयोग करें. (260/280 एनएम) अनुपात को मापने और नोट 1.8 के बीच और 2 यह है कि यह सुनिश्चित करें: gDNA के 50 एनजी प्रयोग के लिए आवश्यक हैं.

2 gDNA संवर्धन: दिन 1, मॉर्निंग

  1. शुरू करने से पहले
    1. डीएनए संवर्धन किट से डीएनए बफर (टीडी) और बर्फ पर डीएनए एंजाइम (TDE1) समाधान पिघलना, (सामग्री / उपकरण की तालिका देखें). कम से कम 30 मिनट उपयोग करने से पहले, शुद्धि चुंबकीय मोती लाने और लक्ष्य (अनुसूचित जनजाति) को रोकने के कमरे के तापमान (आर टी) के लिए बफर. नमूना प्रति अच्छी तरह से, μl सीधे एक 96 अच्छी तरह से थाली में / 2-2.5 एनजी पर 1 gDNA नमूना के 20 μl जोड़ें. महत्वपूर्ण: प्रोटोकॉल (ज्ञात अनुक्रम बदलाव के साथ नमूना) को मान्य करने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण का प्रयोग करें.
  2. Tagmentation
    1. एमनौवीं सब अच्छी तरह से 5x inverting से अभिकर्मकों, और नीचे स्पिन संक्षेप. आरटी पर, TDE1 बफर के प्रत्येक अच्छी तरह gDNA के 50 एनजी (20 μl) युक्त, और फिर 5 μl के लिए टीडी बफर के 25 μl जोड़ें. धीरे से ऊपर और नीचे 10x पूरी मात्रा पिपेट, 50 μl विंदुक सेट करें.
    2. 20 डिग्री सेल्सियस पर 280 XG पर 1 मिनट के लिए एक चिपकने वाला फिल्म और अपकेंद्रित्र के साथ प्लेट कवर. फिर, एक thermocycler में थाली (100 डिग्री सेल्सियस पर गरम कवर) जगह और निम्नलिखित प्रोग्राम चलाने: 5 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस और असीमित समय के लिए 10 डिग्री सेल्सियस.
    3. इस ऊष्मायन के दौरान इस्तेमाल किया जाएगा कि अनुक्रमित परिभाषित करने के लिए प्रयोग प्रबंधक सॉफ्टवेयर के साथ नमूना शीट तैयार करते हैं.
  3. Tagmentation शोधन
    नोट: यह कदम महत्वपूर्ण है. बहुत सावधान रहना होगा.
    1. शुद्धि चुंबकीय माला और अनुसूचित जनजाति के बफर में वेग के अभाव के लिए जाँच करें. अवक्षेप मौजूद हैं, तो हाथ में समाधान को गर्म. बर्फ पर पिघलना मेजबान बफर (आरएसबी).
    2. आरटी पर, भंवर अनुसूचित जनजाति के समाधान और जोड़प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त नमूने के 15 μl. धीरे से ऊपर और नीचे 10x पूरी मात्रा पिपेट, 65 μl विंदुक सेट करें. आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं. 20 डिग्री सेल्सियस पर 280 XG पर 1 मिनट के लिए थाली और अपकेंद्रित्र कवर.
    3. प्रत्येक कुएं में पहले से मिश्रित शुद्धि चुंबकीय मोतियों की 52 μl जोड़ें. धीरे, 117 μl विंदुक सेट अप और डाउन 10x पूरी मात्रा पिपेट. आरटी पर 10 मिनट के लिए सेते हैं. 20 डिग्री सेल्सियस पर 280 XG पर 1 मिनट के लिए थाली और अपकेंद्रित्र कवर.
    4. चिपकने वाली फिल्म निकालें. आरटी पर 2 मिनट के लिए एक चुंबकीय स्टैंड पर 96 अच्छी तरह से थाली रखें. सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से स्पष्ट प्रतीत होता है कि यह सुनिश्चित करें.
    5. (24 नमूने लिए 8 मिलीग्राम इथेनॉल के लिए डिस्टिल्ड पानी के 2 मिलीलीटर जोड़ने) एक ताजा 80% इथेनॉल समाधान तैयार है. निकालें और मोती को परेशान करने की नहीं सतह पर तैरनेवाला देखभाल त्यागें.
    6. चुंबकीय स्टैंड पर थाली रखते हुए, मोती परेशान बिना प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए हौसले से तैयार 80% इथेनॉल के 200 μl जोड़ने और कम से कम 30 सेकंड के लिए थाली सेतेकमरे के तापमान पर. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और इस धोने दूसरी बार दोहराएँ. इथेनॉल सुनिश्चित हटा दिया गया है. 10 मिनट के लिए या इथेनॉल का पूरा वाष्पीकरण जब तक कमरे के तापमान पर शुष्क करते हैं.
    7. चुंबकीय स्टैंड से थाली निकालें और आरएसबी बफर के 22.5 μl जोड़ें. धीरे से ऊपर और नीचे 10x पूरी मात्रा पिपेट, 22.5 μl विंदुक सेट करें. चुंबकीय स्टैंड पर 96 अच्छी तरह से थाली प्लेस और 2 मिनट के लिए सेते हैं. सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से स्पष्ट प्रतीत होता है कि यह सुनिश्चित करें. धीरे से एक नया 96 अच्छी तरह से थाली में सतह पर तैरनेवाला के 20 μl हस्तांतरण.
      नोट: वैकल्पिक रूप से, एक टुकड़ा विश्लेषक का उपयोग करके tagmented नमूने के आकार का निर्धारण. इसके बजाय ऊपर उल्लेख किया चरणों की, उच्च संकल्प acrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करें. टुकड़े 150 बीपी और 1,000 बीपी के बीच होना चाहिए.
  4. 1 सेंट पीसीआर प्रवर्धन
    1. बर्फ पर पोलीमरेज़ (एल.पी. PMM), सूचकांक 1 प्राइमर, और सूचकांक 2 प्राइमर समाधान युक्त पिघलना पीसीआर मास्टर मिश्रण. संयोजन * मिलानप्रयोग प्रबंधक नमूना पत्र के साथ च अनुक्रमित. बहुसंकेतन के लिए, प्रत्येक नमूने के सूचकांक में 1 (i7, N7xx) से अलग i7 तैयार करते हैं.
    2. प्रत्येक में अच्छी तरह से, धीरे, एल.पी. PMM के 20 μl, सूचकांक 1 से 5 μl, और 50 μl विंदुक सेट सूचकांक 2 से 5 μl जोड़ने के ऊपर और नीचे 10x पूरी मात्रा पिपेट. एक चिपकने वाला microseal फिल्म के साथ प्लेट कवर. 20 डिग्री सेल्सियस पर 280 XG पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
    3. एक thermocycler में थाली (कवर 100 डिग्री सेल्सियस पर गरम किया जाता है) और रन कार्यक्रम 1 (1 टेबल) रखें.
      नोट: प्रक्रिया में इस बिंदु पर रोका जा सकता है और प्रतिक्रियाओं thermocycler में या 2 और 8 डिग्री सेल्सियस के बीच 2 दिनों के लिए रात भर संग्रहीत.

3 gDNA संवर्धन: दिन 1, दोपहर

  1. शुरू करने से पहले
    1. पिघलना oligos (सीएसओ), कब्जा लक्ष्य बफर 1 (NCT1), और बर्फ पर आरएसबी समाधान. कम से कम 30 मिनट उपयोग करने से पहले, आरटी को शुद्धि चुंबकीय मोती ले आओ.
  2. पीसीआर शोधन
    1. 20 डिग्री सेल्सियस पर 280 XG पर 1 मिनट के लिए, 2.4 कदम से थाली अपकेंद्रित्र.
    2. आरटी पर, प्रत्येक कुएं में मिश्रित शुद्धि चुंबकीय मोतियों की 45 μl जोड़ें. धीरे, 95 μl विंदुक सेट अप और डाउन 10x पूरी मात्रा पिपेट. आरटी पर 10 मिनट के लिए सेते हैं. आरटी पर 2 मिनट के लिए एक चुंबकीय स्टैंड पर 96 अच्छी तरह से थाली रखें.
    3. सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से स्पष्ट प्रतीत होता है कि यह सुनिश्चित करें. (24 नमूने लिए 8 मिलीग्राम इथेनॉल के लिए डिस्टिल्ड पानी के 2 मिलीलीटर जोड़ने) एक ताजा 80% इथेनॉल समाधान तैयार है. गोली परेशान नहीं सतह पर तैरनेवाला देखभाल त्यागें.
    4. चुंबकीय स्टैंड पर थाली रखते हुए, मोती परेशान बिना प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए हौसले से तैयार 80% इथेनॉल के 200 μl जोड़ने और कमरे के तापमान पर 30 सेकंड के लिए थाली सेते हैं. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और इस धोने दूसरी बार दोहराएँ. इथेनॉल सुनिश्चित हटा दिया गया है. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर शुष्क करते हैं.
    5. चुंबकीय स्टैंड से थाली निकालें और आरएसबी बफर के 40 μl जोड़ें. पाइप सेट40 μl को TTE, धीरे नीचे 10x पूरी मात्रा ऊपर और विंदुक.
    6. चुंबकीय स्टैंड पर 96 अच्छी तरह से थाली प्लेस और 2 मिनट के लिए सेते हैं. सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से स्पष्ट दिखाई देना चाहिए. धीरे से एक नया 96 अच्छी तरह से थाली में सतह पर तैरनेवाला के 38 μl हस्तांतरण.
    7. एक fluorimetric विधि द्वारा प्रत्येक नमूने की उपज का निर्धारण करते हैं. आकलन किया पैदावार 30 और 50 एनजी / μl के बीच हैं यदि प्रोटोकॉल का यह पहला हिस्सा मान्य किया जाएगा.
  3. 1 सेंट संकरण
    1. एक नया 96 अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक नमूने के 500 एनजी के मिश्रण से इस स्तर पर पूल प्रति 12 नमूनों को पूल. प्रत्येक पूल के अंतिम मात्रा 40 μl से अधिक नहीं है कि सुनिश्चित करें.
      नोट: (: ताप डीएनए गिरावट का कारण बनता है के रूप में भी 30 डिग्री सेल्सियस, डीएनए की एकाग्रता ताप से संशोधित नहीं किया जा सकता सतर्कता) की जरूरत है, आरटी पर एक वैक्यूम concentrator डिवाइस का उपयोग करके पूल की मात्रा कम होती है. उनका कहना है आरएसबी समाधान द्वारा 40 μl अंतिम मात्रा समायोजित करें.
    2. अच्छी तरह मिक्सNCT1 समाधान. जमा डीएनए नमूने के प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त 40 μl के लिए, NCT1 के 50 μl, और सीएसओ के 10 μl जोड़ें. धीरे से ऊपर और नीचे 10x पूरी मात्रा पिपेट, 100 μl विंदुक सेट करें. 20 डिग्री सेल्सियस पर 280 XG पर 1 मिनट के लिए थाली और अपकेंद्रित्र सील.
    3. एक thermocycler में थाली (कवर 100 डिग्री सेल्सियस पर गरम किया जाता है) और रन कार्यक्रम 2 (1 टेबल) रखें.

4 gDNA संवर्धन: 2 दिन, सुबह

  1. शुरू करने से पहले
    1. डीएनए संवर्धन किट से पिघलना (सामग्री / उपकरण की तालिका देखें) 2 एन NaOH, क्षालन बफर 1 ET2, streptavidin चुंबकीय मोती (एसएमबी), धोने समाधान 1 (WS1), धोने लक्ष्य (HP3), लक्ष्य क्षालन बफर 1 (ET1) समाधान 2 (WS2), धोने समाधान 3 (WS3), आरटी पर सीएसओ, और NCT1 समाधान.
  2. 1 सेंट संकरण धो
    1. 20 डिग्री सेल्सियस पर 280 XG पर thermocycler और अपकेंद्रित्र 1 मिनट से 96 अच्छी तरह से थाली निकालें. बहुत carefu चिपकने वाला कवर निकालेंlly.
    2. एक नए मिडी 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए थाली से 100 μl प्रतिक्रिया मिश्रण हस्तांतरण और अच्छी तरह vortexed एसएमबी समाधान के 250 μl जोड़ें. धीरे से ऊपर और नीचे 10x पूरी मात्रा पिपेट, 350 μl विंदुक सेट करें. थाली सील और 30 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं.
    3. 20 डिग्री सेल्सियस पर 280 XG पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, चिपकने वाला सील हटाने और 2 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर प्लेट रखें. सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से स्पष्ट प्रतीत होता है कि यह सुनिश्चित करें. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और चुंबकीय स्टैंड से प्लेट हटा दें.
    4. अच्छी तरह से युक्त मोती में अच्छी तरह से मिश्रित WS1 समाधान के 200 μl जोड़ें. बुलबुले / फोम के गठन से बचने के नीचे 15x पूरी मात्रा और 200 μl विंदुक सेट और धीरे पिपेट.
    5. 2 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर थाली रखें. सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से स्पष्ट प्रतीत होता है कि यह सुनिश्चित करें. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और चुंबकीय स्टैंड से प्लेट हटा दें.
    6. कुओं conta में अच्छी तरह से मिश्रित WS2 समाधान के 200 μl जोड़ेंining मोती. 200 μl विंदुक सेट और धीरे पूरे मात्रा पिपेट और नीचे 15x बुलबुले / फोम के गठन से परहेज.
    7. 2 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर थाली रखें. सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से स्पष्ट प्रतीत होता है कि यह सुनिश्चित करें. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और चुंबकीय स्टैंड से प्लेट हटा दें.
    8. मोती युक्त कुओं में अच्छी तरह से मिश्रित WS2 समाधान के 200 μl जोड़ें. 200 μl विंदुक सेट और धीरे से ऊपर और नीचे 15x पूरी मात्रा पिपेट.
    9. एक नया 96 अच्छी तरह से थाली में पूरी मात्रा स्थानांतरण. थाली सील और एक thermocycler (कवर 100 डिग्री सेल्सियस पर गरम) में प्लेट रखें. 30 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर thermocycler लॉन्च.
    10. तुरंत 2 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर प्लेट रखें. सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से स्पष्ट प्रतीत होता है कि यह सुनिश्चित करें. मुहर निकालें और तुरंत सभी सतह पर तैरनेवाला त्यागें. फिर, चुंबकीय स्टैंड से प्लेट हटा दें.
    11. मोती युक्त कुओं में WS2 के 200 μl जोड़ें. 200 को पिपेट सेटμl और धीरे पूरे मात्रा पिपेट और नीचे 15x बुलबुले / फोम के गठन से परहेज. थाली सील और एक thermocycler (कवर 100 डिग्री सेल्सियस पर गरम) में प्लेट रखें. 30 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर thermocycler लॉन्च.
    12. इसके तत्काल बाद 2 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर प्लेट रखें. सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से स्पष्ट प्रतीत होता है कि यह सुनिश्चित करें. मुहर निकालें और तुरंत सभी सतह पर तैरनेवाला त्यागें. फिर, चुंबकीय स्टैंड से प्लेट हटा दें.
    13. मोती युक्त कुओं में अच्छी तरह से मिश्रित WS3 समाधान के 200 μl जोड़ें. 200 μl विंदुक सेट और धीरे से ऊपर और नीचे 15x पूरी मात्रा पिपेट.
    14. 2 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर थाली रखें. सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से स्पष्ट प्रतीत होता है कि यह सुनिश्चित करें. सभी सतह पर तैरनेवाला त्यागें और चुंबकीय स्टैंड से प्लेट हटा दें.
    15. WS3 दूसरी बार धोने दोहराएँ.
    16. सतह पर तैरनेवाला हटाने के बाद, अवशिष्ट सतह पर तैरनेवाला नीचे खींचने की थाली और संक्षिप्त अपकेंद्रित्र सील. पर थाली प्लेस2 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड. अवशिष्ट सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
    17. एक 0.2 मिलीलीटर ट्यूब में, ET1 की 28.5 μl और HP3 समाधान के 1.5 μl मिश्रण. इस मिश्रण अधिक पूल तैयार कर रहे हैं, तो तैयार ताल की संख्या से इन संस्करणों गुणा, 1 पूल के लिए है.
    18. चुंबकीय स्टैंड से थाली निकालें. ऊपर से तैयार मिश्रण की 23 μl जोड़ें. 23 μl विंदुक सेट और धीरे से ऊपर और नीचे 15x पूरी मात्रा पिपेट. थाली सील और आरटी पर 5 मिनट के लिए छोड़ दें. 20 डिग्री सेल्सियस पर 280 XG पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
    19. 2 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर थाली रखें. सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से स्पष्ट प्रतीत होता है कि यह सुनिश्चित करें. चिपकने वाली फिल्म निकालें और एक नया 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए सतह पर तैरनेवाला के 21 μl हस्तांतरण.
    20. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए ET2 समाधान के 4 μl जोड़ें. 25 μl विंदुक सेट और धीरे से ऊपर और नीचे 10x पूरी मात्रा पिपेट और प्लेट सील.
      नोट: प्रक्रिया में इस बिंदु पर रोका जा सकता है और प्रतिक्रियाओं -15 डिग्री सेल्सियस पर अप करने के लिए 7 दिनों के लिए संग्रहीत. थाली जमे हुए है, तो पूरी तरह से 2 एन डी संकरण शुरू करने से पहले पिघलना.
  3. 2 एन डी संकरण
    1. 20 डिग्री सेल्सियस पर 280 XG पर 1 मिनट के लिए थाली अपकेंद्रित्र. चिपकने वाली फिल्म निकालें और पुस्तकालय के 25 μl को NCT1 के 50 μl, सीएसओ के 10 μl, और पीसीआर ग्रेड पानी के 15 μl जोड़ें. 100 μl विंदुक सेट और धीरे से ऊपर और नीचे 10x पूरी मात्रा पिपेट.
    2. 20 डिग्री सेल्सियस पर 280 XG पर 1 मिनट के लिए थाली और अपकेंद्रित्र सील.
    3. एक thermocycler में थाली (कवर 100 डिग्री सेल्सियस पर गरम किया जाता है) और रन कार्यक्रम 2 (1 टेबल) रखें.

5 gDNA संवर्धन: 2 दिन, दोपहर

  1. शुरू करने से पहले
    1. पिघलना ET1, ET2, किसी, WS1, WS2, WS3 और संकरण धोने के लिए आरटी पर HP3 समाधान. डीएनए संवर्धन किट से, पीसीआर प्रवर्धन के लिए बर्फ पर पीसीआर मास्टर मिश्रण युक्त पोलीमरेज़ (टीसी PMM), पीसीआर प्राइमर कॉकटेल (पीपीसी), और आरएसबी समाधान पिघलना.
  2. 2 एन डी संकरण धो
    1. 1 सेंट संकरण धो - 4.2 के लिए के रूप में बिल्कुल एक ही प्रोटोकॉल का पालन करें.
  3. पीसीआर प्रवर्धन
    1. एक नया 96 अच्छी तरह से थाली में कदम 5.2, टीसी PMM के 25 μl, और पीपीसी के 5 μl से क्षालन के 20 μl मिश्रण. 50 μl विंदुक सेट और धीरे से ऊपर और नीचे 10x पूरी मात्रा पिपेट. 20 डिग्री सेल्सियस पर 280 XG पर 1 मिनट के लिए थाली और अपकेंद्रित्र सील.
    2. एक thermocycler में थाली (कवर 100 डिग्री सेल्सियस पर गरम किया जाता है) और रन कार्यक्रम 3 (1 टेबल) रखें.

6 gDNA संवर्धन: 3 दिन

  1. शुरू करने से पहले
    1. बर्फ पर पिघलना आरएसबी समाधान. कम से कम 30 मिनट उपयोग करने से पहले, आरटी को शुद्धि चुंबकीय मोती ले आओ.
  2. पीसीआर शोधन
    1. 20 डिग्री सेल्सियस पर 280 XG पर 1 मिनट के लिए कदम 5.3 से थाली अपकेंद्रित्र, और चिपकने वाला कवर निकालें.
    2. आरटी पर, पी के 90 μl जोड़नेreviously अच्छी तरह से प्रत्येक में शुद्धि चुंबकीय मोती मिलाया. धीरे से ऊपर और नीचे 10x पूरी मात्रा पिपेट, 140 μl विंदुक सेट करें. आरटी पर 15 मिनट के लिए सेते हैं. आरटी पर 5 मिनट के लिए एक चुंबकीय स्टैंड पर 96 अच्छी तरह से थाली रखें. सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से स्पष्ट प्रतीत होता है कि यह सुनिश्चित करें.
    3. (2 नमूने के लिए 800 μl इथेनॉल के लिए आसुत जल के 200 μl जोड़ें) एक ताजा 80% इथेनॉल समाधान तैयार है. गोली परेशान नहीं सतह पर तैरनेवाला देखभाल त्यागें.
    4. चुंबकीय स्टैंड पर थाली रखते हुए, मोती परेशान बिना प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए हौसले से तैयार 80% इथेनॉल के 200 μl जोड़ने और आरटी पर 30 सेकंड के लिए थाली सेते हैं. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और इस धोने एक बार और दोहराने. इथेनॉल सुनिश्चित हटा दिया गया है. थाली चुंबकीय स्टैंड पर है, जबकि 15 मिनट के लिए या इथेनॉल का पूरा वाष्पीकरण तक आरटी पर शुष्क करते हैं.
    5. चुंबकीय स्टैंड से थाली निकालें और आरएसबी बफर के 30 μl जोड़ें. टी पिपेट धीरे 30 μl विंदुक सेट, औरवह पूरी मात्रा ऊपर और नीचे 10x. आरटी पर 2 मिनट के लिए थाली सेते हैं.
    6. चुंबकीय स्टैंड पर 96 अच्छी तरह से थाली प्लेस और 5 मिनट के लिए या सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से स्पष्ट प्रतीत होता है जब तक सेते हैं. धीरे से एक नया 96 अच्छी तरह से थाली (: Tcy थाली प्रकार) में सतह पर तैरनेवाला के 28 μl हस्तांतरण.
      नोट: प्रक्रिया इस स्तर पर रोका जा सकता है और प्रतिक्रियाओं को 7 दिनों के लिए -15 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत.
  3. लाइब्रेरी मान्यता और मात्रा का ठहराव
    1. एक टुकड़ा विश्लेषक का उपयोग करके पुस्तकालय की गुणवत्ता निर्धारित. उच्च संकल्प acrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन ऊपर उल्लेख किया चरणों की जगह इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन अनुशंसित नहीं है. टुकड़े 150 बीपी और 1,000 बीपी के बीच होना चाहिए.
      सिफारिश: नोट अनुक्रमण के दौरान समूहों के सर्वश्रेष्ठ संख्या प्राप्त करने के लिए qPCR द्वारा पुस्तकालय यों.
    2. एक संदर्भ के रूप में, एक मान्य पुस्तकालय (2 एनएम) का उपयोग करें. पहला पुस्तकालय तैयार किया जा रहा है, तो sequenc की जांच के लिए प्रदान की जाती फेज PhiX डीएनए (10 एनएम) का उपयोगडिवाइस आईएनजी.
    3. 20 में से 7 अंक प्राप्त करने के लिए सकारात्मक नियंत्रण के धारावाहिक dilutions तैयार 16, 8, 6, 4, 2, और EBT में 1 बजे (ईबी क्षालन बफर 0.1% बीच 20). 1/1000 और 1 / 2,000 पर ब्याज की पुस्तकालय पतला. प्रत्येक बिंदु तीन प्रतियों में विश्लेषण किया जाना चाहिए.
    4. , अच्छी तरह से 1 के लिए qPCR मास्टर मिश्रण (2x) युक्त SYBR ग्रीन के 10 μl, आगे प्राइमर का 0.2 μl (10 माइक्रोन, AATGATACGGCGACCACCGAGAT), रिवर्स प्राइमर का 0.2 μl जोड़ें: (प्रयुक्त कुओं की संख्या से गुणा संस्करणों) निम्नलिखित मिश्रण तैयार (10 माइक्रोन, CAAGCAGAAGACGGCATACGA), और 7.6 μl पीसीआर ग्रेड पानी.
    5. मिश्रण के बाद, सकारात्मक नियंत्रण और पुस्तकालय dilutions की हर अच्छी तरह से और 2 μl में, एक 96 अच्छी तरह से थाली में मिश्रण के 18 μl अपदस्थ. 20 डिग्री सेल्सियस पर 280 XG पर 1 मिनट के लिए थाली और अपकेंद्रित्र सील. फिर, एक मात्रात्मक पीसीआर thermocycler और रन प्रोग्राम 4 (1 टेबल) में प्लेट रखें.
    6. प्रत्येक एल की उपज प्राप्त करने के लिए पारंपरिक पूर्ण मात्रा का ठहराव के रूप में परिणाम का विश्लेषणibrary. qPCR का लाभ यह केवल प्रवाह सेल के साथ बातचीत करेंगे कि डीएनए quantifies है.
      नोट: कारण अभिकर्मकों में से एक में डीएनए अनुकरण करनेवाला अणुओं की उपस्थिति के डीएनए की fluorimetric मात्रा का ठहराव का प्रयोग न करें. इस मात्रा का ठहराव विधि पुस्तकालय उपज overestimate और फलस्वरूप क्लस्टरिंग स्कोर को नजरअंदाज करेंगे.
  4. अनुक्रमण शुभारंभ
    1. क्षालन बफर (ईबी) की 30 μl के अंतिम मात्रा में 4 एनएम पर प्रत्येक पुस्तकालय पतला, और सभी पुस्तकालयों पूल और अच्छी तरह मिलाएं.
    2. ईबी बफर में एक ताजा 0.2 एन NaOH समाधान तैयार और जमा पुस्तकालयों के 10 μl के साथ इस NaOH के समाधान के 10 μl मिश्रण. अच्छी तरह मिक्स और आरटी पर ठीक 5 मिनट सेते हैं.
    3. 5 मिनट के बाद, तुरंत (अनुक्रमण कारतूस से) संकरण बफर के 980 μl जोड़ने के लिए और अच्छी तरह से मिश्रण. फिर, संकरण बफर के 600 μl के साथ इस मिश्रण के 400 μl मिश्रण. अच्छी तरह मिक्स और 8 का एक इंजेक्शन के लिए एक 300 चक्र कारतूस (2 X 150) में 600 μl हस्तांतरणबजे. लॉन्च अनुक्रमण.

7 डेटा विश्लेषण

  1. डिवाइस डेटा संसाधित किया गया है एक बार, एक नए कंप्यूटर के लिए .bam और .vcf फ़ाइलों को हस्तांतरण.
    नोट: Transposase विखंडन पैरों के निशान को शामिल किया गया. नतीजतन, सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से इन आंकड़ों trims.
  2. डिवाइस विश्लेषण के साथ प्राप्त आनुवंशिक विविधताओं लीजिए.
  3. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए एक और सॉफ्टवेयर (Alamut) के साथ निर्यात फ़ाइलें (.bam, .vcf) का विश्लेषण. फिर, दोनों विश्लेषण के साथ प्राप्त आनुवंशिक विविधताओं की तुलना करें. केवल विविधताओं दो बार उपस्थित माना जाता है का पता चला.

तालिका 1 पीसीआर की स्थिति

कार्यक्रम तापमान समय अंक. दोहराता की
1 72 डिग्री सेल्सियस 3 मिनट 1 98 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड 1
98 डिग्री सेल्सियस 10 सेकंड 10
60 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
72 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
72 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट 1
10 डिग्री सेल्सियस असीमित
2 95 डिग्री सेल्सियस 10 मिनट 1
93 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट 1
91 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट 1
89 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट 1
87 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट 1
85 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट 1
83 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट 1
81 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट 1
79 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट 1
77 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट 1
75 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट 1
71 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट 1
69 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट 1
67 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट 1
65 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट 1
63 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट 1
61 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट 1
59 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट 1
58 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट 16-18 घंटा
3 98 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड 1
98 डिग्री सेल्सियस 10 सेकंड 10
60 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
72 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
72 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट 1
10 डिग्री सेल्सियस असीमित
4 95 डिग्री सेल्सियस 10 मिनट 1
95 डिग्री सेल्सियस 15 सेकंड 40
60 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट

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Representative Results

उदाहरणार्थ क्यूसी परिणाम

लक्ष्य जीन के दृश्यों का निर्धारण करने के लिए इस पद्धति की क्षमता gDNA (2A चित्रा) की गुणवत्ता और tagmentation कदम की गुणवत्ता पर आधारित है. Tagmentation (चित्रा 2B, ऊपरी पैनल) पर्याप्त नहीं है, तो अनुक्रमण संतोषजनक नहीं होगा. जैसा कि ऊपर कहा, tagmentation शुद्धि के बाद, gDNA 300 बी.पी. आसपास टुकड़े के बहुमत (चित्रा 2B, कम पैनल) के साथ 1,000 बीपी को 150 बीपी से टुकड़ों में tagmented किया जाना चाहिए.

पुस्तकालय तैयारी के अंत में, पुस्तकालय गुणवत्ता एक Bioanalyser का उपयोग करके जाँच की है. प्राप्त प्रोफाइल tagmentation के बाद के रूप में लेकिन टुकड़े के एक उच्च संख्या (चित्रा -2) के साथ लगभग एक ही होना चाहिए. पुस्तकालय गुणवत्ता -1 सी चित्रा के समान नहीं है, तो अनुक्रमण नहीं किया जाना चाहिए.

अनुक्रमण पर शुरू हो जाने के बादअनुक्रमण डिवाइस, क्लस्टरिंग स्कोर 9 चक्रों के बाद उपलब्ध है और 800,000 और 1,100,000 समूहों / मिमी ² (चित्रा 3) के बीच होना चाहिए. इस संख्या कम है, तो अनुक्रमण विशेष रूप से पढ़ने की गहराई में, संतोषजनक नहीं होगा. यह अधिक है, छवियों (3B चित्रा) धुंधला हो जाएगा, और कोई विश्लेषण के कारण समूहों को अलग करने के लिए असंभव को किया जाएगा.

चलाने के अंत में, यह गुणवत्ता स्कोर की जाँच करने के लिए महत्वपूर्ण है. ऊपर विस्तृत प्रोटोकॉल का अनुसरण करके रन की गुणवत्ता स्कोर 4 चित्रा के अनुरूप होगा. अनुक्रमण की गुणवत्ता एक क्यू स्कोर (क्यू 30) का प्रतिनिधित्व करती है. बेहतर या 30 के बराबर एक क्यू स्कोर होना चाहिए, दृश्यों (क्लस्टर) के कम से कम 75% के आसपास प्रयोग मान्य करने के लिए.

अनुक्रमण परिणाम

इस प्रयोग संवैधानिक आनुवंशिक असामान्यताएं अध्ययन करने के लिए डिजाइन किया गया था. इस मामले में, आनुवंशिक विषमता पीआर हैजीनोम में 50% से कम esent. इस वजह से, अनुक्रमण गहराई बहुत महत्वपूर्ण नहीं है. इस के साथ साथ, हम तैयार है और 11 पूर्ण जीनों के लिए एक साथ 12 रोगियों के 2 पुस्तकालयों अनुक्रम. उच्च अनुक्रमण गहराई प्राप्त करने के लिए, मल्टिप्लेक्स रोगियों की संख्या में कमी किया जाना है. GDNA संवर्धन जांच से पकड़ने पर आधारित है, संवर्धन सजातीय (चित्रा 5) नहीं है. हमारे प्रोटोकॉल के साथ, हम के बारे में 6 जीबी का 150 का एक मतलब कवरेज उत्प्रेरण, पढ़ता 20 की एक न्यूनतम और 330 पढ़ता की एक अधिकतम के साथ, प्रत्येक बेस के लिए पढ़ता उत्पन्न. इन पढ़ें गहराई नैदानिक ​​अभ्यास 11 में NGS के उपयोग के अनुरूप हैं. शायद कब्जा द्वारा gDNA संवर्धन के कारण, और जीन का नहीं प्रमुख पुनर्व्यवस्था पढ़ें गहराई, की विविधता के बावजूद, यह इस प्रकार अनुक्रमण मान्य, क्यू स्कोर 30 को हमेशा (चित्रा 5) से बेहतर था कि नोट करना महत्वपूर्ण है.

फिर भी, यह परिणाम की तुलना द्वारा प्रौद्योगिकी मान्य करने के लिए महत्वपूर्ण हैसेंगर अनुक्रमण साथ प्राप्त उन लोगों के साथ प्राप्त की है. दोनों सेंगर अनुक्रमण द्वारा अनुक्रम 17 रोगियों में और Transposase आधारित प्रौद्योगिकी (बीआरसीए 1 और बीआरसीए 2 के दृश्यों कोडिंग), हम एक ही 330 आनुवांशिक विविधताओं (SNP और म्यूटेशन) का पता चला. एक उदाहरण के रूप में, बीआरसीए 1 जीन में एक बिंदु उत्परिवर्तन (बाएं चित्रा 6) और बीआरसीए 2 जीन में 4 कुर्सियां ​​(सही चित्रा 6) की एक विलोपन सेंगर और Transposase आधारित विधियों दोनों ने पता लगाया गया. बीआरसीए 1 क्रोमोजोम 13 के रिवर्स किनारा पर है, यह है कि यह (आगे किनारा पर) बीआरसीए 2 के लिए, प्राप्त अनुक्रम पूरित होने की जरूरत नहीं है, जबकि अनुक्रम प्राप्त पूरक (लेकिन पलटना नहीं) के लिए आवश्यक है कि नोट करना महत्वपूर्ण है . चित्रा 5 में संकेत सेंगर विधि नहीं करता है, जबकि NGS प्रौद्योगिकी, आनुवंशिक परिवर्तन की अनुमानित आवृत्ति देता है. इसके अलावा, विशेष रूप से INDEL विविधताओं के लिए, व्याख्या एनजी के साथ आसान हैएस प्रौद्योगिकी. चित्रा 6 में दिखाया गया है, सही INDEL भिन्नता दृश्यों आगे की जरूरत है और डाला या नष्ट कर दिया अनुक्रम समझने के लिए अनुक्रमण रिवर्स कि एक तले electropherogram के रूप में दिखाई देते हैं. NGS विश्लेषण के साथ, डाला या नष्ट कर दिया अनुक्रम सीधे इस प्रकार अशुद्ध अर्थ के जोखिम को कम करने, निर्धारित किया जाता है. अंत में, Transposase आधारित प्रौद्योगिकी लक्ष्य जीन की एक बड़ी संख्या का विश्लेषण करने की अनुमति दी, और हम सेंगर अनुक्रमण द्वारा कवर नहीं किए गए कई नए आनुवंशिक परिवर्तन दृश्यों पाया. इन परिणामों के अन्यत्र प्रकाशित किया जाएगा.

चित्रा 1
चित्रा 1 प्रक्रिया के योजनाबद्ध कार्यप्रवाह. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.


चित्रा 2 गुणवत्ता नियंत्रण से पहले और पुस्तकालय तैयारी के बाद. सुरक्षित tagmentation के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि gDNA की ए Spectrophotometric प्रोफ़ाइल. डीएनए उपज अधिक से अधिक 5 एनजी / μl, 260/280 और 260/230 अनुपात क्रमश: 1.8 और 2 से बेहतर होना चाहिए होना चाहिए. Tagmented gDNA के बी टुकड़ा विश्लेषक प्रोफाइल. ऊपरी पैनल अपर्याप्त gDNA tagmented का प्रतिनिधित्व करता है. निचले पैनल एक पूरी तरह से tagmented नमूना दिखाता है. तैयार पुस्तकालय के सी टुकड़ा विश्लेषक प्रोफाइल सिर्फ अनुक्रमण शुरू करने से पहले. टुकड़ा आकार tagmented gDNA (बी, कम पैनल) के रूप में, लेकिन एक प्रवर्धित राशि के साथ एक ही है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

> चित्रा 3
चित्रा 3 जाँच क्लस्टर पीढ़ी. चलाने के दौरान अनुक्रमण डिवाइस का ए स्क्रीनशॉट. कश्मीर / मिमी ². बी अलग छवियों कम घनत्व (ऊपरी पैनल), उच्च घनत्व (कम पैनल) और सही घनत्व (मध्यम पैनल). के अनुरूप 800 और 1000 के बीच क्लस्टर घनत्व होना चाहिए यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4
चित्रा 4 क्यू स्कोर जाँच हो रही है. चलाने के अंत में, मान्य अनुक्रमण 30 से बेहतर एक क्यू स्कोर के साथ उत्पन्न समूहों की कम से कम 75% होना चाहिए.तस्वीरें "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
चित्रा 5 का प्रतिनिधित्व कवरेज डेटा और उनके इसी क्यू स्कोर. पढ़ें गहराई सभी कवर जीन साथ विषम है. फिर भी, कवर क्षेत्रों की क्यू स्कोर क्यू 30 के लिए हमेशा बेहतर है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 6
सेंगर अनुक्रमण साथ और Transposase आधारित तकनीक के साथ प्राप्त चित्रा 6 प्रतिनिधि परिणाम. सेंगर अनुक्रमण के साथ मनाया सभी आनुवंशिक विविधताओं घ गयाTransposase आधारित तकनीक के साथ etected. बिंदु उत्परिवर्तन की व्याख्या करने के लिए आसान कर रहे हैं जबकि, INDEL परिवर्तन कभी कभी सेंगर विधि के साथ अध्ययन करने के लिए काफी मुश्किल हो जाता है. एक मध्यम throughput डिवाइस के साथ जुड़े Transposase आधारित तकनीक के साथ, INDEL परिवर्तन की खोज करने के लिए सरल कर रहे हैं. फिर भी, यह लक्ष्य जीन शून्य से किनारा (यहां बीआरसीए 1 जीन) पर स्थित है जब यह दृश्यों प्राप्त पूरक (लेकिन पलटना नहीं) के लिए आवश्यक है कि नोट करना महत्वपूर्ण है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

NGS उपकरणों और प्रौद्योगिकियों के व्यापक उपयोग के कैंसर और आनुवंशिक विकारों के अध्ययन में नए अवसर प्रदान किया है. पूरे जीनोम अनुक्रमण या शाही सेना अनुक्रमण के अलावा, कई रोगियों में चयनित gDNA दृश्यों की एक बड़ी राशि का विश्लेषण एक साथ निदान में महान संभावनाओं प्रदान करता है. यहाँ, हम एक मध्यम throughput अनुक्रमण डिवाइस (सामग्री / उपकरण की तालिका) के साथ एक साथ 24 रोगियों में से 11 पूर्ण जीन का अध्ययन करने के Nextera प्रौद्योगिकी का उपयोग (मांग पर उपलब्ध है) एक विशिष्ट डिजाइन विकसित की है. इस प्रोटोकॉल त्रुटि के एक कम जोखिम के साथ रोगियों की चिंताओं को एक तेजी से प्रतिक्रिया के लिए सक्षम बनाता है कि डेटा के त्वरित पीढ़ी की अनुमति देता है. चित्रा 6 में सचित्र के रूप में, सेंगर अनुक्रमण के साथ पकड़ा सभी आनुवंशिक विविधताओं भी Transposase आधारित तैयारी किट का उपयोग कर पाया गया. इस विधि विशेष रूप से सीधे विश्लेषण कर रहे हैं कि परिसर INDEL परिवर्तन के लिए, विश्वसनीय और व्याख्या करने के लिए आसान है. फिर भी, यह महत्वपूर्ण हैशून्य से कतरा में स्थित जीन के लिए, यह न्यूक्लियोटाइड (पीछे) के बिना पूरक करने के लिए आवश्यक है कि ध्यान दें. वर्तमान कार्य 11 पूर्ण जीनों के विश्लेषण के लिए एक डिजाइन के साथ किया जाता है, लेकिन प्रोटोकॉल डिजाइन चुना जो कुछ भी एक ही है. Transposase आधारित प्रौद्योगिकी भी लंबी दूरी की पीसीआर उत्पादों 12 से लाइब्रेरी तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. दरअसल, (निर्माता द्वारा विकसित) एल्गोरिथ्म डिजाइन के लिए इस्तेमाल विशेष रूप से इस प्रोटोकॉल के लिए समर्पित है (निर्माता वेबसाइट उपकरण, सामग्री / उपकरण की तालिका देखें). के अलावा प्रौद्योगिकी Transposase आधारित भी उपलब्ध हैं, पुस्तकालय तैयारी से पहले डीएनए विखंडन के दो अन्य तंत्र: मैकेनिकल विखंडन और एंजाइमी विखंडन. मैकेनिकल डीएनए विखंडन प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है लेकिन एक ultrasonicator जरूरत है, और पुस्तकालय तैयारी अधिक महंगा है और अधिक समय लगता है. Enzymatic डीएनए विखंडन अक्सर जिसके परिणामस्वरूप के कारण प्रतिबंध एंजाइम साइट स्थानों के लिए डीएनए को पकड़ने के लिए समस्याओं लातीलक्ष्य अनुक्रम कवरेज की कमी में. फिर भी, डीएनए विखंडन के लिए प्रत्येक रणनीति फायदे और नुकसान है, लेकिन कम से कम लंबी दूरी पीसीआर उत्पाद विखंडन 13 के लिए काफी समान परिणाम देने लगता है. एक नए एंजाइम कॉकटेल का उपयोग यांत्रिक डीएनए विखंडन 14 से प्राप्त उन लोगों के रूप में एक ही परिणाम प्रदान करने के लिए लग रहा था. Transposase प्रौद्योगिकी आधारित उच्च गुणवत्ता डीएनए (FFPE ऊतकों से निकाली डीएनए के लिए लागू नहीं है) की जरूरत है. इसके अलावा, Transposase की गतिविधि ब्याज के टुकड़े इस लंबाई से अधिक समय होना चाहिए, सुझाव है कि 300 से अधिक बीपी के टुकड़े की जरूरत है. इस विशिष्टता उच्च गुणवत्ता, संयुक्त राष्ट्र के खंडित डीएनए की जरूरत बताते हैं.

अब तक, बीआरसीए 1 और बीआरसीए 2 के आनुवंशिक विविधताओं पारिवारिक स्तन और डिम्बग्रंथि के कैंसर में अध्ययन किया गया है. हालांकि, BRCA जीन, और विशेष रूप से बीआरसीए 2 की भागीदारी, अब विशेष रूप से अग्न्याशय 15, प्रोस्टेट में, अन्य कैंसर में संदेह है16, और वृषण कैंसर 17. PALB2, BRCA जीनों के एक साथी की आनुवंशिक परिवर्तन भी अग्नाशय के कैंसर के 18 के साथ जुड़ा हुआ है. इसके अलावा, यह हाल ही में रोगियों BRCA उत्परिवर्तन शरण, और एक हद तक कम PALB2 म्यूटेशन के लिए, PARP inhibitors 19 तक उनके अग्नाशय के कैंसर का एक बेहतर प्रतिक्रिया से पता चला है कि दिखाई दिया. बीआरसीए 1, बीआरसीए 2, और PALB2 कैंसर के एक पारिवारिक जोखिम के साथ जुड़ा हुआ है, और संभवतः विशिष्ट उपचार के लिए संवेदनशीलता के साथ जुड़े रहे हैं, यह पारिवारिक कैंसर के खतरे के लिए और कैंसर के इलाज प्रतिक्रिया के लिए स्क्रीनिंग में स्क्रीनिंग में बीआरसीए 1 और बीआरसीए 2 पार्टनर्स पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण प्रतीत होता है.

इन आंकड़ों से, डीएनए को तोड़ने की मरम्मत से संबंधित जीन का विश्लेषण संवेदनशीलता की जांच के लिए लेकिन यह भी उपचार प्रतिक्रिया का एक ख्यात सूचक के लिए ही महत्वपूर्ण नहीं हो रहा है. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल के साथ प्रस्तावित संपूर्ण जीन विश्लेषण cov सकताऐसे प्रमोटर में उत्परिवर्तन, splicing साइटों या introns में स्थित विनियामक splicing साइटों के रूप में जन्मजात वर्तमान (और कैंसर की कोशिकाओं में मौजूद) हो सकता है कि एर सभी परिवर्तन,. तिथि करने के लिए, जीन के दृश्यों गैर कोडन में परिवर्तन गहराई से अध्ययन नहीं किया गया है, लेकिन जीनोम चौड़ा एसोसिएशन अध्ययन के विकास के इन दृश्यों के महत्वपूर्ण कार्यों को उजागर कर सकता है.

अंत में, इस पत्र में विकसित Transposase आधारित डिजाइन डीएनए क्षति की मरम्मत में शामिल कैंसर का खतरा जीन में आनुवंशिक असामान्यताएं का पता लगाने के लिए एक दिलचस्प तरीका है. 24 रोगियों के लिए 11 पूर्ण जीन अनुक्रम संभावना एक साथ जांच के लिए काफी कठिन तकनीक है जो सेंगर अनुक्रमण विधि, के साथ तुलना में एक महत्वपूर्ण लाभ है.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
MiSeq Illumina SY-410-1001 Sequencing/medium throughput device
Nextera Enrichment kit Illumina FC-123-1208 Transposase based technology
300 cycle cartridge Illumina 15033624
AMPure beads Beckman Coulter A63881 Magnetic purification beads
Magnetic stand Alpaqua A32782
96-well Plates Life Technologies 4306737
MIDI 96-well plates Biorad AB0859
Microseal A Biorad MSA-5001 This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment
MiSeq Illumina Provided with the sequencing device
Experiment Manager software
Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new
Manufacturer website tool

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References

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जेनेटिक्स अंक 92 gDNA संवर्धन Nextera NGS डीएनए की क्षति बीआरसीए 1 बीआरसीए 2
के पूरे दृश्य की NGS विश्लेषण के लिए एक Transposase आधारित प्रौद्योगिकी द्वारा gDNA संवर्धन<em&gt; बीआरसीए 1</em&gt;,<em&gt; बीआरसीए 2</emडीएनए क्षति की मरम्मत में शामिल&gt;, और 9 जीन
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Chevrier, S., Boidot, R. gDNA… More

Chevrier, S., Boidot, R. gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair. J. Vis. Exp. (92), e51902, doi:10.3791/51902 (2014).

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