Abstract
Het wijdverbreide gebruik van Next Generation Sequencing heeft opengesteld nieuwe mogelijkheden voor onderzoek naar kanker en de diagnose. NGS zal enorme hoeveelheden nieuwe gegevens over kanker, en in het bijzonder de genetica van kanker te brengen. De huidige kennis en toekomstige ontdekkingen maken het noodzakelijk om een groot aantal genen die betrokken kunnen zijn bij een genetische aanleg voor kanker te bestuderen. In dit opzicht hebben we een Nextera ontwerp om 11 volledige genen betrokken bij DNA schade herstel bestuderen. Dit protocol is ontwikkeld om veilig te studeren 11 genen (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80 en TP53) van promotor tot 3'-UTR bij 24 patiënten tegelijk. Dit protocol, gebaseerd op transposasegen technologie en gDNA verrijking, geeft een groot voordeel in termen van tijd voor de genetische diagnose dankzij multiplexing proeven. Dit protocol kan veilig gebruikt worden met bloed gDNA.
Introduction
In 2010, bijna 1,5 miljoen mensen (voornamelijk vrouwen) ontwikkelden borstkanker wereldwijd. Er wordt geschat dat 5 tot 10% van deze gevallen waren erfelijk. Bijna 20 jaar geleden, BRCA1 en BRCA2 zijn geïdentificeerd als die betrokken zijn bij erfelijke borst-en eierstokkanker 1. Sinds ongeveer 15 jaar geleden, BRCA1 en BRCA2 coderende gebieden werden gesequenced om de genetische aanleg voor borstkanker en eierstokkanker bepalen. Veranderingen in BRCA1 en BRCA2 zijn gedetecteerd in 10 tot 20% van de geselecteerde families 2 suggereert dat de analyse van deze gebieden niet voldoende voor doeltreffende screening. Onlangs heeft de analyse van niet-coderende sequenties (promoter, introns, 3-'UTR) van BRCA1 en BRCA2 benadrukt dat nieuwe mutaties / varianten kunnen worden gekoppeld aan een hoger risico op borstkanker 3-6.
BRCA1 en BRCA2 eiwitten zijn betrokken bij homologe recombinatie Repair (HHR), dat wordt aangevuld met verschillende partners 7. Terwijl veranderingen in BRCA1 of BRCA2 induceren defecten in DNA herstel, kan de andere partners ook invloed op het risico op borstkanker. Deze hypothese lijkt te zijn gevalideerd sinds BRIP1 8 en 9 PALB2 hebben een bewezen effect op baarmoederhalskanker, borstkanker, respectievelijk. Daarnaast zijn twee andere "matig risico" borstkanker gevoelige genen, ATM en CHEK2, kan ook worden routinematig 10 bestudeerd.
In het verlengde van deze studies, hebben we besloten om een protocol tot 11 genen (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80 en TP53) bij 24 patiënten te analyseren ontwikkelen tegelijk met behulp van een zeer eenvoudig en relatief snelle protocol gebaseerd op transposasegen technologie, met verrijking en sequencing op een middelgrote doorvoer apparaat. Thanksdeze techniek we de sequentie volledige genen van het begin van de promoter tot eind 3'-UTR, behalve RAP80, waarvoor een intronische gebied van 2500 bp werd niet onder (CHR5: 176,381,588-176,390,180). Dit komt neer op een totaal van ongeveer 1.000.300 bp studeerde bij 2.734 sondes. Gewoonlijk worden BRCA1 en BRCA2 exon sequenties geanalyseerd door Sanger sequentiebepaling, die 1,5 maand nodig voor minder dan 20 patiënten. Met de onderhavige protocol (figuur 1), in dezelfde tijd, 11 volledige genen voor meer dan 75 patiënten konden worden geanalyseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Beoordeling van gDNA (genomisch DNA) Opbrengst
- Kwantificeren vers gewonnen gDNA vóór de bereiding van de bibliotheek. Gebruik de fluorometrische opbrengst beoordelingsmethode om intact gDNA kwantificeren (vermijd het gebruik van een spectrofotometer voor gDNA opbrengst assessment). Meet de (260/280 nm) ratio en ervoor zorgen dat het is tussen de 1,8 en 2 NB: 50 ng gDNA nodig zijn voor het experiment.
2 gDNA Verrijking: Dag 1, Morning
- Voordat u begint
- Van de DNA verrijking kit (zie tabel van materialen / apparatuur), dooi DNA buffer (TD) en DNA-enzym (TDE1) oplossingen op het ijs. Ten minste 30 minuten vóór gebruik, breng zuivering magnetische korrels en stop doel (ST) buffer op kamertemperatuur (RT). Voeg 20 ul van gDNA monster bij 2-2,5 ng / ul direct in een 96-wells plaat, 1 putje per monster. BELANGRIJK: Gebruik een positieve controle aan het protocol (monster met bekende sequentievariatie) valideren.
- Tagmentation
- Mix alle reagentia grondig door het omkeren van 5x, en kort spin down. At RT, voeg 25 pl TD buffer aan elk putje met 50 ng (20 pl) van gDNA, en 5 ui TDE1 buffer. Stel pipet tot 50 pi, zachtjes pipet het gehele volume omhoog en omlaag 10x.
- Bedek de plaat met een kleeffolie en centrifugeer gedurende 1 min bij 280 xg bij 20 ° C. Vervolgens plaatst u de plaat in een thermocycler (cover op 100 ° C verwarmd) en voer het volgende programma: 55 ° C gedurende 5 minuten en 10 ° C voor onbepaalde tijd.
- Tijdens deze incubatie bereiden monstervel met Experiment Manager software om de indexen die gebruikt worden gedefinieerd.
- Tagmentation Zuivering
OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang. Wees erg voorzichtig.- Controleren op de afwezigheid van neerslag in de zuivering magnetische bolletjes en ST-buffer. Als precipitaten aanwezig zijn, warmen oplossingen in de handen. Dooi hersuspensiebuffer (RSB) op ijs.
- At RT, vortex ST-oplossing en voeg15 pi aan elk putje met monster. Stel pipet tot 65 pi, zachtjes pipet het gehele volume omhoog en omlaag 10x. Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur. Bedek de plaat en centrifugeer gedurende 1 min bij 280 xg bij 20 ° C.
- Voeg 52 ul van eerder gemengde zuivering magnetische korrels in elk putje. Stel pipet tot 117 ul, zachtjes pipet het gehele volume omhoog en omlaag 10x. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Bedek de plaat en centrifugeer gedurende 1 min bij 280 xg bij 20 ° C.
- Verwijder het zelfklevende folie. Plaats de plaat met 96 putjes op een magnetische standaard voor 2 minuten bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de bovenstaande blijkt helemaal duidelijk.
- Bereid een verse 80% ethanol (24 monsters, voeg 2 ml gedestilleerd water 8 ml ethanol). Verwijder het supernatant zorg gooi niet aan de korrels storen.
- Terwijl de plaat op de magnetische standaard, voeg 200 pl vers bereide 80% ethanol aan elke well zonder de kralen en incubeer de plaat gedurende tenminste 30 secbij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en herhaal deze wasbeurt een tweede keer. Zorg ervoor dat de ethanol is verwijderd. Laten drogen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten of totdat volledige verdamping van ethanol.
- Verwijder de plaat uit de magnetische stand en voeg 22,5 ul van RSB buffer. Zet de pipet tot 22,5 ul, zachtjes pipet het gehele volume omhoog en omlaag 10x. Plaats de 96-well plaat op de magnetische standaard en incubeer gedurende 2 minuten. Zorg ervoor dat de bovenstaande blijkt helemaal duidelijk. Zacht overdracht 20 ul van de supernatant in een nieuwe 96-well plaat.
OPMERKING: Eventueel bepalen de grootte van de tagmented monsters met een fragment analysator. In plaats van de bovenstaande stappen, gebruik van hoge-resolutie acrylamide gelelektroforese. Fragmenten moet tussen 150 bp en 1000 bp.
- 1 st PCR Amplification
- Dooi PCR master mix met polymerase (LP-PMM), Index 1 primer, en Index 2 primeroplossingen op ijs. Overeenkomen met de combinatie of indexen met het Experiment Manager staalkaart. Voor multiplexing, bereiden verschillende i7 uit de index 1 (i7, N7xx) voor elk monster.
- In elk putje, voeg 20 ul van LP-PMM, 5 pl Index 1, en 5 ul van index 2 Stel de pipet tot 50 pi, zachtjes pipet het gehele volume omhoog en omlaag 10x. Bedek de plaat met een zelfklevende microseal film. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 280 x g bij 20 ° C.
- Plaats de plaat in een thermocycler (cover op 100 ° C verwarmd) en run programma 1 (Tabel 1).
OPMERKING: de procedure kan worden gestopt bij dit punt en de reactie gedurende de nacht opgeslagen in de thermocycler of 2 dagen tussen 2 en 8 ° C.
3 gDNA Verrijking: Dag 1, Middag
- Voordat u begint
- Dooi oligo (CSO), capture doel buffer 1 (NCT1), en RSB oplossingen op ijs. Ten minste 30 minuten vóór gebruik, breng zuivering magnetische korrels tot kamertemperatuur.
- PCR Purification
- Centrifugeer de plaat uit stap 2.4, gedurende 1 min bij 280 xg bij 20 ° C.
- At RT, voeg 45 ul van gemengde zuivering magnetische korrels in elk putje. Zet de pipet tot 95 pi, zachtjes pipet het gehele volume omhoog en omlaag 10x. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Plaats de plaat met 96 putjes op een magnetische standaard voor 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Zorg ervoor dat de bovenstaande blijkt helemaal duidelijk. Bereid een verse 80% ethanol (24 monsters, voeg 2 ml gedestilleerd water 8 ml ethanol). Verwijder het supernatant en let erop dat de pellet te verstoren.
- Terwijl de plaat op de magnetische standaard, voeg 200 pl vers bereide 80% ethanol aan elke well zonder de kralen en incubeer de plaat gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en herhaal deze wasbeurt een tweede keer. Zorg ervoor dat de ethanol is verwijderd. Laten drogen bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
- Verwijder de plaat uit de magnetische stand en voeg 40 ul van RSB buffer. Zet de buistte tot 40 pi, zachtjes pipet het gehele volume omhoog en omlaag 10x.
- Plaats de 96-well plaat op de magnetische standaard en incubeer gedurende 2 minuten. De bovenstaande vloeistof moet volkomen helder worden weergegeven. Zacht overdracht 38 ul van de supernatant in een nieuwe 96-well plaat.
- Bepaal de opbrengst van elk monster door een fluorimetrische methode. Het eerste deel van het protocol wordt gevalideerd als de beoordeelde opbrengsten tussen 30 en 50 ng / ul.
- 1 st Hybridisatie
- Zwembad maximaal 12 monsters per pool in dit stadium door mengen 500 ng van elk monster in een nieuwe 96-well plaat. Zorg ervoor dat het uiteindelijke volume van elke pool niet meer dan 40 pl.
OPMERKING: Indien nodig, verminderen de hoeveelheid pools met een vacuümconcentrator apparaat bij kamertemperatuur (Let op: de concentratie van DNA kan door verwarmen worden gewijzigd, zelfs bij 30 ° C voor verwarming veroorzaakt DNA degradatie). Stel het uiteindelijke volume op 40 ui door toevoegen RSB oplossing. - Meng grondig deNCT1 oplossing. Voor elk putje 40 pl van gepoolde DNA monsters, voeg 50 ui NCT1 en 10 pl CSO. Zet de pipet tot 100 ul, zachtjes pipet het gehele volume omhoog en omlaag 10x. Sluit de plaat en centrifugeer gedurende 1 min bij 280 xg bij 20 ° C.
- Plaats de plaat in een thermocycler (cover op 100 ° C verwarmd) en run programma 2 (Tabel 1).
- Zwembad maximaal 12 monsters per pool in dit stadium door mengen 500 ng van elk monster in een nieuwe 96-well plaat. Zorg ervoor dat het uiteindelijke volume van elke pool niet meer dan 40 pl.
4 gDNA Verrijking: Dag 2, Morning
- Voordat u begint
- Van de DNA verrijking kit (zie tabel van materialen / apparatuur) dooi 2 N NaOH (HP3), doel elutiebuffer 1 (ET1), richten elutiebuffer 1 ET2, streptavidine- magnetische kralen (SMB), was-oplossing 1 (WS1), wassen Oplossing 2 (WS2), wasoplossing 3 (WS3), CSO en NCT1 oplossingen bij kamertemperatuur.
- 1 st Hybridisatie Wash
- Verwijder de 96-well plaat uit de thermocycler en centrifugeer 1 min bij 280 xg bij 20 ° C. Verwijder de lijm deksel zeer carefully.
- Breng 100 pi reactiemengsel van de plaat in nieuw MIDI 96-well plaat en voeg 250 ul goed gevortext SMB oplossing. Zet de pipet tot 350 ul, zachtjes pipet het gehele volume omhoog en omlaag 10x. Sluit de plaat en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 280 x g bij 20 ° C, verwijder de kleefband en plaats de plaat op de magnetische standaard gedurende 2 minuten. Zorg ervoor dat de bovenstaande blijkt helemaal duidelijk. Verwijder het supernatant en verwijder de plaat uit de magnetische stand.
- Voeg 200 ul van goed gemengd WS1 oplossing in het putje met kralen. Zet de pipet om 200 ul en voorzichtig pipet het gehele volume omhoog en omlaag 15x het vermijden van de vorming van luchtbellen / schuim.
- Plaats de plaat op de magnetische standaard gedurende 2 minuten. Zorg ervoor dat de bovenstaande blijkt helemaal duidelijk. Verwijder het supernatant en verwijder de plaat uit de magnetische stand.
- Voeg 200 ul van goed gemengd WS2 oplossing in putten containing kralen. Zet de pipet om 200 ul en voorzichtig pipet het volledige volume op en neer 15x vorming van luchtbellen / schuim te vermijden.
- Plaats de plaat op de magnetische standaard gedurende 2 minuten. Zorg ervoor dat de bovenstaande blijkt helemaal duidelijk. Verwijder het supernatant en verwijder de plaat uit de magnetische stand.
- Voeg 200 ul van goed gemengd WS2 oplossing in putjes bevattende korrels. Zet de pipet om 200 ul en voorzichtig pipet het gehele volume omhoog en omlaag 15x.
- Breng het gehele volume in een nieuwe 96-well plaat. Sluit de plaat en plaats de plaat in een thermocycler (cover bij 100 ° C verhit). Start de thermocycler bij 42 ° C gedurende 30 minuten.
- Imediately Plaats de plaat op de magnetische standaard gedurende 2 minuten. Zorg ervoor dat de bovenstaande blijkt helemaal duidelijk. Verwijder de afdichting en onmiddellijk de bovenstaande vloeistof. Verwijder vervolgens de plaat uit de magnetische stand.
- Voeg 200 ul van WS2 in putten die kralen bevatten. Zet de pipet tot 200pl en voorzichtig pipet het gehele volume omhoog en omlaag 15x maar voorkom dat luchtbellen / schuim. Sluit de plaat en plaats de plaat in een thermocycler (cover bij 100 ° C verhit). Start de thermocycler bij 42 ° C gedurende 30 minuten.
- Doe de plaat onmiddellijk op de magnetische standaard voor 2 minuten. Zorg ervoor dat de bovenstaande blijkt helemaal duidelijk. Verwijder de afdichting en onmiddellijk de bovenstaande vloeistof. Verwijder vervolgens de plaat uit de magnetische stand.
- Voeg 200 ul van goed gemengd WS3 oplossing in putjes bevattende korrels. Zet de pipet om 200 ul en voorzichtig pipet het gehele volume omhoog en omlaag 15x.
- Plaats de plaat op de magnetische standaard gedurende 2 minuten. Zorg ervoor dat de bovenstaande blijkt helemaal duidelijk. Gooi al het bovenstaande en verwijder de plaat uit de magnetische stand.
- Herhaal de WS3 wassen een tweede keer.
- Na het verwijderen van supernatant, sluit de plaat en kort centrifuge om pull-down resterende supernatant. Plaats de plaat opde magnetische staan gedurende 2 minuten. Gooi de resterende supernatant.
- In een 0,2 ml buis, meng 28.5 gl ET1 en 1,5 pl HP3 oplossingen. Deze mix is voor 1 pool, als er meer zwembaden zijn voorbereid, vermenigvuldig deze volumes door het aantal zwembaden opgesteld.
- Verwijder de plaat uit de magnetische stand. Voeg 23 gl van de boven bereide mengsel. Zet de pipet tot 23 pi en voorzichtig pipet het gehele volume omhoog en omlaag 15x. Sluit de plaat en laat gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 280 x g bij 20 ° C.
- Plaats de plaat op de magnetische standaard gedurende 2 minuten. Zorg ervoor dat de bovenstaande blijkt helemaal duidelijk. Verwijder de kleeffolie en breng 21 pl supernatant naar een nieuwe 96-well plaat.
- Voeg 4 pi ET2 oplossing in elk putje. Zet de pipet tot 25 pi en voorzichtig pipet het gehele volume omhoog en omlaag 10x en sluit de plaat.
OPMERKING: de procedure kan worden gestopt bij dit punt en de reacties bewaard tot 7 dagen bij -15 ° C. Wanneer de plaat wordt bevroren, volledig ontdooien alvorens de 2e hybridisatie.
- 2e Hybridization
- Centrifugeer de plaat gedurende 1 min bij 280 xg bij 20 ° C. Verwijder de klevende film en voeg 50 ui NCT1, 10 gl CSO en 15 pi PCR kwaliteit water aan de 25 pl bibliotheek. Zet de pipet tot 100 ul en voorzichtig pipet het gehele volume omhoog en omlaag 10x.
- Sluit de plaat en centrifugeer gedurende 1 min bij 280 xg bij 20 ° C.
- Plaats de plaat in een thermocycler (cover op 100 ° C verwarmd) en run programma 2 (Tabel 1).
5. gDNA Verrijking: Dag 2, Middag
- Voordat u begint
- Dooi ET1, ET2, SMB, WS1, WS2, WS3 en HP3 oplossingen bij RT voor hybridisatie wassen. Van de DNA verrijking kit, ontdooien PCR master mix met polymerase (TC-PMM), PCR-primer cocktail (PPC), en RSB oplossingen op ijs voor PCR-amplificatie.
- 2e Hybridization Wash
- Volg precies hetzelfde protocol als voor 4,2-1 st hybridisatie wassen.
- PCR amplificatie
- In een nieuwe 96-well plaat, meng 20 pl elutie uit stap 5.2, 25 gl TC-PMM en 5 ui PPC. Zet de pipet tot 50 pi en voorzichtig pipet het gehele volume omhoog en omlaag 10x. Sluit de plaat en centrifugeer gedurende 1 min bij 280 xg bij 20 ° C.
- Plaats de plaat in een thermocycler (cover op 100 ° C verwarmd) en run programma 3 (tabel 1).
6 gDNA Verrijking: Dag 3
- Voordat u begint
- Dooi RSB oplossing op ijs. Ten minste 30 minuten vóór gebruik, breng zuivering magnetische korrels tot kamertemperatuur.
- PCR Purification
- Centrifugeer de plaat uit stap 5.3 gedurende 1 min bij 280 xg bij 20 ° C, en verwijder de kleefstof deksel.
- At RT, voeg 90 ul previously gemengd zuivering magnetische korrels in elk putje. Zet de pipet tot 140 ul, zachtjes pipet het gehele volume omhoog en omlaag 10x. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Plaats de plaat met 96 putjes op een magnetische standaard voor 5 min bij RT. Zorg ervoor dat de bovenstaande blijkt helemaal duidelijk.
- Bereid een verse 80% ethanol (2 samples, voeg 200 ul gedestilleerd water tot 800 gl ethanol). Verwijder het supernatant en let erop dat de pellet te verstoren.
- Terwijl de plaat op de magnetische standaard, voeg 200 pl vers bereide 80% ethanol aan elke well zonder de kralen en incubeer de plaat gedurende 30 seconden bij KT. Verwijder het supernatant en herhaal dit nog een keer te wassen. Zorg ervoor dat de ethanol is verwijderd. Laten drogen bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten of totdat volledige verdamping van ethanol, terwijl de plaat op de magnetische standaard.
- Verwijder de plaat uit de magnetische stand en voeg 30 ul van RSB buffer. Zet de pipet tot 30 pi, en voorzichtig pipet thij volledige volume op en neer 10x. Incubeer de plaat gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Plaats de 96-well plaat op de magnetische standaard en incubeer gedurende 5 minuten of totdat het supernatans wordt volledig duidelijk. Zacht overdracht 28 ul van de supernatant in een nieuwe 96-well plaat (typeplaat: TCY).
OPMERKING: De procedure kan worden gestopt in dit stadium en de reacties bewaard bij -15 ° C voor 7 dagen.
- Bibliotheek Validatie en kwantificering
- Bepaal de kwaliteit van de bibliotheek met een fragment analysator. Hoge resolutie acrylamide gelelektroforese kunnen worden om de bovengenoemde stappen vervangen, maar wordt niet aangeraden. Fragmenten moet tussen 150 bp en 1000 bp.
OPMERKING: Aanbevolen: Kwantificeren van de bibliotheek door qPCR om het beste aantal clusters te verkrijgen tijdens sequencing. - Als referentie gebruik een gevalideerde bibliotheek (2 nM). Als de eerste bibliotheek wordt voorbereid, gebruik maken van de faag PhiX DNA (10 nM) voorzien voor de kalibratie van de sequencing apparaat.
- Maak seriële verdunningen van de positieve controle tot 7 punten verkrijgen bij 20, 16, 8, 6, 4, 2, en 1:00 in EBT (EB elution buffer + 0.1% Tween 20). Verdun de bibliotheek van de belangstelling op 1/1000 en 1/2000. Elk punt moet worden geanalyseerd in drievoud.
- Bereid het volgende mengsel (vermenigvuldigen volumes door het aantal putjes gebruikt): 1 well 10 ui SYBR Green met qPCR master mix (2x), 0,2 pl voorwaartse primer (10 uM, AATGATACGGCGACCACCGAGAT), 0,2 ui reverse primer (10 uM, CAAGCAGAAGACGGCATACGA) en 7,6 pi PCR kwaliteit water.
- Na mengen afzetten in een 96-well plaat, 18 ul van het mengsel in elk putje en 2 ui positieve en bibliotheek verdunningen. Sluit de plaat en centrifugeer gedurende 1 min bij 280 xg bij 20 ° C. Vervolgens plaatst u de plaat in een kwantitatieve PCR thermocycler en run-programma 4 (Tabel 1).
- Analyseer de resultaten conventionele absolute kwantificering om de opbrengst van elke l vindenibrary. Het voordeel is dat qPCR kwantificeert alleen DNA die interageren met de doorstroomcel.
OPMERKING: fluorimetrische kwantificering van DNA niet door de aanwezigheid van DNA mimetische moleculen in een van de reagentia. Deze kwantificering methode zou de bibliotheek opbrengst overschatten en daardoor de clustering score onderschatten.
- Bepaal de kwaliteit van de bibliotheek met een fragment analysator. Hoge resolutie acrylamide gelelektroforese kunnen worden om de bovengenoemde stappen vervangen, maar wordt niet aangeraden. Fragmenten moet tussen 150 bp en 1000 bp.
- Sequencing Launching
- Verdun elke bibliotheek 4 nM in een eindvolume van 30 ui elutiebuffer (EB) en zwembad alle bibliotheken en meng.
- Bereid vers 0,2 N NaOH-oplossing in buffer EB en meng 10 pl van deze NaOH oplossing 10 pi samengevoegd bibliotheken. Meng goed en incubeer precies 5 min bij kamertemperatuur.
- Na de 5 minuten, onmiddellijk voeg 980 ul hybridisatiebuffer (van sequencing cartridge) en meng. Vervolgens Meng 400 pi van dit mengsel met 600 gl hybridisatiebuffer. Meng goed en breng 600 ul in een 300-cyclus cassette (2 x 150) voor een injectie van 8pM. Launch sequencing.
7 Data Analysis
- Zodra het apparaat de gegevens heeft verwerkt, dragen de .bam en VCF-bestanden naar een nieuwe computer.
OPMERKING: Transposase fragmentatie bevat voetafdrukken. Bijgevolg is de software snijdt automatisch deze gegevens. - Verzamel genetische variaties verkregen met de inrichting analyse.
- Analyseer geëxporteerde bestanden (.bam, VCF) met een andere software (Alamut) door het volgen van de instructies van de fabrikant. Vervolgens vergelijkt de genetische variaties verkregen met beide analyses. Slechts variaties gedetecteerd twee keer aanwezig zijn beschouwd.
Tabel 1 PCR-omstandigheden
| Programma | Temperatuur | Tijd | Num. herhalingen | |||
| 1 | 72 ° C | 3 min | 1 | 98 ° C | 30 sec | 1 |
| 98 ° C | 10 sec | 10 | ||||
| 60 ° C | 30 sec | |||||
| 72 ° C | 30 sec | |||||
| 72 ° C | 5 min | 1 | ||||
| 10 ° C | onbeperkt | |||||
| 2 | 95 ° C | 10 min | 1 | |||
| 93 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 91 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 89 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 87 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 85 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 83 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 81 ° C 1 min | 1 | |||||
| 79 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 77 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 75 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 71 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 69 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 67 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 65 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 63 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 61 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 59 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 58 ° C | 1 min | 16-18 uur | ||||
| 3 | 98 ° C | 30 sec | 1 | |||
| 98 ° C | 10 sec | 10 | ||||
| 60 ° C | 30 sec | |||||
| 72 ° C | 30 sec | |||||
| 72 ° C | 5 min | 1 | ||||
| 10 ° C | onbeperkt | |||||
| 4 | 95 ° C | 10 min | 1 | |||
| 95 ° C | 15 sec | 40 | ||||
| 60 ° C | 1 min | |||||
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voorbeeld QC resultaten
Het vermogen van deze methode om sequenties van doelgenen te bepalen is gebaseerd op de kwaliteit van de gDNA (Figuur 2A) en de kwaliteit van de tagmentation stap. Als de tagmentation onvoldoende (Figuur 2B, bovenste paneel), de sequentiebepaling niet bevredigend. Zoals hierboven vermeld, na de tagmentation zuivering, de gDNA worden tagmented in fragmenten van 150 bp tot 1000 bp met de meeste fragmenten ongeveer 300 bp (Figuur 2B, onderste paneel).
Aan het eind van de bibliotheek voorbereiding, is de bibliotheek de kwaliteit gecontroleerd met een bioanalyser. Het verkregen profiel moet ongeveer gelijk na tagmentation maar met een hoger aantal fragmenten (figuur 2C) zijn. Als library kwaliteit niet identiek aan figuur 1C dient sequencing niet worden uitgevoerd.
Nadat de sequentie is geïntroduceerd opde sequencing-apparaat, de clustering score is beschikbaar na 9 cycli en moet tussen de 800.000 en 1.100.000 clusters / mm ² (Figuur 3A). Indien deze hoeveelheid kleiner is, zal de sequentie niet bevredigend, met name in de diepte van gelezen. Indien deze hoger is, worden de beelden wazig zijn (Figuur 3B), en geen analyse zal worden gedaan als gevolg van de onmogelijkheid om clusters te onderscheiden.
Aan het einde van de run is het belangrijk om de kwaliteit score controleren. Door het volgen van het protocol hierboven beschreven, zal de kwaliteit score van de run overeen met figuur 4. De kwaliteit van sequentiebepaling wordt vertegenwoordigd door een Q-score (Q-30). Om het experiment te valideren, ten minste ongeveer 75% van de sequenties (clusters) zou een Q-score superieure of gelijk aan 30.
Sequencing resultaten
Dit experiment werd ontworpen om constitutionele genetische afwijkingen te bestuderen. In dit geval, de genetische abnormaliteit prESENT 50% in het genoom. Hierdoor de sequencing diepte is niet belangrijk. Hierin we bereid en de sequentie tegelijkertijd 2 bibliotheken van 12 patiënten 11 volledige genen. Om hoge sequencing diepte verkrijgen, het aantal gemultiplexte patiënten moet worden verlaagd. Zoals gDNA verrijking gebaseerd op capture probes van de verrijking niet homogeen (Figuur 5). Met ons protocol, genereerden we ongeveer 6 Gb leest, induceren een gemiddelde dekking van 150 leest voor elke base, met een minimum van 20 en een maximum van 330 leest. Deze gelezen diepten in overeenstemming met het gebruik van NGS in de klinische praktijk 11. Ondanks de heterogeniteit van gelezen diepten, waarschijnlijk door gDNA verrijking van vastleggen en niet grote herschikking van genen, is het belangrijk op te merken dat de Q-score was altijd hoger dan 30 (figuur 5), waardoor de sequentie valideren.
Desalniettemin is het belangrijk om de technologie te valideren door het resultaat te vergelijkens verkregen met die verkregen met Sanger sequencing. Bij de 17 patiënten sequentie zowel Sanger sequentiebepaling (coderende sequenties van BRCA1 en BRCA2) en transposase gebaseerde technologie, ontdekten we dezelfde 330 genetische variaties (SNP en mutaties). Als voorbeeld, een puntmutatie in het BRCA1-gen (figuur 6 links) en een deletie van 4 basen in het BRCA2-gen (figuur 6 rechts) werden gedetecteerd met zowel Sanger en transposase-gebaseerde methoden. Al BRCA1 is het omgekeerde streng van chromosoom 13, is het belangrijk op te merken dat het noodzakelijk de (maar niet omgekeerd) de verkregen sequentie, terwijl voor BRCA2 (de voorwaartse streng), ofwel de verkregen sequentie niet hoeft te worden aangevuld . Zoals aangegeven in figuur 5, NGS technologie geeft een geschatte frequentie van genetische variatie, terwijl de Sanger methode niet. Bovendien, in het bijzonder voor indel variaties, de interpretatie is gemakkelijker met NGS-technologie. Zoals getoond in figuur 6 rechts, Indel variatie sequenties verschijnen gecodeerde elektroferogram dat voorwaartse en omgekeerde sequentie moet de ingevoegde of verwijderde sequentie ontcijferen. Met NGS analyse, wordt de ingevoegde of verwijderde volgorde direct bepaald, waardoor het risico van verkeerde interpretatie verminderen. Tenslotte transposasegen gebaseerde technologie liet ons toe om een groter aantal van target genen te analyseren, en we vonden veel nieuwe genetische variatie sequenties die niet werden gedekt door Sanger sequencing. Deze resultaten zullen elders worden gepubliceerd.
Figuur 1 Schematische workflow van de procedure. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2 Kwaliteit controles voor en na de bibliotheek voorbereiding. A. spectrofotometrische profiel van gDNA die veilig kan worden gebruikt tagmentation. De DNA-opbrengst moet hoger zijn dan 5 ng / ul, 260/280 en 260/230 ratio's moeten superieur respectievelijk 1,8 en 2. B. Fragment analyzer profielen van tagmented gDNA. Bovenste paneel vertegenwoordigt onvoldoende tagmented gDNA. Onderste paneel toont een perfect tagmented monster. C. Fragment analyzer profiel van bereide bibliotheek net voor sequencing lancering. Fragment grootte is hetzelfde als tagmented gDNA (B, onderste paneel), maar met een versterkte hoeveelheid. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
> 
Figuur 3 Controle cluster generatie. A. Screenshot van de sequencing-apparaat tijdens de run. Cluster dichtheid moet tussen de 800 en 1.000 K / mm ². B. Verschillende afbeeldingen komen overeen met een lage dichtheid (bovenste paneel), een hoge dichtheid (onderste paneel) en perfecte dichtheid (middelste paneel). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken .
Figuur 4 de Q-score Controle. Aan het einde van de run dienen gevalideerd sequencing ten minste 75% van de gegenereerde clusters met een Q-score hoger dan 30.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5 Vertegenwoordigen dekking van gegevens en de bijbehorende Q-score. De lees diepte is heterogeen langs de overdekte gen. Toch is de Q-score van bedekte gebieden is altijd superieur aan Q-30. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6 Representatieve resultaten verkregen met Sanger sequencing en met-transposase gebaseerde technologie. Alle genetische variaties waargenomen met Sanger sequencing werden detected met het transposase-gebaseerde technologie. Overwegende dat puntmutaties zijn eenvoudig te interpreteren, indel wijzigingen zijn soms heel moeilijk om te studeren met de Sanger-methode. Met-transposase gebaseerde technologie geassocieerd met een gemiddelde doorvoersnelheid apparaat, indel wijzigingen zijn eenvoudig te ontdekken. Toch worden opgemerkt dat het noodzakelijk de (maar niet omgekeerd) sequenties verkregen wanneer het doelwitgen op de minus streng (hier het BRCA1-gen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur zien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het wijdverbreide gebruik van NGS apparaten en technologieën heeft nieuwe mogelijkheden in het onderzoek naar kanker en genetische aandoeningen. Naast whole genome sequencing of RNA sequentie, de analyse van een grote hoeveelheid gDNA geselecteerde sequenties in verschillende patiënten tegelijkertijd biedt grote mogelijkheden in diagnose. Hier ontwikkelden we een specifiek ontwerp (op aanvraag) met Nextera technologie om 11 volledige genen tegelijk bestuderen bij 24 patiënten met een gemiddelde throughput sequencing apparaat (Table of Materials / Equipment). Dit protocol zorgt voor een snelle generatie van gegevens die een snelle reactie op de bezorgdheid van patiënten met een laag risico op fouten maakt. Zoals getoond in figuur 6 zijn alle genetische variaties gedetecteerd met Sanger sequentiebepaling ook gedetecteerd door de transposase-gebaseerde preparaat kit. Deze methode is betrouwbaar en gemakkelijk te interpreteren, vooral voor complexe Indel wijzigingen die direct geanalyseerd. Desalniettemin is het belangrijkvast dat genen in de min streng moet vullen (zonder omkering) nucleotiden. Het onderhavige werk werd uitgevoerd met een ontwerp voor de analyse van 11 volledige genen, maar het protocol is hetzelfde ongeacht de gekozen ontwerp. Transposase-gebaseerde technologie kan ook worden gebruikt voor bibliotheek bereiding van lange afstand PCR producten 12. Inderdaad, het algoritme (ontwikkeld door de fabrikant) wordt gebruikt voor het ontwerp (fabrikant website tool, zie Tabel van Materialen / Equipment) is specifiek gewijd voor dit protocol. Naast transposasegen-gebaseerde technologie, twee andere mechanismen van DNA-fragmentatie voordat bibliotheek voorbereiding zijn ook beschikbaar: mechanische fragmentatie en enzymatische fragmentatie. Mechanical DNA fragmentatie reproduceerbaar maar heeft een ultrasonicator, en voorbereiding bibliotheek duurder en tijdrovender. Enzymatische DNA fragmentatie veroorzaakt vaak problemen voor DNA vangen door restrictie-enzym plaats lokaties verkregeneen gebrek aan doelsequentie dekking. Niettemin elke strategie voor DNA fragmentatie heeft voordelen en nadelen, maar wordt erg vergelijkbare resultaten oplevert, althans voor de lange afstand PCR product fragmentatie 13. Het gebruik van een nieuw enzym cocktail leek dezelfde resultaten als die verkregen met mechanische DNA fragmentatie 14 verschaffen. -Transposase gebaseerde technologie heeft een hoge kwaliteit DNA (niet van toepassing voor het DNA geëxtraheerd uit FFPE weefsels). Bovendien is de activiteit van transposase heeft fragmenten van meer dan 300 bp, wat suggereert dat fragmenten plaats langer dan deze lengte zijn. Deze specificiteit verklaart de behoefte aan hoge kwaliteit, niet-gefragmenteerde DNA.
Tot nu toe hebben genetische variaties van BRCA1 en BRCA2 onderzocht bij familiaire borstkanker en eierstokkanker. De betrokkenheid van BRCA-genen, vooral BRCA2, nu vermoed andere kankers, vooral in 15 pancreas, prostaat16 en testis kanker 17. De genetische verandering van PALB2, een partner van BRCA genen, wordt ook in verband gebracht met alvleesklierkanker 18. Bovendien onlangs bleek dat patiënten die een BRCA-mutaties, en in mindere mate PALB2 mutaties vertoonden een betere respons van de alvleesklier kanker PARP remmers 19. Zoals BRCA1, BRCA2 en PALB2 geassocieerd met een erfelijke risico op kanker, en mogelijk vergezeld gevoeligheid specifieke behandeling lijkt belangrijk de BRCA1 en BRCA2 partners screenen staand familiaire kankerrisico en screening voor kanker behandelingseffect.
Uit deze gegevens, de analyse van DNA break-repair genen een belangrijke rol kan niet alleen voor het screenen van gevoeligheid, maar ook voor een vermeend indicator behandeling respons. Bovendien zou het met dit protocol voorgestelde volledige gen analyse cover alle veranderingen die aangeboren aanwezig (en in kankercellen) zou kunnen zijn, zoals mutaties in de promotor, splicing sites of reglementaire splicing locaties in introns. Tot op heden hebben veranderingen in niet-coderende sequenties van genen niet onderzocht in de diepte, maar de ontwikkeling van genoom-brede associatiestudies kunnen belangrijke functies van deze sequenties te markeren.
Kortom, de-transposase based design ontwikkeld in deze paper is een interessante manier om genetische afwijkingen in kanker gevoelige genen die betrokken zijn bij DNA-schade herstel verkennen. De mogelijkheid om 11 volledige genen voor 24 patiënten te sequencen tegelijkertijd een belangrijk voordeel vergeleken met de Sanger sequencing methode, die vrij moeilijke techniek voor screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MiSeq | Illumina | SY-410-1001 | Sequencing/medium throughput device |
| Nextera Enrichment kit | Illumina | FC-123-1208 | Transposase based technology |
| 300 cycle cartridge | Illumina | 15033624 | |
| AMPure beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic purification beads |
| Magnetic stand | Alpaqua | A32782 | |
| 96-well Plates | Life Technologies | 4306737 | |
| MIDI 96-well plates | Biorad | AB0859 | |
| Microseal A | Biorad | MSA-5001 | This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment |
| MiSeq | Illumina | Provided with the sequencing device Experiment Manager software Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new Manufacturer website tool |
References
- Cornelisse, C. J., Cornelis, R. S., Devilee, P. Genes responsible for familial breast cancer. Pathol. Res. Pract. 192 (7), 684-693 (1996).
- Culver, J., Lowstuter, K., Bowling, L. Assessing breast cancer risk and BRCA1/2 carrier probability. Breast Dis. 27, 5-20 (2007).
- Cox, D. G., et al. Common variants of the BRCA1 wild-type allele modify the risk of breast cancer in BRCA1 mutation carriers. Hum. Mol. Genet. 20 (23), 4732-4747 (2011).
- Maia, A. T., et al. Effects of BRCA2 cis-regulation in normal breast and cancer risk amongst BRCA2 mutation carriers. Breast Cancer Res. 14 (2), 63 (2012).
- Anczuków, O., et al. BRCA2 deep intronic mutation causing activation of a cryptic exon: opening toward a new preventive therapeutic strategy. Clin. Cancer Res. 18 (18), 4903-4909 (2012).
- Brewster, B. L., et al. Identification of fifteen novel germline variants in the BRCA1 3'UTR reveals a variant in a breast cancer case that introduces a functional miR-103 target site. Hum. Mutat. 33 (12), 1665-1675 (2012).
- Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nat Rev Cancer. 12 (1), 68-78 (2012).
- Ma, X. D., et al. First evidence for the contribution of the genetic variations of BRCA1-interacting protein 1 (BRIP1) to the genetic susceptibility of cervical cancer. Gene. 524 (2), 208-213 (2013).
- Haanpää, M., Pylkäs, K., Moilanen, J. S., Winqvist, R. Evaluation of the need for routine clinical testing of PALB2 c.1592delT mutation in BRCA negative Northern Finnish breast cancer families. BMC Med. Genet. 14, 82 (2013).
- Southey, M. C., Teo, Z. L., Winship, I. PALB2 and breast cancer: ready for clinical translation. Appl. Clin. Genet. 6, 43-52 (2013).
- Ulahannan, D., Kovac, M. B., Mulholland, P. J., Cazier, J. B., Tomlinson, I. Technical and implementation issues in using next-generation sequencing of cancers in clinical practice. Br. J. Cancer. 109, 827-835 (2013).
- Hernan, I., Borràs, E., de Sousa Dias, M., Gamundi, M. J., Mañé, B., Llort, G., Agúndez, J. A., Blanca, M., Carballo, M. Detection of genomic variations in BRCA1 and BRCA2 genes by long-range PCR and next-generation sequencing. J. Mol. Diagn. 14, 286-293 (2012).
- Knierim, E., Lucke, B., Schwarz, J. M., Schuelke, M., Seelow, D. Systematic comparison of three methods for fragmentation of long-range PCR products for next generation sequencing. Plos One. 6, e28240 (2011).
- de Sousa Dias, M., Hernan, I., Pascual, B., Borràs, E., Mañé, B., Gamundi, M. J., Carballo, M. Detection of novel mutations that cause autosomal dominant retinitis pigmentosa in candidate genes by long-range PCR amplification and next-generation sequencing. Mol. Vis. 19, 654-664 (2013).
- The Breast Cancer Linkage Consortium. Cancer Risks in BRCA2 Mutation Carriers. J. Natl. Cancer Inst. 91, 1310-1316 (1999).
- Levy-Lahad, E., Friedman, E. Cancer risks among BRCA1 and BRCA2 mutation carriers. Br. J. Cancer. 96 (1), 11-15 (2007).
- Risch, H. A., et al. Population BRCA1 and BRCA2 mutation frequencies and cancer penetrances: a kin-cohort study in Ontario, Canada. J. Natl. Cancer Inst. 98 (23), 1694-1706 (2006).
- Slater, E. P., et al. PALB2 mutations in European familial pancreatic cancer families. Clin. Genet. 78, 490-494 (2010).
- Brennan, G. T., Relias, V., Saif, M. W.
