Abstract
Yeni Nesil dizileme yaygın kullanımı kanser araştırmaları ve tanı için yeni yollar açtı. NGS büyük kanser yeni miktarlarda veri ve özellikle kanser genetiğini getirecektir. Mevcut bilgi ve gelecekteki keşifler gerekli kansere genetik yatkınlık rol olabilir genlerin büyük bir dizi çalışma yapacak. Bu amaçla, DNA hasarı tamir katılan 11 komple genlerin çalışma NextEra bir tasarım geliştirildi. Bu protokol güvenle, aynı anda 24 hastada 11 genler (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80 ve TP53) promoterinden 3'-UTRsine incelemek için geliştirilmiştir. Transposaz teknoloji ve gDNA zenginleştirme dayanan bu protokol, çoklama, örnek genetik tanı sayesinde zaman açısından büyük bir avantaj sağlar. Bu protokol, güvenli bir şekilde, kan gDNA kullanılabilir.
Introduction
2010 yılında, (esas kadın) yaklaşık 1.5 milyon kişi meme kanseri gelişmiş. Bu vakaların% 5-10 kalıtsal olduğu tahmin edilmektedir. Kalıtsal meme ve yumurtalık kanserlerinde 1 katılan neredeyse 20 yıl önce, BRCA1 ve BRCA2 tespit edilmiştir. 15 yıl öncesine kadar, BRCA1 ve BRCA2 kodlama bölgeleri, meme ve yumurtalık kanseri genetik yatkınlık belirlemek için dizilenmiştir. BRCA1 ve BRCA2 değişiklikler, bu bölgelerin yapılan analiz, etkin taraması için yeterli olmadığını göstermektedir seçilen ailesine 2'nin 10-20% olarak tespit edilir. Son zamanlarda, BRCA1 ve BRCA2 olmayan kodlama dizileri (promotör, intronlu 3-'UTR) analizi yeni mutasyonlar / çeşitleri meme kanseri 3-6 daha yüksek bir risk ile bağlantılı olabileceğini vurguladı.
BRCA1 ve BRCA2 proteinleri (homolog rekombinasyon tamir katılmaktadırlarSayısız partnerle 7 tamamlanır HHR). BRCA1 veya BRCA2 değişiklikler DNA onarımı kusurları neden olurken, diğer ortaklar da meme kanseri riskini etkileyebilir. Bu hipotez BRIP1 beri 8 valide edilmiş görünüyor ve PALB2 9 sırasıyla, serviks ve meme kanseri üzerinde kanıtlanmış bir etkisi var. Buna ek olarak, diğer iki "orta riskli" meme kanseri yatkınlık genleri, ATM ve CHEK2, ayrıca rutin 10 incelenebilir.
Bu çalışmalardan elde ardından, biz aynı anda nispeten çok kolay ve kullanan 24 hastada 11 genleri (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80 ve TP53) analiz etmek için bir protokol geliştirmeye karar verdi orta çıktı aygıtında zenginleştirme ve sıralama ile transposaz teknolojisine dayalı hızlı protokol,. TeşekkürlerBu teknik için, 2500 bp'lik bir intronik bölgeleri dahil verildiği RAP80, (: 176,381,588-176,390,180 CHR5) hariç olmak üzere, 3'-UTR sonuna promotörün başlangıç aşamasında tam genleri dizildi. Bu 2.734 problar ile çalışıldı yaklaşık 1.000.300 bp toplam temsil eder. Genellikle, BRCA1 ve BRCA2 egzonik dizileri az 20 hasta için 1.5 ay ihtiyaç Sanger dizileme ile analiz edilmektedir. Mevcut protokol (Şekil 1) ile, aynı zamanda, fazla 75 hasta için 11 tam genler analiz edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
GDNA'sından 1. Değerlendirme (genomik DNA) Verim
- Taze kütüphane hazırlanmasından önce gDNA ekstre niceliğini. (GDNA verim değerlendirmesi için bir spektrofotometre kullanmaktan kaçının) sağlam gDNA ölçmek için florometrik verim değerlendirme yöntemi kullanın. (260/280 nm) oranını ölçmek ve NOT 1.8 arasında ve 2. o olduğundan emin: gDNA'sından 50 ng deney için gereklidir.
2. gDNA Zenginleştirme: 1. Gün, Sabah
- Başlamadan Önce
- DNA zenginleştirme kiti DNA tamponu (TD) ve buz üzerinde DNA enzim (TDE1) çözümleri çözülme, (Malzeme / Ekipman bkz: İçindekiler). En az 30 dakika kullanılmadan önce saflaştırılması manyetik boncuklar getirmek ve hedef (ST) dur, oda sıcaklığında (RT) tamponu. Numune ile kaplama, ul doğrudan 96 oyuklu bir plakaya / 2-2,5 ng 1 gDNA örneğin 20 ul ekle. ÖNEMLİ: protokolü (bilinen dizisi varyasyon numune) doğrulamak için bir pozitif kontrol kullanın.
- Tagmentation
- Mix tüm iyice 5x tersini reaktifleri ve aşağı doğru döndürün kısaca. Oda sıcaklığında, TDE1 tamponu her oyuğa gDNA 50 ng (20 ul) ihtiva eden ve daha sonra 5 ul TD tamponu 25 ul ekle. Yavaşça yukarı ve aşağı 10x tüm hacmi pipetle, 50 ul pipet ayarlayın.
- 20 ° C'de 280 x g'de 1 dakika boyunca bir yapıştırıcı film ve santrifüj ile kapak plakası. Sonra, bir PCR plakasını (100 ° C'de ısıtılmış kapağını) yerleştirin ve aşağıdaki programı çalıştırın: 5 dakika 55 ° C ve sınırsız bir süre için 10 ° C.
- Bu kuluçka sırasında kullanılacak dizin tanımlamak için Deney Manager yazılımı ile örnek levha hazırlanır.
- Arıtma Tagmentation
NOT: Bu adım önemlidir. Çok dikkatli olun.- Arıtma manyetik boncuk ve ST tamponu çökelti olmaması için kontrol edin. Çökeltiler varsa, elinde çözümler ısınmak. Buz üzerinde yeniden süspansiyon haline çözülme tamponu (RSB).
- Oda sıcaklığında, girdap ST çözeltisi ve eklemeIçeren her bir numune için 15 ul. Yavaşça yukarı ve aşağı 10x tüm hacmi pipetle, 65 ul pipet ayarlayın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin. 20 ° C'de 280 x g'de 1 dakika boyunca plaka ve santrifüj örtün.
- Her bir çukura önceden karıştırılmış olan arıtma manyetik boncuk 52 ul ekle. Nazikçe, 117 ul pipet ayarlayın yukarı ve aşağı 10x tüm hacmi pipetle. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. 20 ° C'de 280 x g'de 1 dakika boyunca plaka ve santrifüj örtün.
- Yapışkan filmi çıkarın. Oda sıcaklığında 2 dakika için bir manyetik stand üzerine 96-yuvalı plaka koyun. Süpernatant tamamen net göründüğünden emin olun.
- (24, numuneler için, 8 ml etanol damıtılmış su ilave 2 ml) taze% 80 etanol çözeltisi hazırlayın. Çıkarın ve boncuk rahatsız değil süpernatant özen atın.
- Manyetik stand üzerinde plaka tutarken, boncuk bozmadan, her bir oyuğa taze hazırlanmış% 80 etanol içinde 200 ul ve en az 30 saniye boyunca plaka inkübeoda sıcaklığında karıştırılmıştır. Süpernatantı atın ve bu yıkandıkları ikinci kez tekrarlayın. Etanol sağlamak kaldırıldı. 10 dakika boyunca ya da etanol buharlaşana kadar oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
- Manyetik stand plakasını çıkarın ve RSB tampon 22.5 ul ekleyin. Yavaşça yukarı ve aşağı 10x tüm hacmi pipetle, 22.5 ul pipet ayarlayın. Manyetik stand üzerine 96-yuvalı plakayı ve 2 dakika süreyle inkübe edilir. Süpernatant tamamen net göründüğünden emin olun. Yavaşça yeni bir 96 oyuklu bir plaka içerisinde süpernatan 20 ul transfer.
Not: İsteğe bağlı olarak, bir fragman analizi kullanılarak tagmented numunelerin boyutunu belirler. Bunun yerine, yukarıda belirtilen adımları, yüksek çözünürlüklü akrilamit jel elektroforezi kullanın. Fragments 150 bp ve 1000 bp arasında olmalıdır.
- 1. PCR Büyütülmesi
- Buz üzerinde polimeraz (LP-PMM), Endeks 1 astar ve Dizin 2 astar çözümler içeren çözülme PCR master mix. Kombinasyon o eşleştirDeney Yöneticisi örnek levha ile f indeksleri. Çoklama için, her numune için 1 göstergesi (i7, N7xx) 'den farklı i7 hazırlar.
- Her iyi, yavaşça, LP-PMM 20 ul, Index 1 5 ul ve 50 ul pipet ayarlayın Endeksi 2. 5 ul ekleyin yukarı ve aşağı 10x tüm hacmi pipetle. Yapışkan bir microseal film ile plaka örtün. 20 ° C'de 280 x g'de 1 dakika boyunca santrifüjleyin.
- Bir PCR plakası (kapak 100 ° C'de ısıtılmıştır) ve programı 1 (Tablo 1) koyun.
NOT: yordam bu noktada durdu olabilir ve reaksiyonlar termalcycler veya 2 ila 8 ° C arasında 2 gün boyunca gün saklanır.
3. gDNA Zenginleştirme: 1. Gün, Öğleden Sonra
- Başlamadan Önce
- Çözülme oligolar (CSO), yakalama hedef tamponu 1 (NCT1), ve buz üzerinde RSB çözümleri. En az 30 dakika kullanılmadan önce, oda sıcaklığına kadar arıtma manyetik boncuklar getir.
- PCR Saflaştırma
- 20 ° C'de 280 x g'de 1 dakika boyunca, aşama 2.4 plakayı santrifüjleyin.
- Oda sıcaklığında, her bir oyuğa karışık arıtma manyetik boncuk 45 ul ekle. Nazikçe, 95 ul pipet ayarlayın yukarı ve aşağı 10x tüm hacmi pipetle. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Oda sıcaklığında, 2 dakika için bir manyetik stand üzerine 96-yuvalı plaka koyun.
- Süpernatant tamamen net göründüğünden emin olun. (24, numuneler için, 8 ml etanol damıtılmış su ilave 2 ml) taze% 80 etanol çözeltisi hazırlayın. Pelet rahatsız etmemek için süpernatant özen göstererek atın.
- Manyetik stand üzerinde plaka tutarken, boncuk bozmadan, her bir oyuğa taze hazırlanmış% 80 etanol içinde 200 ul ilave edildi ve oda sıcaklığında 30 saniye boyunca inkübe edin. Süpernatantı atın ve bu yıkandıkları ikinci kez tekrarlayın. Etanol sağlamak kaldırıldı. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
- Manyetik stand plakasını çıkarın ve RSB tampon 40 ul ekleyin. Boruyu ayarlama40 ul tte, hafifçe aşağı 10x bütün hacim yukarı ve pipetle.
- Manyetik stand üzerine 96-yuvalı plakayı ve 2 dakika süreyle inkübe edilir. Süpernatant tamamen net görünmelidir. Yavaşça yeni bir 96 oyuklu bir plakaya süpernatan 38 ul transfer.
- Bir florimetrik yöntem ile her bir numunenin verimini belirler. Değerlendirilen verimleri 30 ve 50 ng / ul arasında ise protokolün bu ilk bölümü doğrulanmış olacaktır.
- 1. Melezleme
- Yeni 96-kuyulu bir levhadaki her numunenin 500 ng karıştırılarak, bu aşamada, havuz başına 12 kadar numune havuzda toplayın. Her bir havuzun nihai hacim 40 ul aşmaz emin olun.
Not: (: ısıtma DNA düşmesine neden olarak da 30 ° C 'de, DNA konsantrasyonu, ısıtma ile değiştirilemez Dikkat) eğer ihtiyaç duyulursa, oda sıcaklığında bir vakum yoğunlaştırıcı cihazı kullanılarak havuzları düşürür. Ekleyerek RSB çözeltisi ile 40 ul son ses seviyesini ayarlayın. - İyice karıştırınNCT1 çözeltisi. Toplanmış DNA numunelerinin ihtiva eden her bir göze 40 ul için NCT1 50 ul ve 10 ul CSO ekleyin. Yavaşça yukarı ve aşağı 10x tüm hacmi pipetle 100 ul pipet ayarlayın. 20 ° C'de 280 x g'de 1 dakika boyunca plaka ve santrifüj Seal.
- Bir PCR plakası (kapak 100 ° C'de ısıtılmıştır) ve programı 2 (Tablo 1) koyun.
- Yeni 96-kuyulu bir levhadaki her numunenin 500 ng karıştırılarak, bu aşamada, havuz başına 12 kadar numune havuzda toplayın. Her bir havuzun nihai hacim 40 ul aşmaz emin olun.
4. gDNA Zenginleştirme: 2. Gün, Sabah
- Başlamadan Önce
- DNA zenginleştirme kiti çözülme (Malzeme / Ekipman bkz: İçindekiler) 2 NaOH, elüsyon tamponu 1 ET2, streptavidin manyetik boncuk (SMB), yıkama solüsyonu 1 (WS1), yıkama hedef (HP3), hedef elüsyon tamponu 1 (ET1) Çözelti 2 (WS2), bir yıkama solüsyonu, 3 (WS3), oda sıcaklığında STK ve NCT1 çözümleri.
- 1. Hibridizasyon Yıkama
- 20 ° C'de 280 x g'de santrifüj PCR ve 1 dakikadan 96 oyuklu plaka çıkarın. Çok dikkatli bir şekild yapışkan kapağını çıkarınLly.
- Yeni MIDI 96 oyuklu plakaya plaka 100 ul reaksiyon karışımı aktarın ve de girdap oluşturularak karıştırıldı, SMB çözeltisi 250 ul. Yavaşça yukarı ve aşağı 10x tüm hacmi pipetle 350 ul pipet ayarlayın. Plaka sızdırmaz şekilde kapatılır ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
- 20 ° C'de 280 x g'de 1 dakika boyunca santrifüj, yapışkan contayı ve 2 dakika boyunca manyetik bir stand üzerine levhayı. Süpernatant tamamen net göründüğünden emin olun. Süpernatantı atın ve manyetik stand plakasını çıkarın.
- De ihtiva eden boncuklar içine iyice karıştırıldı, WS1 çözeltisi 200 ul ilave edin. Kabarcıklar / köpük oluşumunun önüne aşağıya 15x bütün hacim yukarı ve 200 ul pipet ayarlayın ve yavaşça pipetle.
- 2 dakika süreyle manyetik standında plakası yerleştirin. Süpernatant tamamen net göründüğünden emin olun. Süpernatantı atın ve manyetik stand plakasını çıkarın.
- Conta kuyu içine iyice karıştırılmış WS2 çözeltisi 200 uladencilik boncuk. 200 ul pipet ayarlayın ve yavaşça bütün hacim yukarı pipet ve aşağı 15x kabarcıklar / köpük oluşumunu engeller.
- 2 dakika süreyle manyetik standında plakası yerleştirin. Süpernatant tamamen net göründüğünden emin olun. Süpernatantı atın ve manyetik stand plakasını çıkarın.
- Boncuklar içeren kuyu içine iyice karıştırılmış WS2 çözeltisi 200 ul ilave edin. 200 ul pipet ayarlayın ve yavaşça yukarı ve aşağı 15x tüm hacmi pipetle.
- Yeni bir 96-çukurlu plaka içindeki bütün hacmini aktarın. Plaka sızdırmaz şekilde kapatılır ve bir PCR (kapak 100 ° C'de ısıtılmıştır) levhayı yerleştirin. 30 dakika boyunca 42 ° C'de bir ısıl başlatın.
- Imediately 2 dakika boyunca manyetik bir stand üzerine levhayı. Süpernatant tamamen net göründüğünden emin olun. Mühür çıkarın ve hemen tüm süpernatant atın. Ardından, manyetik stand plakasını çıkarın.
- Boncuklar içeren kuyu içine WS2 200 ul ilave edin. 200 pipet ayarlayınul ve yavaşça bütün hacim yukarı pipet ve aşağı 15x kabarcıklar / köpük oluşumunu engeller. Plaka sızdırmaz şekilde kapatılır ve bir PCR (kapak 100 ° C'de ısıtılmıştır) levhayı yerleştirin. 30 dakika boyunca 42 ° C'de bir ısıl başlatın.
- Hemen 2 dakika süreyle manyetik standında plakasını yerleştirin. Süpernatant tamamen net göründüğünden emin olun. Mühür çıkarın ve hemen tüm süpernatant atın. Ardından, manyetik stand plakasını çıkarın.
- Boncuklar içeren kuyu içine iyice karıştırılmış WS3 çözeltisi 200 ul ilave edin. 200 ul pipet ayarlayın ve yavaşça yukarı ve aşağı 15x tüm hacmi pipetle.
- 2 dakika süreyle manyetik standında plakası yerleştirin. Süpernatant tamamen net göründüğünden emin olun. Tüm Süpernatantı atın ve manyetik stand plakasını çıkarın.
- WS3 ikinci kez yıkayın tekrarlayın.
- Süpernatant çıkardıktan sonra, kalan süpernatant aşağı çekmek için plaka ve kısaca santrifüj mühür. Üzerindeki plakayı2 dakika süreyle manyetik standı. Artık süpernatant atın.
- 0.2 ml tüp içinde, ET1 28.5 ul ve HP3 çözümler 1,5 ul karıştırın. Bu karışım daha havuzlar hazırlanır ise, hazırlanan saysının bu miktarlar çarpma, 1 havuz içindir.
- Manyetik stand plakasını çıkarın. Yukarıda hazırlanan karışımı 23 ul ekle. 23 ul pipet ayarlayın ve yavaşça yukarı ve aşağı 15x tüm hacmi pipetle. Plaka sızdırmaz şekilde kapatılır ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bırakın. 20 ° C'de 280 x g'de 1 dakika boyunca santrifüjleyin.
- 2 dakika süreyle manyetik standında plakası yerleştirin. Süpernatant tamamen net göründüğünden emin olun. Yapışkan filmi çıkarın ve yeni bir 96 oyuklu plakaya süpernatan 21 ul transfer.
- Her bir oyuğa ET2 solüsyonu 4 ul ekleyin. 25 ul pipet ayarlayın ve yavaşça yukarı ve aşağı 10x tüm hacmi pipet ve plaka mühür.
Not: bu noktada işlemi durdurulabilir ve reaksiyonlar, -15 ° C 'de 7 güne kadar depolanabilir. Plakası donmuş ise, tamamen 2. melezleştirilmesine başlamadan önce eritin.
- 2. Hibridizasyon
- 20 ° C'de 280 x g'de 1 dakika boyunca plaka santrifüjleyin. Yapışkan filmi çıkarın ve kütüphanenin 25 ul NCT1 50 ul, 10 ul CSO ve PCR sınıf su 15 ul ekle. 100 ul pipet ayarlayın ve yavaşça yukarı ve aşağı 10x tüm hacmi pipetle.
- 20 ° C'de 280 x g'de 1 dakika boyunca plaka ve santrifüj Seal.
- Bir PCR plakası (kapak 100 ° C'de ısıtılmıştır) ve programı 2 (Tablo 1) koyun.
5. gDNA Zenginleştirme: 2. Gün, Öğleden Sonra
- Başlamadan Önce
- Çözülme ET1, ET2, SMB, WS1 WS2, WS3 ve melezleme yıkama RT'de HP3 çözümleri. DNA zenginleştirme kiti, PCR amplifikasyonu için buz üzerinde PCR master mix içeren polimeraz (TC-PMM), PCR primer kokteyl (PPC), ve RSB çözüm çözülme.
- 2. Hibridizasyon Yıkama
- 1. melezleme yıkama - 4.2 tam olarak aynı protokolü uygulayın.
- PCR Amplifikasyonu
- Yeni bir 96 oyuklu bir plaka içerisinde, Aşama 5.2 ve TC-PMM 25 ul, PPC 5 ul elüsyon 20 ul karıştırın. 50 ul pipet ayarlayın ve yavaşça yukarı ve aşağı 10x tüm hacmi pipetle. 20 ° C'de 280 x g'de 1 dakika boyunca plaka ve santrifüj Seal.
- Bir PCR plakası (kapak 100 ° C'de ısıtılmıştır) ve programı 3 (Tablo 1) koyun.
6. gDNA Zenginleştirme: 3. Gün
- Başlamadan Önce
- Buz üzerinde çözülme RSB çözeltisi. En az 30 dakika kullanılmadan önce, oda sıcaklığına kadar arıtma manyetik boncuklar getir.
- PCR Saflaştırma
- 20 ° C'de 280 x g'de 1 dakika boyunca aşama 5.3 plakayı santrifüj ve yapışkan kapağını çıkarın.
- Oda sıcaklığında, p 90 ulreviously her çukura arıtma manyetik boncuklar karıştırılır. Yavaşça yukarı ve aşağı 10x tüm hacmi pipetle, 140 ul pipet ayarlayın. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca manyetik bir stand üzerine 96-yuvalı plaka koyun. Süpernatant tamamen net göründüğünden emin olun.
- (2 numuneler için 800 ul etanol damıtılmış su, 200 ul) taze% 80 etanol çözeltisi hazırlayın. Pelet rahatsız etmemek için süpernatant özen göstererek atın.
- Manyetik stand üzerinde plaka tutarken, boncuk bozmadan, her bir oyuğa taze hazırlanmış% 80 etanol içinde 200 ul ve oda sıcaklığında 30 saniye boyunca inkübe edin. Süpernatantı atın ve bu yıkandıkları bir kez daha tekrarlayın. Etanol sağlamak kaldırıldı. Plaka manyetik standdayken 15 dakika boyunca ya da etanol buharlaşana kadar oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
- Manyetik stand plakasını çıkarın ve RSB tampon 30 ul ekleyin. T pipetle yavaşça 30 ul pipet ayarlayın veO bütün hacim yukarı ve aşağı 10x. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca inkübe edin.
- Manyetik stand üzerine 96-yuvalı plakayı ve 5 dakika için ya da yüzer madde tamamen berrak görünene kadar inkübe edilir. Yavaşça yeni bir 96 oyuklu plaka (: TCY plaka tipi) içine süpernatan 28 ul transfer.
Not: Prosedür, bu aşamada durdurulabilir ve reaksiyonlar, 7 güne kadar -15 ° C'de saklanır.
- Kütüphane Doğrulama ve Ölçümü
- Bir fragman analizi kullanılarak Kütüphanenin kalitesinin belirlenmesi. Yüksek çözünürlüklü akrilamit jel elektroforezi yukarıda belirtilen adımları değiştirmek için kullanılabilecek, ancak tavsiye edilmez. Fragments 150 bp ve 1000 bp arasında olmalıdır.
Tavsiye: NOT sıralama sırasında kümelerin en iyi sayısını elde etmek için qPCR kütüphane niceliğini. - Bir referans olarak, doğrulanmış bir kitaplık (2 mM) kullanılmaktadır. Ilk kütüphane hazırlanıyorsa, sequenc kalibrasyonu için sağlanan faj Phix DNA'sı (10 nM) kullanımıCihazı ing.
- , 20 ° C'de 7 puan elde etmek üzere, pozitif kontrol seri dilüsyonları hazırlayın 16, 8, 6, 4, 2 ve EBT olarak 01:00 (EB elüsyon tamponu +% 0.1 Tween 20). 1/1000 ve 1 / 2,000 de ilgi kütüphane sulandırmak. Her nokta, üç nüsha olarak analiz edilmelidir.
- , De 1 için QPCR ana karışımı (2 x) ihtiva eden SYBR Green 10 ul, ileri primeri, 0.2 ul (10 uM, AATGATACGGCGACCACCGAGAT), ters primer, 0.2 ul (ikinci kuyu sayısı ile çarpın hacim) aşağıdaki karışımı hazırlayın (10 uM, CAAGCAGAAGACGGCATACGA) ve 7.6 ul PCR sınıf su.
- Karıştırma işleminden sonra, pozitif kontrol ve kütüphane sulandırmalarından her biri göz ve 2 ul içine, 96 oyuklu bir plaka içerisinde karışımı 18 ul depose. 20 ° C'de 280 x g'de 1 dakika boyunca plaka ve santrifüj Seal. Sonra, bir kantitatif PCR termalcycler ve çalıştırma programı 4 (Tablo 1) tabak yerleştirin.
- Her l verim elde etmek için klasik mutlak miktar olarak analiz sonuçlarıibrary. QPCR avantajı, sadece akış hücresi ile etkileşim DNA miktarını belirler olmasıdır.
Not: nedeniyle, reaktiflerin bir DNA mimetik moleküllerinin varlığında DNA fluorimetric miktarının kullanmayın. Bu ölçme yöntemi kütüphane verim abartma ve dolayısıyla kümelenme puan hafife olacaktır.
- Bir fragman analizi kullanılarak Kütüphanenin kalitesinin belirlenmesi. Yüksek çözünürlüklü akrilamit jel elektroforezi yukarıda belirtilen adımları değiştirmek için kullanılabilecek, ancak tavsiye edilmez. Fragments 150 bp ve 1000 bp arasında olmalıdır.
- Ardışık başlatılması
- Elüsyon tamponu (EB) 30 ul'lik bir nihai hacim içinde 4 nM'de her bir kütüphane seyreltin ve tüm kitaplıkları havuzu ve iyice karıştırın.
- EB tamponu taze 0.2 N NaOH çözeltisi hazırlayın ve bir araya kütüphaneler 10 ul Bu NaOH çözeltisi, 10 ul karıştırın. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında tam 5 dakika inkübe edin.
- 5 dakika sonra hemen (dizileme kartuştan) Melezleştirme tampon 980 ul ekleyin ve iyice karıştırın. Daha sonra, hibridizasyon tamponu 600 ul ile bu karışımdan 400 ul karıştırın. İyice karıştırın ve 8 bir enjeksiyon için 300 döngü kartuşunun (2 x 150) içine 600 ul transferpM'den herhangi biridir. Başlat sıralama.
7. Veri Analizi
- Cihaz verileri işlendikten sonra, yeni bir bilgisayara .bam ve .vcf dosyaları aktarmak.
NOT: transposase parçalanma ayak izleri içermektedir. Sonuç olarak, yazılım otomatik olarak bu verileri düzeltir. - Cihaz analizi ile elde edilen çeşitli varyasyonlar toplayın.
- Üreticinin talimatlarını izleyerek başka bir yazılım (Alamut) ile ihraç dosyaları (.bam, .vcf) analiz. Sonra, iki analizde elde genetik varyasyonlar karşılaştırın. Sadece varyasyonlar iki sayılırlar algılanır.
Tablo 1. PCR koşulları
| Programı | Sıcaklık | Zaman | Num. Tekrarlama | |||
| 1 | 72 ° C | 3 dakika | 1 | 98 ° C | 30 saniye | 1 |
| 98 ° C | 10 sn | 10 | ||||
| 60 ° C | 30 saniye | |||||
| 72 ° C | 30 saniye | |||||
| 72 ° C | 5 dakika | 1 | ||||
| 10 ° C | sınırsız | |||||
| 2 | 95 ° C | 10 dakika | 1 | |||
| 93 ° C | 1 dakika | 1 | ||||
| 91 ° C | 1 dakika | 1 | ||||
| 89 ° C | 1 dakika | 1 | ||||
| 87 ° C | 1 dakika | 1 | ||||
| 85 ° C | 1 dakika | 1 | ||||
| 83 ° C | 1 dakika | 1 | ||||
| 81 ° C 1 dakika | 1 | |||||
| 79 ° C | 1 dakika | 1 | ||||
| 77 ° C | 1 dakika | 1 | ||||
| 75 ° C | 1 dakika | 1 | ||||
| 71 ° C | 1 dakika | 1 | ||||
| 69 ° C | 1 dakika | 1 | ||||
| 67 ° C | 1 dakika | 1 | ||||
| 65 ° C | 1 dakika | 1 | ||||
| 63 ° C | 1 dakika | 1 | ||||
| 61 ° C | 1 dakika | 1 | ||||
| 59 ° C | 1 dakika | 1 | ||||
| 58 ° C | 1 dakika | 16-18 saat | ||||
| 3 | 98 ° C | 30 saniye | 1 | |||
| 98 ° C | 10 sn | 10 | ||||
| 60 ° C | 30 saniye | |||||
| 72 ° C | 30 saniye | |||||
| 72 ° C | 5 dakika | 1 | ||||
| 10 ° C | sınırsız | |||||
| 4 | 95 ° C | 10 dakika | 1 | |||
| 95 ° C | 15 san | 40 | ||||
| 60 ° C | 1 dakika | |||||
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Örnek QC Sonuçlar
Hedef genlerin sekansları belirlemek için bu yöntemin özelliği gDNA (Şekil 2A) ve kalitesi tagmentation aşamasının kalitesine bağlıdır. Tagmentation (Şekil 2B, üst panel) yeterli değilse, sıralama tatmin edici olmayacaktır. Yukarıda zikredildiği gibi, tagmentation saflaştırmadan sonra, 300 bp civarında gDNA parçalarının çoğunluğu (Şekil 2B, alt panel) ile yaklaşık 1,000 bp'ye kadar olan 150 bp parça halinde tagmented olmalıdır.
Kütüphane oluşturma sonunda, kütüphane kalitesi BioAnalyser kullanılarak kontrol edilir. Elde edilen profil tagmentation sonrasında ancak parçalarının daha yüksek bir sayı (Şekil 2C) ile yaklaşık olarak aynı olmalıdır. Şekil 1C kütüphane kalitesi ile aynı değilse, sıralama yapılmamalıdır.
Sıralama başlattı sonrasıralama cihazı, kümeleme skoru 9 devresinden sonra mevcuttur ve 800.000 ve 1.100.000 kümeler / mm ² (Şekil 3A) arasında olmalıdır. Bu sayı daha düşük ise, özellikle de sekanslama okuma derinliği, tatmin edici olmayacaktır. Eğer daha yüksek olursa, görüntü (Şekil 3B) bulanık olacaktır, ve hiçbir analiz nedeniyle kümeleri ayırt etmek imkansızlığı yapılacaktır.
Çalışmasının sonunda, Kalite puanı kontrol etmek önemlidir. Yukarıda ayrıntılı protokolü takip ederek, koşmak kalite puanı Şekil 4'e karşılık gelecek. Dizileme kalitesi Q-skoru (Q-30) tarafından temsil edilmektedir. Üstün ya da 30 eşit Q-puan olmalıdır, dizileri (kümeler) en az% 75 civarında deney doğrulamak için.
Diziliş analizi sonuçlarından
Bu deney anayasa genetik anormallikler incelemek için tasarlanmıştır. Bu durumda, genetik anormallikler prgenomuna% 50 ESENT. Bu nedenle, sıralama derinliği çok önemli değildir. Bu yazıda, hazırlanan ve 11 tam genleri için aynı anda 12 hastanın 2 kütüphaneleri sıralandı. Yüksek sekanslama derinliği elde etmek için, birden fazla mesaj göndermiş hasta sayısında azalma olması gerekir. GDNA zenginleştirme sondaları ile yakalama dayalı olarak, zenginleştirme homojen (Şekil 5) değildir. Bizim protokol ile yaklaşık 6 Gb 150 ortalama kapsama uyaran, okur 20 minimum ve 330 okur maksimum ile, her üs için okur oluşturdu. Bu okuma kalınlıkları klinik uygulamada 11 NGS kullanımı ile uyumludur. Muhtemelen yakalama tarafından gDNA zenginleştirme nedeniyle, genlerin değil, önemli yeniden düzenleme okuma derinliklerinde, çeşitliliğine rağmen, böylece sıralama doğrulayarak, Q-skoru 30 zaman (Şekil 5) üstün olduğunu not etmek önemlidir.
Bununla birlikte, bu sonuç ile kıyaslanarak teknoloji doğrulamak için önemlidirSanger dizileme ile elde edilen elde s. Her iki Sanger sıralanması ile sıralanmıştır 17 hastada transposaz tabanlı teknoloji (BRCA1 ve BRCA2 dizileri kodlama), biz aynı 330 genetik varyasyonlar (SNP mutasyonlar) saptandı. Bir örnek olarak, BRCA1 geni içindeki bir nokta mutasyonu (sol Şekil 6) ve BRCA2 geninde 4 bazların (hakkı Şekil 6) bir silinme Sanger transposaz dayalı yöntemlerin her ikisi tarafından tespit edildi. BRCA1 kromozom 13 ters şeridi üzerinde olduğu gibi, bunun (sırasıyla düz dizi üzerinde) BRCA2 için, elde edilen dizi takviye edilmesi gerekmez, oysa dizisi elde güzelleştirmek (ancak ters olan) için gerekli olduğuna dikkat etmek önemlidir . Şekil 5'te belirtildiği üzere, Sanger yöntemi yok ise, NGS teknolojisi, bir genetik varyasyon tahmini frekansı verir. Ayrıca, özellikle indel varyasyonları için, yorumlanması NG ile daha kolayS teknolojisi. Şekil 6'da gösterildiği gibi, doğru indel varyasyon ileri dizileri ihtiyaçları ve eklenen veya silinen sekansı deşifre etmek için sıralama ters karıştırılmış bir Elektroforegramda olarak görünür. NGS analizleri ile, eklenen veya silinen sekansı, doğrudan böylece yanlış yorumlama riskini azaltır belirlenir. Son olarak, transposaz tabanlı teknoloji hedef genlerin daha fazla sayıda analiz için bize izin ve biz Sanger dizileme yer almayan birçok yeni genetik varyasyon dizileri bulundu. Bu sonuçlar başka yayınlanacaktır.
Şekil 1. prosedürünün şematik iş akışı. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. kalite kontrolleri öncesi ve kütüphane hazırlandıktan sonra. Güvenle tagmentation için kullanılabilir gDNA A. spektrofotometrik profili. DNA verimi daha yüksek 5 ng / ml, 260/280 ve 260/230 oranı sırasıyla, 1.8 ve 2 üstün olmalıdır olmalıdır. Tagmented gDNA'sından B. Fragment analizörü profilleri. Üst panelde, yetersiz gDNA tagmented temsil etmektedir. Alt paneli mükemmel tagmented örnek gösterir. Hazırlanan kütüphanede C. Fragment analizörü profilini sadece sıralama başlatılması önce. Fragman boyutu tagmented gDNA'sından (B, alt panel) gibi ancak yükseltilmiş bir miktar ile aynıdır. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
> 
Şekil 3. Denetimi küme nesil. Çalışması sırasında sıralama cihazın A. Ekran Görüntüsü. K / mm ². B. Farklı görüntüleri düşük yoğunluklu (üst panel), yüksek yoğunluklu (alt panel) ve mükemmel yoğunluğu (orta panel). Karşılık 800 ila 1,000 küme yoğunluğu olmalıdır , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız .
Şekil 4. Q-skoru denetleniyor. Seferin sonunda, valide sıralama 30 üstün bir Q-puanı ile oluşturulan kümelerin en az% 75 olmalıdır.jpg "target =" _blank "> Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5. Temsil kapsamı veriler ve bunlara karşılık gelen Q-skoru. Okuma derinliği tüm kaplı gen boyunca heterojen. Bununla birlikte, kapalı bölgelerin Q-skor Q-30 her zaman üstündür. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Sanger dizileme ile transposaz tabanlı teknoloji ile elde edilen Şekil 6. Temsilcisi sonuçları. Sanger dizileme ile gözlenen tüm genetik varyasyonlar d edilditransposaz tabanlı teknoloji ile etected. Nokta mutasyonları yorumlamak kolay iken, indel değişiklikler bazen Sanger yöntemi ile çalışmak oldukça zordur. Orta çıktı aygıtı ile ilişkili transposaz tabanlı teknoloji ile, indel değişiklikler keşfetmek için basit. Bununla birlikte, hedef gen eksi iplikçik (burada BRCA1 geni) üzerinde bulunan zaman serileri elde tamamlayacak (ama ters değil) gerekli olduğuna dikkat etmek önemlidir. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NGS cihazların ve teknolojilerin yaygın kullanımı kanser ve genetik bozuklukların çalışmada yeni fırsatlar sunmuştur. Tüm genom sekanslaması ya da RNA sıralamasına ek olarak, çok sayıda hasta için seçilen gDNA dizilerinin büyük bir miktarda analizi aynı anda tan büyük potansiyel sunmaktadır. Burada, bir orta verim sıralama cihazı (Malzeme / Ekipman Tablo) ile eş zamanlı olarak 24 hastada 11 tam genlerin çalışma NextEra teknolojisini kullanarak (talep üzerine mevcuttur) belirli bir tasarım geliştirdi. Bu protokol hata riski düşük olan hastaların kaygılarına hızlı bir yanıt sağlayan veri hızlı üretimi sağlar. Şekil 6'da gösterildiği gibi, Sanger dizileme ile tespit edilen tüm genetik varyasyonları da transposaz tabanlı hazırlama kiti kullanılarak tespit edildi. Bu yöntem özellikle direkt olarak analiz karmaşık indel değişiklikler için, güvenilir ve yorumlamak kolaydır. Yine de, bu önemlieksi iplikçik bulunan genler için, nucleotidlerin (ters olmadan) tamamlamak için gerekli olduğunu unutmayın. Bu çalışma, 11 tam genlerin analizi için bir tasarım ile gerçekleştirilmektedir, ancak protokol tasarım tercih ne olursa olsun aynıdır edildi. Transposaz bazlı teknoloji, aynı zamanda, uzun menzilli PCR ürünlerinin 12 kütüphane hazırlanması için kullanılabilir. Nitekim, (üretici tarafından geliştirilen) algoritma tasarımı için kullanılan özel olarak bu protokol için adamıştır (üretici et aracı, Malzeme / Ekipman bkz: İçindekiler). Ayrıca teknoloji transposase tabanlı, ayrıca mevcut kütüphane hazırlanmasından önce DNA parçalanmasının diğer iki mekanizma: mekanik parçalanma ve enzimatik parçalanma. Mekanik DNA fragmantasyonu yeniden üretilebilir ancak ultrasonikatör ihtiyacı ve kütüphane hazırlanması daha pahalı ve zaman alıcıdır. Enzimatik DNA fragmantasyonu, genellikle elde edilen, bağlı bir kısıtlama enzim yerle DNA yakalama sorunları indüklerHedef dizi kapsama eksikliği. Bununla birlikte, DNA parçalanması için her strateji avantajları ve dezavantajları vardır ama en azından uzun menzilli PCR ürünü parçalanma 13, oldukça benzer sonuçlar verecek gibi görünüyor. Yeni bir enzim kokteyli kullanımı, mekanik, DNA parçalanması 14 ile elde edilen ile aynı sonuçları temin gibiydi. Transposase tabanlı teknoloji, yüksek kalitede DNA (FFPE dokulardan çıkarılan DNA için geçerli değil) ihtiyacı var. Ayrıca, transpozazın aktivitesi ilgi fragmanları bu uzunluğundan daha uzun olması gerektiğini göstermektedir, 300'den bp parçalarını gerektirir. Bu özgüllük yüksek kaliteli, un parçalanmış DNA için ihtiyaç açıklar.
Şimdiye kadar, BRCA1 ve BRCA2 genetik varyasyonlar, ailesel meme ve yumurtalık kanserlerinde çalışılmıştır. Ancak, BRCA genleri ve özellikle BRCA2 tutulumu, şimdi özellikle pankreas 15, prostat içinde, diğer kanserlerde şüphesi16 ve testis kanserleri 17. PALB2, BRCA gen bir ortağı, bir genetik değişim pankreas kanseri 18 ile bağlantılıdır. Ayrıca, son zamanlarda hasta BRCA mutasyonları barındıran, ve bir dereceye PALB2 mutasyonlara, PARP inhibitörleri 19 kendi pankreas kanseri daha iyi bir yanıt göstermiştir ortaya çıktı. BRCA1, BRCA2 ve PALB2 kanseri ailesel riski ile ilişkili, ve muhtemelen özel tedaviler yatkınlıkla ilişkili gibi, ailesel kanser riski ve kanser tedaviye yanıt taramasında taramasında BRCA1 ve BRCA2 ortakları keşfetmek için önemli görünmektedir.
Bu verilerden, bir DNA kırık onarımı ile ilgili genlerin analizi duyarlılık elenmesi için değil, aynı zamanda tedaviye yanıt farazi bir gösterge için sadece önemli olduğu görülmektedir. Ayrıca bu protokol ile önerilen tam gen analizi yapıl olabilirBu yükselticisinde mutasyonu, birleştirme bölgelerinin ya da intronlar bulunan düzenleyici birleştirme bölgelerinin olarak doğuştan mevcut olan (ve kanser hücrelerinde bulunan) olabilir er tüm iyileştirmeleri,. Bugüne kadar, genlerin kodlamayan sekanslar değişiklikler derinlemesine çalışılmamıştır, ancak genom dernek çalışmaları gelişme bu dizilerin önemli işlevleri vurgulamak olabilir.
Sonuç olarak, bu çalışmada geliştirilen transposaz-tabanlı tasarım DNA hasarı tamir katılan kansere yatkınlık genleri genetik anormallikler keşfetmek için ilginç bir yoldur. 24 hasta için 11 tam genleri sıralamak için olasılık aynı anda tarama için oldukça zor bir tekniktir Sanger dizileme yöntemi ile karşılaştırıldığında önemli bir avantajdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MiSeq | Illumina | SY-410-1001 | Sequencing/medium throughput device |
| Nextera Enrichment kit | Illumina | FC-123-1208 | Transposase based technology |
| 300 cycle cartridge | Illumina | 15033624 | |
| AMPure beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic purification beads |
| Magnetic stand | Alpaqua | A32782 | |
| 96-well Plates | Life Technologies | 4306737 | |
| MIDI 96-well plates | Biorad | AB0859 | |
| Microseal A | Biorad | MSA-5001 | This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment |
| MiSeq | Illumina | Provided with the sequencing device Experiment Manager software Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new Manufacturer website tool |
References
- Cornelisse, C. J., Cornelis, R. S., Devilee, P. Genes responsible for familial breast cancer. Pathol. Res. Pract. 192 (7), 684-693 (1996).
- Culver, J., Lowstuter, K., Bowling, L. Assessing breast cancer risk and BRCA1/2 carrier probability. Breast Dis. 27, 5-20 (2007).
- Cox, D. G., et al. Common variants of the BRCA1 wild-type allele modify the risk of breast cancer in BRCA1 mutation carriers. Hum. Mol. Genet. 20 (23), 4732-4747 (2011).
- Maia, A. T., et al. Effects of BRCA2 cis-regulation in normal breast and cancer risk amongst BRCA2 mutation carriers. Breast Cancer Res. 14 (2), 63 (2012).
- Anczuków, O., et al. BRCA2 deep intronic mutation causing activation of a cryptic exon: opening toward a new preventive therapeutic strategy. Clin. Cancer Res. 18 (18), 4903-4909 (2012).
- Brewster, B. L., et al. Identification of fifteen novel germline variants in the BRCA1 3'UTR reveals a variant in a breast cancer case that introduces a functional miR-103 target site. Hum. Mutat. 33 (12), 1665-1675 (2012).
- Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nat Rev Cancer. 12 (1), 68-78 (2012).
- Ma, X. D., et al. First evidence for the contribution of the genetic variations of BRCA1-interacting protein 1 (BRIP1) to the genetic susceptibility of cervical cancer. Gene. 524 (2), 208-213 (2013).
- Haanpää, M., Pylkäs, K., Moilanen, J. S., Winqvist, R. Evaluation of the need for routine clinical testing of PALB2 c.1592delT mutation in BRCA negative Northern Finnish breast cancer families. BMC Med. Genet. 14, 82 (2013).
- Southey, M. C., Teo, Z. L., Winship, I. PALB2 and breast cancer: ready for clinical translation. Appl. Clin. Genet. 6, 43-52 (2013).
- Ulahannan, D., Kovac, M. B., Mulholland, P. J., Cazier, J. B., Tomlinson, I. Technical and implementation issues in using next-generation sequencing of cancers in clinical practice. Br. J. Cancer. 109, 827-835 (2013).
- Hernan, I., Borràs, E., de Sousa Dias, M., Gamundi, M. J., Mañé, B., Llort, G., Agúndez, J. A., Blanca, M., Carballo, M. Detection of genomic variations in BRCA1 and BRCA2 genes by long-range PCR and next-generation sequencing. J. Mol. Diagn. 14, 286-293 (2012).
- Knierim, E., Lucke, B., Schwarz, J. M., Schuelke, M., Seelow, D. Systematic comparison of three methods for fragmentation of long-range PCR products for next generation sequencing. Plos One. 6, e28240 (2011).
- de Sousa Dias, M., Hernan, I., Pascual, B., Borràs, E., Mañé, B., Gamundi, M. J., Carballo, M. Detection of novel mutations that cause autosomal dominant retinitis pigmentosa in candidate genes by long-range PCR amplification and next-generation sequencing. Mol. Vis. 19, 654-664 (2013).
- The Breast Cancer Linkage Consortium. Cancer Risks in BRCA2 Mutation Carriers. J. Natl. Cancer Inst. 91, 1310-1316 (1999).
- Levy-Lahad, E., Friedman, E. Cancer risks among BRCA1 and BRCA2 mutation carriers. Br. J. Cancer. 96 (1), 11-15 (2007).
- Risch, H. A., et al. Population BRCA1 and BRCA2 mutation frequencies and cancer penetrances: a kin-cohort study in Ontario, Canada. J. Natl. Cancer Inst. 98 (23), 1694-1706 (2006).
- Slater, E. P., et al. PALB2 mutations in European familial pancreatic cancer families. Clin. Genet. 78, 490-494 (2010).
- Brennan, G. T., Relias, V., Saif, M. W.
