Ein In-vitro- Modell für die Untersuchung der zellulären Pathophysiologie in Globoidzell- Leukodystrophie

Summary

Globoidzellen sind ein definierendes pathologisches Merkmal der Krabbe-Krankheit, einer Leukodystrophie, für die es derzeit keine wirksame Langzeittherapie gibt. Wir haben ein Zellkulturmodell entwickelt, um die angeborene Biologie und das pathogene Potenzial aktivierter Mikroglia und ihre Umwandlung in Globoidzellen zu untersuchen.

Abstract

Die genaue Funktion der Mehrkern Mikroglia genannt Globoidzellen, die im Zentralnervensystem Globoidzell Leukodystrophie (GLD) eindeutig reichlich sind, ist unklar. Diese Wissenslücke wurde durch den Mangel eines geeigneten in vitro-Modell zur Untersuchung behindert. Hier beschreiben wir einen primären murinen Gliazellen Kultursystem, in dem die Behandlung mit Psychosin ergibt multinucleation der Mikroglia ähnlich den Kenn Globoidzellen in GLD gefunden. Mit diesem neuartigen System definierten wir die Bedingungen und Formen der Analyse für das Studium der Globoidzellen. Die mögliche Verwendung von diesem Modellsystem wurde in unserer vorherigen Studie, die eine mögliche Rolle für die Matrix-Metalloproteinase (MMP) identifiziert validiert -3 in GLD. Diese neuartige in vitro-System kann ein nützliches Modell, in dem die Bildung und Funktion, sondern auch die potentielle therapeutische Manipulation dieser einzigartigen Zellen zu studieren.

Introduction

Globoidzell Leukodystrophie (GLD), auch als Morbus Krabbe genannt, ist eine tödliche demyelinisierende Krankheit von Funktionsverlust-Mutationen in der galatocerebrosidase (GALC) Gen ¹ resultieren. Die am weitesten verbreitete Form der GLD ist die Kinder-Variante, die von Beginn in der frühen Kindheit und typisiert wird, gekennzeichnet durch einen aggressiven klinischen Verlauf der motorischen und kognitiven Rückgang führt zu vorzeitigem Tod oft vor Ablauf von fünf Jahren ^2,3. Genetische Tests wird verwendet, um eine Diagnose der GLD ⁴ überprüfen. Neuropathologie der GLD enthüllt weit verbreitete Demyelinisierung, neuronale Atrophie, Astrogliose und Gegenwart angeschwollen mehrkern Mikroglia genannt Globoidzellen ^5-7. Die Identifizierung von Globoidzellen, oft tubulous Einschlüsse in ihrem Zytoplasma enthält, hat in den letzten 97 Jahre zu einem prägenden Merkmal der GLD, obwohl die spezifische Funktion dieser Zellen ist auffällig vor schwer.

Die Beteiligung von Nicht-MYELUrsprung Gliazellen (Astrozyten und Mikroglia) in der Pathogenese der GLD ist seit langem als eine sekundäre Reaktion auf die tiefgreifenden Demyelinisierung bei dieser Erkrankung ^8. Interessant ist, dass die erste Beschreibung dieser Krankheit, von Knud Krabbe 1916 ⁵ gemacht, berichtete die Bildung von mehrkernigen Phagozyten, lipidhaltigen Ablagerungen, die genannt worden 'Globoidzellen' und sind ein charakteristisches Merkmal dieser Krankheit.

Globoidzellen sind das Markenzeichen Merkmal der GLD Pathologie, obwohl ihre Rolle in der GLD ist seit langem ignoriert. Interessanterweise sind diese Zellen zu den ersten charakteristischen Veränderungen in ZNS-Gewebe von GLD. Dieser Mangel an Wissen kann auf der Annahme, daß die Bildung von vielkernigen Phagozyten genannte Riesenzellen bei anderen Krankheiten, werden typischerweise als eine Folge der Pathologie als eher als eine anfängliche Antriebskraft pathogenen ⁹ gewesen. Daher gibt es nur wenige Studien zur Untersuchung des Mechanismus, durch WHICH Globoidzellen von Phagozyten insbesondere im ZNS von GLD gebildet. Die in diesem Bericht beschriebenen Verfahren konzentriert sich auf die Bedeutung der Globoidzell Bildung im ZNS und unseren bisherigen Nachweis, dass Psychosin-induzierte multinucleation der Mikroglia in vitro und diese Zellen zeigten höhere Phagozytose. In Übereinstimmung mit diesen Beobachtungen, Globoidzellen in twitcher Gehirne enthalten häufig PAS-positive Ablagerungen, was hohe Phagozytose. Globoidzellen finden sich auch immun für Ferritin zu sein (a Mikroglia-Marker) ^10, KP-1 / CD68 (a Monozyten-Marker), und einige sind auch positiv für Vimentin (ein Zwischen Filament-Protein und Marker für Astrozyten und aktivierte Mikroglia) ^11, HLA-DRa (ein MHCII Oberflächenrezeptor) und TNF-α ⁷ und Iba-1 (ein Calcium-Bindungsprotein verwendet, um zu identifizieren Mikroglia) ^12. Auf der Grundlage dieser Sammlung von Markern, Globoidzellen stammen aus Mikrogliazellen, die sich entwickelnein einzigartiges Phänotyp.

Trotz ihrer Einzigartigkeit wurde die spezifische Funktion und der Beitrag der GCs zu GLD Pathogenese weitgehend übersehen. Globoidzellen haben gedacht worden, um eine sekundäre Folge der chronischen Demyelinisierung sein. Allerdings ist durch frühere Studien, die die zeitliche Assoziation von Globoidzellen auf der weißen Substanz Pathologie der GLD die Anwesenheit von Globoid Zellen in der späten embryonalen frühen postnatalen Zeit identifiziert; mal vorstehenden Oligodendrozytenapoptose und offene Demyelinisierung ^13. Somit wird die zeitliche Abfolge der Entwicklung der Neuropathologie in GLD legt nahe, dass Globoidzellen im Voraus der Demyelinisierung bei dieser Erkrankung ¹⁴ ausgebildet. Dies führte zu unserer Hypothese, dass die frühe Bildung von Globoidzellen in GLD kann eine Definition von pathogenen Veranstaltung eher als eine sekundäre, reaktive Antwort auf Oligodendrozyten-Schaden ¹⁵ stellen. Zusätzlich Dysregulation der Mikroglia-Aktivität in GLD ist als ein factor Begrenzung der Langzeitwirksamkeit von hematopeotic Stammzelltherapien für die Behandlung dieser Krankheit ^16. Somit untersucht die Zellfunktionen und Regeln der Mikroglia und Globoidzellen in Reaktion auf Psychosin soll neue Einblicke in die Pathogenese von GLD ist.

Bis vor kurzem war das Fehlen eines geeigneten Modells, in dem Globoidzell Bildung zu untersuchen, das Verständnis der genauen Funktion und der Beitrag dieser Zellen zu der Pathologie der GLD beschränkt. In neueren Studien wurde festgestellt, dass Globoid-ähnlichen Zellen können als direkte Reaktion gebildet, um Psychosin, eine pathogene Lipid Toxin, das in GLD sammelt werden. Wir fanden, dass Mikroglia, aber nicht Makrophagen, aktiviert und in Reaktion in Globoidzellen in der Grund Gliakulturen transformiert, um Psychosin ^15. Die Umwandlung in Globoidzellen wurde gefunden, durch die extrazelluläre Protease, die Matrix-Metalloproteinase (MMP) -3 ¹⁵ vermittelt werden. In jüngerer Zeit haben wirhaben diese Ergebnisse, dass Psychosin-aktivierte Mikroglia und Globoidzellen in dieser In-vitro-Modellsystem entwickelt, erweitert und bestimmt sind potent giftig für Oligodendrozyten und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen. Daher wird, wenn im Rahmen der GLD, der frühen Anhäufung von Psychosin und Bildung Globoidzellen vor Demyelinisierung würde eine aufstrebende primären und möglicherweise pathogene Rolle für Mikroglia bei dieser Krankheit unterstützt betrachtet.

Wir schlagen vor, dass die Studie von Globoidzell Bildung wird neue Informationen über die Pathogenese der GLD, die zum Verständnis dieser Krankheit beitragen wird offenbaren. Darüber hinaus kann dieses neue Modell der zellulären GLD ein neues Format, aus denen neue therapeutische Ansätze zur Adresse pathologischen Veränderungen bei dieser Erkrankung getestet werden könnten. Daher wird in diesem Bericht stellen wir ein detailliertes Protokoll für die in vitro Entwicklung von Psychosin induzierte Globoidzellen aus Primärkulturen von nicht-myelinisierenden Glia.

Protocol

Alle Verfahren, die Tiere wurden in Übereinstimmung mit der Politik auf humane Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt durch das Amt für Labortierschutz (NIH), und nur mit Zustimmung des Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) der Universität dargelegten Connecticut Health Center.

1. Herstellung der Misch Gliakulturen

1. Sterilisieren alle Instrumente vor der Verwendung. 3 ml eiskaltem, sterilen ausgewogener Hank-Salzlösung (HBSS), die keine Kationen (Mg ^{2 +} oder Ca ^{2 +)} zu drei sterile 60 mm Petrischalen auf Eis gehalten kalt zu halten.
2. Isolieren Sie die Rinden von postnatalen P0-P2 Maus Welpen, wie zuvor beschrieben, ^17,18.
   HINWEIS: subkortikalen Strukturen, wie Hippocampus, sind nicht in diesen Kulturen enthalten.
3. Entfernen Sie vorsichtig die Hirnhaut und übertragen dann die isoliert Kortex an die frische HBSS und distanzieren die Gewebe enzymatisch mit einem neural Gewebedissektion Kit nach Vorschrift des Herstellers.
4. Platte die Zellen in sterile T-175-Kolben beimpft und über Nacht in den Medien [Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fetales Rinderserum (FBS) mit 1x Penicillin / Streptomycin].
5. Ersetzen Sie alle Medien am nächsten Tag mit frischen Medien. Weiterhin Kulturen inkubiert, mit regelmäßigen Medienwechsel, für ca. 3 Wochen oder bis ein Mobilmonoschicht etabliert.
   HINWEIS: 1-Verhältnis ^19: Diese Monoschicht wird von Astrozyten und Mikroglia mit einer etwa 10 bestehen.

2. Globoidzell- Induktion im gemischten Gliakulturen

1. Bereiten Sie die ECM-beschichtete Deckgläser.
   1. Einweichen Kreisdeckgläser mit steriler 1 N Salzsäure (HCl) in einer sterilen Petrischale für 30 min. Waschen Deckgläser mit sterilem Wasser 3x und dann in 95% EtOH einweichen für mindestens 20 min. und lassen Sie dann an der Luft trocknen.
   2. Ort Tröpfchen verdünnter extrazellulären matrix (ECM) Protein Beschichtungsmaterialien auf ein Blatt Parafilm (zB 150-250 ul / Tröpfchen von Laminin 10 ug / ml in steriler Phosphat-Pufferlösung [PBS]). Verteilen Sie die Tröpfchen, so dass Deckgläser nicht berühren, wenn sie auf dieser Tröpfchen platziert. Stellen sanft getrocknet jedes Deckglas auf einem Tröpfchen mit einer Pinzette.
   3. Lassen Sie die Deckgläser an den Tröpfchen für ca. 4-6 Stunden in der Kultur Kapuze mit geschlossenem Frontschieber.
   4. Platzieren Sie die ECM-beschichtete Deckgläser (ECM-beschichtete Seite nach oben) in jede der Vertiefungen einer 24-Well-Platte. Waschen Sie jede Vertiefung mit sterilem PBS 3x und halten bei 4 ° C, bis sie benötigt.
2. Vorbereitung Gliazellen für die Beschichtung auf Deckgläser.
   1. Saugen Sie das Medium von den Gliazellen Kulturen und vorsichtig waschen die Glia-Monolayer 3x mit 10 ml sterilem PBS. Als Nächstes fügen 8-10 ml Trypsin-EDTA-Lösung zu dem T-175 und Inkubation für 5-10 min bei 37 ° C aufweist.
   2. Wenn die meisten der Monoschicht abgelöst wurde, 20 ml Vollmediumin den Kolben zu Trypsinierung zu stoppen. Sammeln Sie die Medien, die die abgelösten Zellen in ein 50 ml konischen Röhrchen und Spin für 10 min bei 300 g bei Raumtemperatur.
   3. Saugen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören, und dann wieder die Zellen in 2 ml frischem Vollmedium durch vorsichtiges Pipettieren die Lösung mit dem P1000 Pipette.
   4. Bestimmen der Anzahl der Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und resuspendieren Zellen in Komplettmedium bei der gewünschten Dichte (beispielsweise 10 ⁵ Zellen / ml). Platte der Zellen auf den ECM-beschichtete Deckgläser (zB 500 ul in jede Vertiefung der 24-Well-Platte). Hinzufügen zusätzlicher frischem Komplettmedium zu jeder Vertiefung für 3-5 Tagen Inkubation bei 37 ° C, oder bis die Zellen wachsen, um die gewünschte optische Konfluenz.
3. Behandlung mit Psychosin.
   1. Die Rekonstitution der Psychosin in eine Aktienkonzentration (108,3 mM) in Dimethylsulfoxid (DMSO). Verdünnen diese Aktie in 100% EtOH, eine Arbeits Lager machen, dass der CANn in jede Vertiefung der 24-Well-Platte gegeben, um eine Endkonzentration von 10 uM zu erzielen.
   2. Zum Zeitpunkt der Zugabe des Psychosin, schwenken Sie die Kulturplatte, die Psychosin in Kulturmedien zu mischen. Ergänzung der Psychosin, indem das Äquivalent von 10 uM jeden zweiten Tag für eine Woche.
4. Nach 7 Tagen Psychosin Behandlung, sammeln die Medien und die Pipette 500 ul kaltem 4% Paraformaldehyd (PFA) in jedes Well. Inkubieren bei Raumtemperatur für 20 min, um die Zellen zu fixieren. Dann waschen Sie jedes Well 3x mit PBS und dann halten Platten bei 4 ° C bis zur Immunzytochemie verarbeitet werden (siehe unten).
   HINWEIS: Zellkulturmedien für enzymatische oder ELISA-Test an dieser Stelle auf Wunsch abgeholt werden.

3. Immunzytochemie (ICC) zu Globoid Zellen sichtbar

1. Ersetzen PBS mit Blockierungspuffer [PBS + 0,3% Tween-20 + 5% normalem Ziegenserum (NGS)], und Inkubieren der Zellen für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
2. Incubate der fixierten Zellen in primären Antiseren gegen Iba-1 [(1: 1.000) in PBS + 0,3% Tween-20 + 2% NGS] für mindestens 1 h bei Raumtemperatur, dann waschen jedes Well mit PBS 3x 5 min / waschen.
3. Fügen Sie den entsprechenden sekundären Fluoreszenz-konjugierte Antikörper, um die primäre Antikörpermarkierung und Gegenfärbung mit 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, 1: 1.000) zu identifizieren, um Kerne zu identifizieren. Inkubieren sekundären Antikörper-Lösung 1 h bei Raumtemperatur und Waschen mit PBS 3x 5 min.
4. Montieren Sie je Deckglas auf Objektträger unter dem Mikroskop Montagemedium. Blick gleitet auf einem Fluoreszenzmikroskop für die visuelle und quantitative Analysen.

4. Analyse und Charakterisierung von Globoidzellen in Primärkultur

1. Verwenden Sie die folgenden drei morphologischen Kriterien, um eine Globoidzell in Kultur zu identifizieren:
   1. Identifizieren Globoidzellen mit Fluoreszenzmikroskopie von immun Kennzeichnung für die Mikroglia-Marker Iba-1 +.
   2. IdentifizierenGloboidzellen als kernigen (dh, zwei oder mehr DAPI positiven Kernen).
   3. Identifizieren Globoidzellen durch eine abgerundete Morphologie unterscheidet sich von der stark verzweigten Aussehen von ruhenden Mikrogliazellen.
      Hinweis: Zellen können auch für Zelloberflächenmarker-Analyse und Quantifizierung mittels Durchflusszytometrie aus diesen Kulturen gesammelt werden.
2. Messung der phagozytierenden Aktivierung der Mikroglia und Globoidzellen
   1. Um die phagozytische Aktivität von Psychosin behandelten Mikroglia beurteilen, fügen FITC-markierten Latexkügelchen auf die Vertiefungen in Übereinstimmung mit den Anweisungen des Herstellers. Fügen fluoreszierende Latexkügelchen-konjugierten 48 Stunden vor der Fixierung mit PFA. Fix Zellen mit Perlen behandelt (wie in Abschnitt 2.4 erwähnt), und ein Verfahren zur Immunzytochemie (wie in Abschnitt 3 beschrieben).
   2. Wählen Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper, so daß sie das Fluoreszenzemissionsspektrum des Fluorophors markierten Kügelchen nicht überlappen.
   3. Analyze die phagozytotische Profile der Iba-1 + Mikroglia durch die Identifizierung die Zellen, die Co-Lokalisation mit den fluoreszenzmarkierten Perlen.
      HINWEIS: Psychosin wird Mikroglia zu aktivieren. Phagozytierten Perlen innerhalb einkernigen und mehrkernigen Iba-1 + Zellen in dieser Kultur Einstellung identifiziert werden.

5. Induktion von Globoidzellen aus gereinigten Mikroglia Kulturen

HINWEIS: Ein alternativer Ansatz zur interzellulären Signal zwischen dem Astrozyten und Mikroglia zu entziffern ist ein weiterer Vorteil dieses in vitro Globoidzell Modell. Reinigung von primären Mikrogliazellen für Replattierung oder Co-Kultivierung können durch ihre Unterhalten Immobilie in Kultur erreicht werden, wie in den folgenden Schritten (siehe Abschnitt 5.2) beschrieben.

1. Sammeln Sie die Medien aus den zusammenfließenden Misch Gliakulturen in 50 ml konischen Röhrchen und pflegen sie in den Brutschrank bei 37 ° C.
2. Mikroglia-Isolierung aus Primär Mixed Gliakulturen.
   1. Nach dem Entfernen der Medien aus einer konfluenten gemischten Gliazellen Kultur T175 Kolben gemischt, warmen Schütteln Medien [bestehend aus kompletten Medien + 25 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) + 25 mM Natriumhydrogencarbonat (Sigma)]. Schütteln Sie die Flaschen für 3-4 h in einem Orbitalschüttler bei 100 Upm (37 ° C). Sammeln Sie die Medien aus diesen Schüttelkolben in 50 ml konischen Röhrchen.
      HINWEIS: Diese Medien werden die weniger haft Mikroglia aus den Flaschen gehören.
   2. Drehen Sie die Medien bei 300 g für 10 min bei Raumtemperatur. Saugt den Überstand und resuspendiere die Zellen in 2 ml des Astrozyten-konditioniertem Medium (in Schritt 5.1 gesammelt).
   3. Stellen Sie die Anzahl von Zellen mit einer Zählkammer und dann die Platte Mikroglia-Zellen auf das Substrat-beschichtete Deckgläser erworben (siehe Abschnitt 2.1) für Immunzytochemie oder Platte auf UltraLow ​​Einhaltung Well-Platten für die künftige Sammlung von Globoidzellen für Co-Kultur mit anderen Zelltypen, wie Oligodendrozyten (als absteigendim folgenden Abschnitt ribed).
      HINWEIS: Sobald die Mikroglia vergoldet mit Psychosin (10 uM) wie oben beschrieben (siehe Abschnitt 2.3) behandelt werden.
3. Co-Kultur mit primären Oligodendrozyten für die Analyse der Zytotoxizität.
   HINWEIS: Sammlung von Psychosin behandelten Mikroglia von den niedrigen Einhaltung Platten für die spätere Co-Kultur auf Primärkulturen von Oligodendrozyten oder Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, können verwendet werden, um das Potenzial zytotoxische Funktion dieser Globoid-ähnliche Zellen in vitro zu untersuchen.
   1. Entwickeln Kulturen von primären Oligodendrozyten mit etablierten Methoden ^18,20. Um die Psychosin behandelten Mikroglia sammeln, vorsichtig pipettieren, um die lose anhaftenden Zellen vom Boden der Wells zu lösen. Sammeln Sie die Zellen, Zentrifuge bei 300 g für 10 min, und dann sorgfältig in Oligodendrozyten-Differenzierung Medien [von Neurobasal Medien zusammen zu suspendieren, L-Glutamin (1x), B-27 Ergänzung (1x) und Trijodthyronin (T3, 10 ng / ml )].
   2. Die Anzahl der Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und dann Samen der Mikroglia auf die Oligodendrozyten-Kultur bei 1 x 10 ⁵ Zellen / ml, was eine ungefähre 1: 2 Mikroglia / Oligodendrozyten-Verhältnis. Inkubieren als Co-Kultur für bis zu 3 Tagen.
   3. Befestigen Sie die Zellen, die für Immunzytochemie (siehe Abschnitt 2.4). Sammeln Zellkulturmedien für ELISA oder chemische Analysen, wie gebraucht.

Results

Dieses Protokoll, wie geschrieben, wird erwartet, dass etwa 36 Tage, um von Anfang bis Ende (siehe Abbildung 1: Experimentell Workflow-Schema) zu vervollständigen. Es ist unsere Erfahrung, dass die Entwicklung von "Globoid-like 'Zellen in dieser Primärkultur-System ist zuverlässig und reproduzierbar: die Bildung von vielkernigen Zellen in Reaktion auf Psychosin konsequent mit 7 Tagen der Behandlung beobachtet.

Immunzytochemische Färbung der Mikroglia mit Iba-1 in Verbindung ...

Discussion

Das hierin beschriebene Protokoll sieht ein neues Modellsystem, in dem die Entwicklung und funktionelle Charakterisierung von aktivierter Mikroglia und Globoidzellen studieren. Frühere Arbeiten von Im et al. mit einer HEK293-Zelllinie ein Template für die Entwicklung des vorliegenden Protokolls für das Studium der Globoidzell Bildung ^21. Es ist auch wichtig, darauf hinzuweisen, dass die Globoidzellen im Modell abgeleitet von den nativen Globoidzellen identifizierbar GLD abweichen. Zum Beispiel haben ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hank' s ausgewogene Salzlösung (HBSS), die keine Kationen (Mg2+ und Ca2+) enthält.	Lebenstechnologien	14175-095
Dissoziationskit für neuronales Gewebe	Miltenyi	130-092-628
40 μ m Schmutzfänger	Fisherbrand	22363547
Hank' s ausgewogene Salzlösung (HBSS), die Kationen (Mg2+ und Ca2+) enthält.	Gibco	14025-092
Dulbecco's modifiziertes Adlermedium (DMEM)	Gibco	11995-065
fötales Rinderserum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
Penicilin/Streptomycin	Life technologies	15070-063
Laminin	Sigma	L2020
Trypsin-EDTA-Lösung	Life technologies	25299-056
Psychosin	Sigma	P9256
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma	D2650
Paraformaldehyd (PFA)	Elektronenmikroskopie Wissenschaft	19208
Normales Ziegenserum (NGS)	Invitrogen	PCN5000
Iba-1	WAKO	019-19741
Alexa Fluor konjugiert antisera	Life Technologies	Various
Mounting	Media Southern Biotech	OB100-01
Phagocytic Assay Kit	Cayman Chemicals	500290
HEPES	Sigma	BP310-500