Methodenartikel

Sammlung, Isolierung, und Durchflusszytometrische Analyse der Menschen Endozervikale Proben

DOI:

10.3791/51906

⸱

6. Juli 2014

 ,  ,  , 
1Department of Medical Microbiology, University of Manitoba, 2Department of Community Health Sciences, University of Manitoba

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Verwendung von Zytobürstenproben zur Entnahme von Lymphozyten und Monozyten aus dem Endozervix ist eine minimalinvasive Technik, die Proben für die Analyse der Immunität des weiblichen Genitaltrakts liefert. In diesem Protokoll beschreiben wir die Entnahme von Zytobürstenproben und die Isolierung von Immunzellen für Durchflusszytometrie-Assays.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trotz der Bedeutung von Schleimhauterregern (einschließlich HIV) für die öffentliche Gesundheit ist relativ wenig über die Immunität der Schleimhäute bekannt, insbesondere im weiblichen Genitaltrakt (FGT). Da die heterosexuelle Übertragung heute den dominierenden Mechanismus der HIV-Übertragung darstellt und sich sexuell übertragbare Infektionen (STIs) kontinuierlich ausbreiten, ist es wichtig, das Zusammenspiel zwischen Wirt und Erreger an der Genitalschleimhaut zu verstehen. Die erheblichen Wissenslücken rund um die FGT-Immunität sind zum Teil auf die Schwierigkeit zurückzuführen, Schleimhautproben erfolgreich zu sammeln und zu verarbeiten. Um Studien mit ausreichender Stichprobengröße zu ermöglichen, müssen die Entnahmetechniken minimalinvasiv und effizient sein. Zu diesem Zweck wurde ein Protokoll für die Entnahme von zervikalen Zytobürstenproben und die anschließende Isolierung von zervikalen mononukleären Zellen (CMC) optimiert. Mit Hilfe der ex vivo Durchflusszytometrie-basierten Immunphänotypisierung ist es möglich, die Häufigkeiten und Phänotypen von CMC-Lymphozyten/Monozytenpopulationen genau und zuverlässig zu quantifizieren. Diese Technik kann mit der Entnahme von zervikal-vaginaler Lavage (CVL) gekoppelt werden, die lösliche Immunmediatoren wie Zytokine, Chemokine und Antiproteasen enthält, die alle zur Bestimmung des anti- oder entzündungsfördernden Milieus in der Vagina verwendet werden können.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Mehrheit der HIV-Neuinfektionen weltweit durch heterosexuelle Übertragung entstehen, mit Frauen, die 47% der Neuinfektionen im Jahr 2011 (UNAIDS 1). Das Verständnis der weiblichen Genitaltraktes (FGT), einer der Haupteingangsportale für HIV und andere sexuell übertragbare Erreger, ist von großer Bedeutung auf dem Weg zur Suche nach effizienten Strategien, um Infektionen zu vermeiden. Immunantworten im Genitalschleimhaut deutlich einzigartig und unterscheiden sich von denjenigen im peripheren Blut 2 gemessen. Allerdings ist die Kenntnis der aktuellen Immundynamik an der FGT allenfalls begrenzt. Bisher haben Studien der Schleimhautimmun Umwelt....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ethik-Erklärung: Die Forschungsethik Vorstand von der Universität von Manitoba und Kenyatta National Hospital / University of Nairobi genehmigt diese Studie und eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von allen Studienteilnehmern erhalten.

1. Vorbereitung der Medien und CMC Röhrchen

  1. Vorbereitung phosphatgepufferter Salzlösung (PBS)-Lösung (137,93 mM NaCl, 2,67 mM KCl, 8,1 mM Na 2 HPO 4, 1,47 mM KH 2 PO 4). Autoklav zum Sterilität. Dies kann bei 4 º C mehrere Monate gelagert werden.
  2. Pre-aliquote 5 ml PBS in 50 ml Falcon-Röhrchen (eine pro Probe gesammelt werden) und b....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multi Durchflusszytometrie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Phänotypen und Funktionen der Zell-Untergruppen in bisher nicht charakterisiertes Gewebe zu sezieren. Analyse von CMC Proben können Informationen sowohl Lymphozyten und Monozyten-Populationen mit entsprechenden Gating Strategien ergeben.

Ein Vertreter CMC Gating-Strategie, im Vergleich zu einem angepassten PBMC-Profil, ist in Abbildung 2 dargestellt. Das FSC-A gegen FSC-H ermöglicht Grundstück für den Aussc.......

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Angesichts der großen Wissenslücken in Bezug auf die Immunität im weiblichen Genitaltrakt (FGT), können phänotypische Analyse von CMC eine breite Palette von Einsichten in verschiedene Lymphozyten-Populationen in den Gebärmutterhals zu liefern. Mit Proteomanalyse und Viruslastmessungen in den zervikalen Spülung gekoppelt, kann Immunität zu sexuell übertragbaren Infektionen (STI) s und andere Krankheitserreger in verschiedenen Populationen zerschnitten werden.

Technische Überlegungen .......

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken Joshua Kimani, dem klinischen Direktor des Forschungsprogramms an der Universität von Nairobi, für seine Unterstützung bei mukosalen immunologischen Studien im Zusammenhang mit diesem Protokoll. Die Autoren danken der Finanzierung durch das CHVI-Stipendium MOP 86721.

....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
100 μ m Zellsieb für 50 ml Falcon RöhrchenBD352360CMC Verarbeitung
RPMI 1640HycloneSH30027.01CMC Verarbeitung
Fötales RinderserumLife-Technologie16000044CMC-Verarbeitung
FungizoneLife-Technologie 15290-018CMC-Verarbeitung
Penicillin/StreptomycinSigmaP4333-20mlCMC-Verarbeitung
50 ml Falcon-RöhrchenFisher14-959-49ACMC-Verarbeitung
Blutbank Einweg-TransferpipetteFisher13-711-6MCMC-Verarbeitung
Cytobrush plusCooper chirurgischC0121CMC-Probenahme
Einweg-ZervixschaberQuick medical2183CMC-Probenahme
15 ml Falcon-RöhrchenFisher14-959-70cCVL-Verarbeitung
1,5 ml Röhrchen EppendorfFisher05-402-18CVL-Speicher
LIVE/DEAD Fixierbares ZellfärbesetInvitrogenVerschiedeneDurchflusszytometrie-Reagenz
Fixierungspuffer (4% PFA)BD554655Durchflusszytometrie-Regeant
IgG-MausSigmaI8765Durchflusszytometrie-Regeant

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. UNAIDS. Global Report 2013. http://www.unaids.org/en/media/unaids/contentassets/documents/epidemiology/2013/gr2013/UNAIDS_Global_Report_2013_en.pdf. , (2013).
  2. Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V., Wira, C. R.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Cervical Mononuclear CellsFlow Cytometry AnalysisCytobrush Sample CollectionCervical Vaginal LavageCell Isolation ProtocolImmunophenotyping TechniqueLymphocyte Monocyte PopulationsHIV Susceptibility ResearchFemale Genital TractPeripheral Blood Controls

Verwandte Artikel