Proteinisolierung aus den Entwicklungs embryonalen Mäuseherzklappen Region

Zusammenfassung

Die Analyse der Proteinexpression in jungen embryonalen Mausklappen wurde durch das begrenzte verfügbare Gewebe erschwert. Dieses Manuskript enthält ein Protokoll zur Präparation von Proteinen aus sich entwickelnden embryonalen Mausklappenregionen für die Western-Blot-Analyse.

Zusammenfassung

Die Western-Blot-Analyse ist eine häufig verwendete Technik zum Nachweis und zur Quantifizierung von Proteinkonzentrationen. Bei kleinen Gewebeproben ist diese Analysemethode jedoch möglicherweise nicht empfindlich genug, um ein Protein von Interesse nachzuweisen. Um diese Schwierigkeiten zu überwinden, untersuchten wir Protokolle zur Gewinnung von Protein aus adulten menschlichen Herzklappen und modifizierten diese Protokolle für die sich entwickelnden frühen embryonalen Maus-Gegenstücke. Kurz gesagt, werden die embryonalen Aortenklappenregionen der Maus, einschließlich der Aortenklappe und der umgebenden Aortenwand, in einem möglichst geringen Volumen eines Tris-basierten Lysepuffers mit Proteaseinhibitoren gesammelt. Falls dies aufgrund der Zuchtstrategie erforderlich ist, werden die Embryonen genotypisiert, bevor vier embryonale Aortenklappenregionen für die Homogenisierung gepoolt werden. Nach der Homogenisierung wird ein SDS-basierter Probenpuffer verwendet, um die Probe für die Verarbeitung auf einem SDS-PAGE-Gel und die anschließende Western-Blot-Analyse zu denaturieren. Obwohl die Proteinkonzentration für eine Quantifizierung mit spektrophotometrischen Proteinquantifizierungsassays zu niedrig bleibt und Proben für nachfolgende Analysen übrig bleiben, kann diese Technik verwendet werden, um phosphorylierte Proteine erfolgreich über Western Blot aus gepoolten Proben von vier embryonalen Tag-13,5-Maus-Aortenklappenregionen zu detektieren und semi-quantifizieren, von denen jede etwa 1 μg Protein ergibt. Diese Technik wird für die Untersuchung der Aktivierung des zellulären Signalwegs und der Proteinexpression während der frühen embryonalen Entwicklung von Mausklappen von Vorteil sein.

Einleitung

Die Möglichkeit zur Identifizierung und Quantifizierung Proteinexpressionsniveaus ist eine Standardtechnik für tier- und zellbasierten Experimenten. Doch trotz langjähriger Interesse an der frühen embryonalen Herzklappen Entwicklung, Bewertung Proteinexpression in diesem speziellen Gewebe während der Entwicklung ist derzeit sowohl in der Immunhistochemie Küken und Maus ^1,2 begrenzt. Ein Teil der Schwierigkeit der Quantifizierung der Proteinexpression in den Entwicklungs Ventile aller Modellorganismen (beispielsweise Küken und Maus) ist die geringe Größe der Ventile, die die Menge an Protein, die erhalten werden können, begrenzt. So für quantitative Analysen, die Forscher der Regel verlassen sich auf die RNA-Extraktion und Amplifikation für die anschließende quantitative PCR oder Microarray-Analyse ^2-5. Jedoch sind RNA-und Protein-Expressionsniveaus nicht vollständig korrelativen ^6, so sich auf RNA-Expression nicht eine strenge aufgrund der zahlreichen Änderungen, die in einem gegebenen Signalisierungs auftretenWegs zu verschiedenen Zeiten während Entwicklungen. Basierend auf dieser Grenze in der gegenwärtig verfügbaren Methoden, das Ziel dieses Verfahrens war es, ein Protokoll für die zuverlässige, ausreichende Mengen des Proteins aus den Entwicklungs embryonalen Maus Herzklappenbereiche für die quantitative Analyse der Änderungen, die in verschiedenen Signalwegen, die in wichtig auftreten entwickeln Die Reifung des Gewebes.

Embryonale Ventile sind bereits häufig von Mäusen für die RNA-Isolierung und anschließende Genexpressionsanalyse ^2-5 seziert. Allerdings haben diese Studien mit Gen-Expression als ein Auslesen der Signalwegs-Aktivierung, die nicht den Nachweis erkennen posttranslationalen Proteinmodifikationen, die nachgeschalteten Signal beeinflussen können zulässt beschränkt. Mit Hilfe der RNA-Isolierung Techniken als Ausgangspunkt, begannen wir mit sezieren die Regionen von Interesse. Da unser Interesse wurde phosphoryliert Proteine, die indikativ Erkennen von Signal pat warenHWAY Aktivität während einer bestimmten Zeit Aortenklappe Entwicklung (E13.5-14.5), führten wir alle Sektionen in phosphatfreien Tris-Puffer und die Ventile in einem Tris-Lyse-Puffer mit Phosphatase und Protease-Inhibitoren gesammelt. In unserem speziellen Fall nur die Aortenklappe Regionen wurden gesammelt, aber der Pulmonalklappe Bereich leicht zur gleichen Zeit erhalten werden. Die Ventilbereiche wurden dann homogenisiert und in Kombination mit einem Probenpuffer, der derzeit verwendet wird, um die Proteinexpression in adulten Herzklappen ⁷ zu untersuchen. Durch die Verwendung von kleinen Probenmengen (beispielsweise 2 ul) und Vereinigen Ventilbereiche von Embryonen mit dem gleichen Genotyp, waren wir in der Lage, phosphorylierte und nicht-phosphorylierte Proteine ​​an embryonalen Tag ⁸ 13,5 erfassen. Da die Ventilbereiche können eingefroren und in Lyse-Puffer gespeichert werden können, wenn Embryonen vor Pooling benötigt genotypisiert werden.

Diese Technik erweitert den Satz von Tools, die für die Auswertung zur Verfügung stehen Zelle signaling Wege während der Entwicklung und eine quantitative Kompliment Immunhistochemie, die speziell für die Entwicklung von Herzklappen. Diese Technik sollte der Nutzen nicht nur für Entwicklungs Kardiologen, aber auch für alle Entwicklungsbiologen, die mit frühen Embryonen arbeiten, sind interessiert in Regionen, die begrenzte Gewebe enthalten sein.

Protokoll

HINWEIS: Alle Experimente wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der Universität von North Carolina in Chapel Hill genehmigt.

1. Verbrauch der Aortenklappe

1. Mit einem zugelassenen Euthanasie Technik für die embryonalen Stadium von Interesse, einschläfern eine schwangere Maus mit Welpen an der gewünschten embryonalen Tag (E) der Entwicklung.
2. Verwenden 70% Ethanol, um den Bauch der Schwangeren zu sterilisieren. Heben Sie die Haut und Muskeln des Unterleibs oben und weg von den inneren Organen und sezieren unteren Bauchhöhle des Weibchens offen für den Zugang zum Uterushorn zu ermöglichen.
3. Um die Uterushorn abzurufen, halten Sie die Zervix mit einer Pinzette und sorgfältig geschnitten kaudal der Zange. Heben Sie die Uterushorn, Schneiden jede Bindegewebe, das Horn an Ort und Stelle hält, und füllen Sie die Entfernung, indem die Kreuzung der Uterushorn mit den Eileiter.
4. Legen Sie die seziert Uterushorn in eine Petrischale mit cold 0,1 M Tris-Puffer (pH 7,6) und spülen Sie nach Bedarf. Dann schneiden Sie die Uterushorn offen in Längsrichtung, um die embryonalen Säcke aus.
5. , Um den Embryo zu belichten, schnitt eine Fruchtblase an der Kreuzung von der Plazenta und des Embryos und schneiden Sie die Nabelgefässe, um den Embryo zu befreien. Legen Sie die seziert Embryo in einer zweiten Petrischale mit kaltem 0,1 M Tris-Puffer. Bringen Sie die ersten Petrischale mit den restlichen unzer Embryonen Eis, bis sich bereit für den nächsten Embryo.
6. Um Zugang Brustwand innerhalb des Embryos zu verbessern, den Embryo zu enthaupten. Wenn Genotypisierung notwendig ist, zu entfernen und speichern eine zusätzliche Gewebestück in ein Eppendorf-Röhrchen auf Eis gestellt.
7. Legen Sie den Embryo auf dem Rücken, und schneiden Sie die Brustwand vertikal entlang der Seite des Brustkorbs, in der Nähe einer Vordergliedmaße, und horizontal über der Membran, um das Herz zu visualisieren. Öffnen Sie dann die Brustwand, um das Herz freizulegen.
8. Mit einer Pinzette hoch entlang der großen Gefäße zu halten, heben Sie das Herz mit einer Pinzette und schneiden Sie die Gefäße unten. Dien, vor der Zange geschnitten, um das Herz zu befreien. Wenn die Lungengefäße bleiben ungeschnitten, kann die Lunge mit dem Herzen entfernt werden und sollte, bevor Sie fortfahren entfernt werden.
9. Schneiden und entfernen Sie die Lungenarterie über dem Niveau des Ventils; bei der hier beschriebenen Embryonalstadien, die Lungenarterie leicht opak, die in ihrer Unterscheidung von den Ventilbereich unterstützt. Kurz unterhalb der Pulmonalklappe, die Vermeidung der trabekulierte Myokard und sammeln, wie in Schritt 1.10 beschrieben, wenn diese Region ist auch von Interesse. Hier und im nächsten Schritt verwendet Kapillarwirkung, um überschüssiges Tris-Puffer von dem interessierenden Bereich vor dem Sammeln in Lysepuffer ziehen.
10. Die Aorta distal sorgfältig zu entfernen, um die Aortenklappe, gerade über dem Niveau des Ventils; wie die Lungenarterie, bleibt der Aorta bei diesen embryonalen Stadien leicht opake, Beihilfe in seiner Entfernung. Kurz unterhalb der Aortenklappe, wieder die Vermeidung der trabekulierte Myokard, und übertragen Sie dieVentil mit einer Pinzette in ein Eppendorf-Röhrchen mit 2 ul Lysepuffer (in der Material Tabelle beschrieben) mit Protease und Phosphatase-Inhibitoren auf Eis.
11. Wiederholen Sie die Schritte, bis 1,6-1,10 die Ventile aus allen Embryonen herausgeschnitten worden, sammeln jedes Ventil in einem separaten Eppendorf-Röhrchen. Wenn alle Embryonen haben den gleichen Genotyp, können alle Ventile in einem Eppendorf-Röhrchen gesammelt werden.
12. Wenn die Genotypisierung durchgeführt werden, um zu bestimmen, welche zu bündeln Ventile sollten sofort Proben in Lyse-Puffer bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung. Proben können dann nach Genotypisierung (Schritt 2.1.1) zusammengefasst werden.

2. Proteinextraktion

1. Auftauen gesammelten Gewebe auf Eis und Zentrifugieren bei 13.100 × g für 1 Minute, um das Gewebe in Lysepuffer am Boden des Röhrchens zu sammeln.
   1. Wenn Embryonen wurden genotypisiert, mit einer Pipette vorsichtig sammeln und Pool-Lyse-Puffer, der die Ventilbereiche aus Embryonen mit ähnlichen Genotypen. Eine starke b gewährleistenund die Bündelung 3-4 Ventilbereiche von E13.5 Embryonen pro Probe wird empfohlen.
   2. Wenn alle Embryonen wurden aus dem gleichen Genotyp und alle Ventilbereiche in Schritt 1.10 zusammen gesammelt, lysiert die gesamte Probe, wie in Schritt 2.2 beschrieben.
2. Überprüfen Sie die Lautstärke des resultierenden Mischprobe und fügen Lyse-Puffer auf ein Gesamtvolumen von 40 ul; dann, und homogenisieren Proben unter Verwendung von 5 mm Edelstahlkugeln in Eppendorf-Röhrchen. Betreiben Sie das lyser für 2-4 min bei 50 Hz, nach den Anweisungen des Herstellers. Spin Röhrchen kurz (~ 13.100 × g für 1 min), und die Übertragung Proben in neue Röhrchen, so dass hinter dem unlöslichen Rückstand.
3. Vorbereitung und getrennte Proben für SDS-PAGE und Transfer zur anschließenden Western-Blot-Analyse nach einem Protokoll wie Eslami et al ^9. Blotting für eine Ladekontrollprotein ist von wesentlicher Bedeutung für die Proteinquantifizierung.

Ergebnisse

Mit dieser Präparationstechnik, waren wir in der Lage, im Einzel Aortenklappe Regionen aus E13.5 Embryonen erkennen phosphoryliert Smad ^1,5,8 (pSmad). Wie in 1A gezeigt, ist das Protein von sogar einer einzigen Ventilbereich isoliert ausreicht, um eine schwache pSmad Band zu erfassen. Signalintensität nimmt proportional zur Anzahl der Ventilbereiche, die gebündelt sind. Wichtig ist, bleibt die pSmad / β-Actin-Verhältnis in den verschiedenen Stichprobengrößen (Abbildung 1c) na...

Diskussion

Die Fähigkeit, Proteinspiegel in der frühen embryonalen Maus quantifizieren und Küken Herzklappen Regionen bietet ein zusätzliches Werkzeug für das Verständnis der kritischen zellulären Signalereignisse für Ventil Entwicklung. Unsere hier beschriebenen Protokoll nicht wesentlich von Standardproteinisolierungsverfahren abweichen. Jedoch durch Änderung einiger Schlüsselschritte, haben wir erfolgreich erhalten phosphoryliert Proteine ​​aus extrem kleinen Probengrößen. Um dieses Ergebnis zu erreichen, sind die folgenden Sch...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Zeitgesteuerte schwangere Maus			Zur Präparierung im embryonalen Stadium von Interesse
Stereoskopisches Mikroskop	Nikon	SMZ645
0,1 M Tris, pH 7,6
Mikroschere	Fine Science Tools	15003-08
Feine Pinzette, #5	Fine Science Tools	11251-30
Präpariernadel Inhaber	Ted Pella Inc.	13560
Präpariernadeln	Ted Pella Inc.	13561-10
Mikropipette, 20 μ l, mit Spitzen
Lysepuffer			50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1%
Triton PhosSTOP	Roche	4906845001	1 Tablette auf 10 ml Lysepuffer geben
TissueLyser LT	Qiagen	85600
Edelstahlkügelchen	Qiagen	69989
Mikrozentrifuge