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Summary

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the Apc^Min/+ colorectal cancer model.

Abstract

Myeloide Zellen sind die am häufigsten vorkommenden Immunzellen in Tumoren und haben gezeigt, dass Tumorprogression zu fördern. Moderne bildgebende Verfahren ermöglichen Intravital die Beobachtung von lebenden Zellverhalten im Inneren der Orgel, sondern kann eine Herausforderung in einigen Arten von Krebs durch Orgel und Tumor Zugänglichkeit sein wie Darm. Die direkte Beobachtung von Darmtumoren wurde bisher nicht berichtet worden. Eine hier beschriebene chirurgische Verfahren ermöglicht die direkte Beobachtung der myeloischen Zelldynamik in den Darmtumoren in lebenden Mäusen mit Hilfe transgener Mäuse fluoreszierenden Reporter und injizierbare Tracer oder Antikörper. Zu diesem Zweck wird ein Vier-Farben-, Multi-Region, Mikrolinsen-Spinning-Disk konfokalen Mikroskop, die langfristige, kontinuierliche Bildgebung mit schneller Bildaufnahme ermöglicht wurde verwendet. Apc ^{Min / +} Mäusen, die mehrere Adenome im Dünndarm zu entwickeln sind gekreuzt mit c-fms-EGFP Mäuse myeloischen Zellen visualisieren und mit ACTB-ECFP Mäuseauf intestinalen Epithelzellen der Krypten zu visualisieren. Verfahren zur Markierung von verschiedenen Tumorkomponenten, wie Blutgefäße und Neutrophilen, und das Verfahren zum Positionieren des Tumors für die Bildgebung durch die Serosa-Oberfläche werden ebenfalls beschrieben. Zeitraffer-Filme von mehreren Stunden von bildgebenden zusammengestellt ermöglichen die Analyse von myeloischen Zellverhalten in situ in der Darmmikroumgebung.

Introduction

Überwältigenden Beweis zeigt nun, daß der Tumor-Mikroumgebung, die aus heterogenen Zellpopulationen, einschließlich Fibroblasten, Endothelzellen, Immun-und Entzündungszellen, extrazelluläre Matrix und lösliche Faktoren spielt eine entscheidende Rolle bei der Initiierung und Progression von soliden Tumoren, indem sie zu fast Kennzeichen von Krebs ^1. Tatsächlich, während der Tumorprogression gibt es konstante dynamische Wechselwirkungen zwischen transformierten Krebszellen und Stromazellen, die eine Mikro günstig Malignität ² erzeugen entwickeln. Zu den Immunzellen, die das Tumor-Mikroumgebung zu infiltrieren sind myeloischen Zellen die am häufigsten vorkommende ^3. Bestehend aus Tumor-assoziierte Makrophagen (TAM), myeloische abgeleitete Suppressorzellen (MDSC), dendritische Zellen (DC) und Neutrophilen (PMN), werden Knochenmarkzellen aus Knochenmark gewonnen und fortschreitend zu infiltrieren Tumoren, Freisetzung von Zytokinen, Wachstumsfaktoren und Proteasen, fördern könnenTumorwachstum und zu verbreiten ^4. Das Übersprechen zwischen den Krebszellen und myeloischen Zellen ist komplex, sondern dynamisch. Somit ist das Verständnis der Natur der Wechselwirkungen entscheidend für die Bestimmung, warum diese Zellen fördern Krebsentwicklung statt, die an einer Anti-Tumor-Immunantwort, und kann dazu beitragen, neue Ziele zu kontrollieren finden.

Direkte Beobachtung durch Intravitalmikroskopie liefert Informationen über Zelldynamik in den Geweben von lebenden Mäusen ^5. Ein Vierfarben-, Mehrbereich, Mikrolinsen-Spinnplatte konfokales System wurde entwickelt, um Stromazellen in Brusttumoren ⁶ zu untersuchen. Dieser Ansatz ermöglicht die langfristige, kontinuierliche Bildgebung und umfasst mehrere Vorteile, wie (a) schnelle Bilderfassung, um Bewegungsartefakte zu minimieren, (b) langfristige Anästhesie, (c) vier Farberfassung auf verschiedenen Zelltypen zu folgen, (d) Fluoreszenzmarkierung verschiedener Tumorkomponenten, und (e) Beobachtung verschiedener Tumormikroumgebung witHin die gleiche Maus Maus Maus Variabilität ^7-9 zu vermeiden. Mit dieser Technik wurden verschiedene Zellverhalten in dem Brusttumor-Virus (MMTV)-Promotor angetrieben Polyoma mittleren T-Onkogen (PyMT) Modell, das schrittweise von Tumorgenese zeigt gemeldet. Regulatorische T-Lymphozyten (Treg, von der Foxp3 ^{EGFP-Transgens} sichtbar) wandern bevorzugt in der Nähe der Blutgefäße in der Erwägung, DC (CD11c-DTR-EGFP), Karzinom-assoziierte Fibroblasten (Fsp1 ^{+ / +} -EGFP) und myeloischen Zellen (c-fms -EGFP) weisen höhere Beweglichkeit in der Tumorperipherie als innerhalb der Tumormasse. Im Zustand der akuten systemischen Hypoxie, wanderten Zellen anders: Tregs stoppen Migration im Gegensatz zu myeloischen Zellen, die sich zu bewegen ⁶ fort. Zusätzlich wird in der gleichen Mausmodell wurde gezeigt, dass Doxorubicin Empfindlichkeitsänderungen mit Tumorstadium wird Arzneimittelverteilung Arzneimittelantwort und Doxorubicin bezogenenBehandlung führt zu CCR2-abhängigen Rekrutierung von myeloischen Zellen zu Tumoren. So können Live-Bildgebung auch verwendet, um Einblicke in die Arzneimittelreaktionen in situ und die Biologie der Chemoresistenz ^10,11 zu gewinnen.

Adenomatöse Polyposis coli (APC)-Gen-Mutationen treten häufig in menschlichen kolorektalen Adenomen und Karzinomen ¹² und Mutation eines einzelnen Kopie des Gens Ergebnisse von APC im familiären adenomatösen Polyposis (FAP), die ein extrem hohes Risiko für Darmkrebs ¹³ verleiht. Der Maus-Stamm Apc ^{Min / +} trägt eine Trunkierungsmutation an Codon 850 des APC-Gens und entwickelt spontan mehreren intestinalen Adenomen ganzen Dünndarm ^14-16. Langfristige intravitalen Bildgebung des Darms ist schwierig, weil der Invasivität des Verfahrens, da das Öffnen der Bauchhöhle, die für den Zugriff auf den Darm. Kurzfristige Live-Bildgebung studies wurden zuvor an gesunden Darm ^17,18 veröffentlicht, aber die langfristige direkte Beobachtung von Darmtumoren wurde nicht berichtet. Ein chirurgisches Verfahren wurde entwickelt und verfeinert, um Tumore über die serösen Oberfläche des Darms sichtbar zu machen, mit der sich drehenden Scheibe Intravitalmikroskopie System vorher auf Bild Brusttumoren ^6,10 verwendet. In diesem Beitrag wird ein Protokoll beschrieben, das eine um das Verhalten von myeloischen Zellen in den Tumoren im Dünndarm unter Verwendung von Apc ^{Min / +-Mäusen} folgen können.

Protocol

HINWEIS: Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit Verfahren, die von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC), UCSF genehmigt durchgeführt. Alle Abbildungsexperimente waren Nichtlebens Verfahren und die Tiere unmittelbar nach dem Ende der Bildaufnahme getötet.

1. Generierung von Mäusen

HINWEIS: APC ^{Min / +} Mäusen, die eine Mutation des APC-Gens auf, entwickeln spontan 50-100 Adenomen im Dünndarm.

1. Quer Apc ^{Min / +-Mäusen} mit dem ACTB-ECFP Linie, die ECFP unter der Actin-Promotor exprimiert, und ferner mit dem c-fms-EGFP-Linie, die EGFP unter die c-fms-Promotor exprimiert, die myeloiden Zellen zu detektieren. Heterozygote Tiere für ACTB-ECFP und c-fms-EGFP werden verwendet, um Fluoreszenz zu erkennen.
2. Verwenden Mäusen bei 3-4 Monate alt sein, um Bild deutlich nachweisbar Adenome.

2. Herstellung von Materialien Vor der Operation

HINWEIS: Die Details des Mikroskops Set-up zuvor beschriebenen ^6,7 gewesen.

1. Mikroskop
   1. Schalten Sie die Heizdecke. Schalten Sie den Argon-Laser für 488 nm-Anregung und der Festkörper 405 nm, 561 nm und 640 nm Laser. Einschalten des Mikroskops, die Spinnplattensteuereinheit, die AOTF, der Lasersteuereinheit und die Kamerasteuerung.
   2. Öffnen Sie die Verschluss Mikroskop, das die LED rot wird. Schalten Sie den Computer und die Kamera-Software.
2. Imaging Platform
   1. Stellen Sie sicher, dass die Bühne Einsatz sauber ist. Ansonsten sauber mit Wasser und Seife und dann trocknen.
   2. Nehmen Sie zwei Deckgläser und benutzen Labor Band, um sie auf den Einsatz zu sichern. Platzieren Sie den Einsatz auf der Bühne und reinigen Sie es mit Alkoholtupfer.
   3. Mit Labor Band, bringen Sie die Heizdecke auf der rechten Seite der Bühne.
   4. Überprüfen Sie die Integrität der Gummimembran auf der Nase Kegel und ändern Sie es Sie ggf.y. Position und fixieren Sie die Nasenkegel für Isofluran-Narkose Lieferung an das Tier mit Hilfe Gaze und Labor-Band.
3. Isofluran-Narkose-System
   1. Füllen Sie den Tank Isofluran.
   2. Schalten Sie die Vakuum und passen zu 1,2 L / min.
   3. Mit destilliertem Wasser auf den Zerstäuber und verbinden Sie den Zerstäuber auf die Isofluran-System.
   4. Schalten Sie den Sauerstoff-Analysator und verbinden Sie es mit der Isofluran-System. Schalten Sie die Sauerstoffflasche und sicherzustellen, dass die Sauerstoff-Analysator zeigt 100%. Stellen Sie die O ₂ Fluss auf 0,2 l / min.
   5. Schalten Sie den Stickstofftank und den Fluss von 0,8 l / min einzustellen. Stellen Sie sicher, dass die Sauerstoff-Analysator zeigt 21%.
4. Vorbereitung für Chirurgie Werkzeuge und Plattform
   1. Saubere 2 Paar Dissektion Zange und Schere mit Wasser und Seife.
   2. Schalten Sie die heiße Perle Sterilisator und lassen Sie es erreichen 250 ° C. Sterilisieren Sie die Chirurgie-Tools für 30 sek. Lassen Sie sie abkühlen.
   3. Legen Sie ein Labor Soaker auf dem OP-Tisch.
   4. Verwenden Sie eine Styropor-Deckel als Operationsplattform. Decken mit einem Stück Labor Soaker. Bereiten Sie ein zweites Stück Labor Soaker, um nach der Rasur mit der Maus ändern.
   5. Legen Sie den Nasenkegel mit der Linie der Anästhesie auf der überdachten Styropordeckel, und befestigen Sie es an der Styropor-Deckel (nicht auf dem Labor Soaker) mit Klebeband und mit zwei Nadeln auf beiden Seiten der Nasenkegel, um es an Ort und Stelle zu halten.
   6. Montieren Sie betadine, Alkoholtupfer, sterile Gaze, Superkleber, Objektträger, Elektrorasierer, und 4 Stück Labor-Band.

3. Herstellung von Injektionen

1. Unter der Haube, bereiten eine Insulinspritze (28 G x ½) mit 7 ul Lager AF647-Ly-6G konjugierten (Gr1) Antikörper (1 mg / ml) in 100 ul von 2.000 kDa Rhodamin-Dextran (4 mg / ml ) für retroorbitale Injektions. Retro-orbitale Injektion wird in Apc ^{Min / +} Mäusen zu empfehlen, da Anämie, die bei diesen Tieren entwickelt macht die Schwanzvenen difficult, um durch die Haut zu erkennen.
2. Vorbereiten einer zweiten Insulinspritze mit 1 mg / kg Atropin subkutan (sc) in 150 ul PBS verdünnt Injektion vor der Bilderzeugung, um die Peristaltik des Darms zu dämpfen.

4. Vorbereitung des Darms für Imaging

1. Überprüfen, ob der Anästhesie Linie der Induktionskammer offen ist, und die Leitungen zu den Operationstisch und Mikroskop geschlossen.
2. Übertragen Sie das Tier auf die Anästhesie Kammer. Schließen Sie die Anästhesie Kammer und schalten Sie die Isofluran bis 4% (bei ​​21% O _2).
3. Wenn die Maus atmet tief und langsam (nach 5-6 min), dann in der chirurgischen Bühne, auf der Flanke und injizieren Sie die Gr1 Antikörper-Lösung und / oder Dextran-Lösung retro-orbital.
4. Öffnen Sie die Anästhesie Linie auf die chirurgische Plattform verknüpft. Schließen Sie die Zeile auf die Anästhesie Kammer und bewegen Sie die Maus auf dem Rücken mit der Nase in der Anästhesie Kegel.
5. Reduzieren Sie die IsofluranKonzentration von 4% auf 2,5%.
6. Stellen Sie sicher, dass die Maus gut durch Kneifen seine Pfotenballen und Testen der Hornhautreflex betäubt.
7. Fügen Augenschmier Salbe auf die Augen zu Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
8. Sichern Sie sich die Gliedmaßen der Maus auf die chirurgische Phase durch Zugabe von Lab-Band.
9. Entfernen der Haare von der ventralen Oberfläche unter Verwendung eines elektrischen Rasierers. Auch entfernen die Haare von der linken Hintergliedmaße, um das Oximeter vor Akquisition positionieren. Entfernen Sie die Labor Soaker von der Operations Bühne und ersetzen durch einen sauberen, Haar Kontamination zu vermeiden.
10. Desinfizieren Sie die Bauchfläche mit Alkoholtupfer und betadine.
11. Injizieren Sie die Lösung Atropin (3,2) sc in eine Flanke der Maus.
12. Machen Sie eine 1 cm ventralen Mittellinie Schnitt durch die Haut und das Bauchfell mit einer Schere und einer Pinzette. Ziehen Sie vorsichtig 3-4 cm des Darmes und zur Identifizierung eines oder mehrere Tumoren zu Bild.
13. Nehmen Sie ein Glas MICRoscope Schieberposition und eine Schleife des Darms auf sie mit einem Tumor an der Spitze.
14. Fügen Sie etwas Sekundenkleber auf wenige Stellen entlang der Darm, um es auf den Objektträger zu befestigen. Warten Sie eine Minute, bis der Kleber trocknen. Verwenden Sie eine Markierung, um eine Linie auf der Folie, die auf den Tumor, um seine Lokalisierung mit dem konfokalen erleichtern ziehen.

5. Positionierung der Maus auf die Bühne, und Vorbereitung auf Image Acquisition

1. Entfernen Labor Band von den Gliedern.
2. Öffnen Sie die Anästhesie Leitung an den Mikroskoptisch und schließen Sie die man auf die chirurgische Plattform.
3. Übertragen Sie die Maus vorsichtig auf den Mikroskoptisch mit seiner Bauchseite nach unten und die Nase in der Nase Kegel. Sichern Sie die Anästhesie Linie mit einigen Labor-Band.
4. Re-Positionierung der Maus und / oder die Folie, um den Darm in der Mitte von einem der Cover-schlüpfte Fenster haben. Sanft kleben die Folie mit Labor-Band.
5. Befestigen Sie die Oximetermeßfühler links Schenkel der Mausfolgen ihr Herz und Atemfrequenz und arterielle Sauerstoffsättigung.
6. Decken Sie die Maus mit der Heizdecke zu Unterkühlung zu vermeiden.
7. Verringern der Isoflurankonzentration von 2,5% auf 1-1,5% für die Bildgebung.

6. Übernahme von Images unter Verwendung von Software μManager

1. Erhöhen CSUX Geschwindigkeit zu 2.500 Umdrehungen pro Minute um die Bildqualität in den Konfigurationseinstellungen zu verbessern.
2. Verwenden Sie das Ziel im Dropdown-Menü zu 10X 0,5 NA oder 20X 0,75 NA Fluar Linsenobjektiv zu wählen.
3. Wählen Sie den Laser von 405 nm Farbe Dropdown-Menü.
4. Klicken Sie auf Live-und stellen Sie den Fokus mit dem Mikroskop.
5. Klicken Auto zu maximalen und minimalen Pixelintensitäten des Anzeigebilds auf der Basis der extremen Pixelwerte in dem Bild automatisch einzustellen. Ein Histogramm des Anzeigebildes der Pixel-Intensitäten in dem Diagramm im unteren Teil des Hauptfensters dargestellt.
6. Stellen Sie die Kamera die Belichtung im Fenster der Systemsteuerung von PiperÄndern der Anzahl von Takten (ein Takt 33,333 ms).
7. Wenn das Signal ist zu hell mit der niedrigsten Exposition zu verringern Laserintensität mit dem Mikroskop Steuereinheit.
8. Überprüfen Sie die Signalstärke für 488 nm, 561 nm und 640 nm Laserlinien. Passen Laserintensität mit dem Laser die eigene Steuereinheit (488 nm und 561 nm) oder dem Mikroskop Steuereinheit.
9. Im Multi-D Aufnahmefenster, überprüfen Sie die Zeitpunkte Feld und geben in der Anzahl der Zeitpunkte und der gewünschten Zeitintervall.
10. Überprüfen Sie die Z-Stapel Fenster wählen "relative Z" definieren und Z-Start Z-End relativ zur aktuellen Position.
    HINWEIS: 10X oder 20X Ziel, mit Z-Ebenen 3, 8 um oder 4 um jeweils beginnen auseinander.
11. Überprüfen Sie die Multiple-Positionen (XY) Feld zur Abbildung mehrere Standorte, klicken Sie dann auf Positionsliste bearbeiten, markieren Sie 4 bis 6 verschiedenen Positionen.
12. Überprüfen Sie die Kanäle Box und fügen Kanäle aus und wählen Sie Neue Laser Zeilen aus dem Dropdown-Menü und type Exposition für jeden Kanal (in Vielfachen von 33,333 ms).
13. Überprüfen Sie Bilder speichern im Fenster "Multi D Erwerb".
14. Wählen Sie einen Ordner und alle aufgenommenen Bilder werden automatisch in diesem Ordner mit dem Namen Präfix gegeben gespeichert werden.
    HINWEIS: Jede kontinuierliche Erfassung wird in einem separaten Unterordner als einzelne TIFF-Dateien für jede Z-Schnitt in jeder Farbe zu jedem Zeitpunkt gespeichert werden.
15. Speichern Sie alle Einstellungen durch Klicken auf Einstellungen speichern in der Multi D Aufnahmefenster.
16. Klicken Sie erwerben in der Multi-dimensionale Aufnahmefenster zum Start der Erfassung.
17. Wenn das Oximeter-Sonde nicht verwendet wird oder nicht mehr funktioniert gut (wenn der Impuls nicht stabil ist oder schwer zu erkennen), überprüfen die Effizienz der Anästhesie alle 15 Minuten während des Sicherungsvorgangs durch Kneifen der Fußballen und die Kontrolle der Hornhautreflex. Passen Sie die Narkose, wenn die Maus reagiert auf diese Reize.
18. Nach der Übernahme, einschläfern die Maus durch die Erhöhung der Isofluran concentRation bis 5%. Wenn keine Atembewegungen erkennbar sind, entfernen Sie die Maus von der Bühne und führen Sie einen Genickbruch.

7. Analyse der Bilder mithilfe von Software Imaris

1. Konvertierung von Dateien (Ergänzende 1A) .ims
   1. Öffnen Sie die Kamera-Software, klicken Sie auf Datei und anschließend Batch Converter.
   2. Klicken Sie auf Dateien hinzufügen, und wählen Sie die erste Datei von der ersten Position. Wiederholen Sie für jede Position.
   3. Für jede Datei hochgeladen, klicken Sie auf Einstellungen, und überprüfen Sie, dass die Einstellungen "t" für Time, "c" für die Kanäle und "z" für Z-Stapel werden in dieser Reihenfolge.
   4. Außer in den gewünschten Ordner. Durchsuchen und erstellen Sie eine neue Datei als umgewandelt.
   5. Klicken Sie auf Set für alle und starten.
2. Anpassungen (Ergänzende Abbildung 1B)
   1. Gehen Sie in die spezifischen Konvertierte Ordner und öffnen Sie die erste Datei.
   2. Im Display-Einstellung Fensters die HintergrundSignalabschaltung durch Änderung der Mindestzahl für jeden Kanal, wenn nötig.
   3. Falls erforderlich, die Signalintensität anpassen, indem Sie die maximale Anzahl (je niedriger die Max Zahl, desto höher die Intensität des Signals).
      HINWEIS: Anpassungen der Signalintensität / Kontrast ermöglichen den Höhepunkt einer Zellverhalten oder einem Fach, um ein schöneres Visualisierung haben. Es ist nicht das Ergebnis selbst zu ändern.
   4. Klicken Sie auf Bearbeiten und Image-Eigenschaften.
   5. Ändern der x, y und z-Werte (für einen 10X-Objektiv, x und y = 0,712, z = 8 um, für eine 20x-Objektiv: x und y = 0,36, z = 4 um).
   6. Klicken Sie auf Alle Equidistant zu Zeitpunkten anzupassen. Fügen Sie das Startdatum und die Startzeit der Akquisition. Fügen Sie das Enddatum und die Endzeit der Akquisition (Ergänzende 1C).
   7. Klicken Sie auf Play-Taste, um den Film zu sehen.
   8. Klicken Sie auf Bearbeiten und Löschen Zeitpunkten, um unscharfe Bilder zu löschen.
   9. Zwei separate Akquisitionen toge beitretenther zu einem Film, gehen Sie zum letzten Zeitpunkt des ersten Films und klicken Sie auf Bearbeiten> In Zeitpunkten, um die zweite Datei hinzufügen.
3. Speichern als Film (Ergänzende 1D)
   1. Klicken Sie auf Aufnahme, wählen Sie die MOV-Erweiterung und ein Kompressionsfaktor von 0.
   2. Klicken Sie auf Speichern.

Representative Results

Discussion

In diesem Beitrag wird ein detailliertes Protokoll für die drehende Scheibe konfokale Bildgebung von myeloiden Zelldynamik im Darmtumoren für mehrere Stunden in einem lebenden Tier, von der Serosa-Seite des Darm abgebildet beschrieben.

Um Entzündungen zu verhindern und eine optimale physiologische Bedingungen, Bildgebung des Darms hat auf die intakte Organ erfolgen. Allerdings ist aus der Abbildungs ​​Serosaseite Darm herausfordernd, da das Licht durch verschiedene Gewebeschichten, wie glatten Muskelzellen vor Erreichen des Epithels zu gehen. Fokussieren auf das Epithel kann in einigen Bereichen schwierig sein, insbesondere in der Aktin-ECFP Reportermäusen da Aktin wird von glatten Muskelzellen exprimiert wird. Obwohl Zwei-Photonen-Mikroskopie hat den Vorteil tieferen Eindringen in das Gewebe im Vergleich zu konfokalen Mikroskopen, fanden wir, dass die Spinnplatte Konfokalmikroskop ist stark genug, um eine gute Visualisierung der Darmepithelzellen Struktur zu erhalten. Die Vorteile of Spinning-Disk-Mikroskopie sind die Kapazitäten für die sehr schnelle Erfassung und einzigartige Empfindlichkeit, ohne dabei die konfokale Auflösung. Diese Eigenschaften ermöglichen die Beobachtung von dynamischen Prozessen, auch wenn einige Zeitpunkte müssen aufgrund von Bewegungsartefakten gelöscht werden, zu minimieren Lichtschäden und ermöglichen die Abbildung relativ schwach fluoreszierende Moleküle.

Abbildungsdarms vom Serosaseite auch schwierig sein, weil der endogenen peristaltischen Bewegungen des Organs. In diesem Protokoll wird eine subkutane Injektion von Atropin vor der Bilderzeugung gegeben, und es die Bewegung wirksam verringert. Es ist jedoch zu beachten, dass peristaltische Bewegung ist umfassender in den Dickdarm, ist jedoch nicht gut von Atropin Behandlung gehemmt, wodurch Abbildungs ​​ziemlich schwierig in diesem Teil des Darms. Die glatte Muskulatur im Darm ist etwas prominenter c in den Dünndarm ompared und scheint mehr Kontraktions sein. Daher ist esfast unmöglich ist, auf dem Epithel in den Aktin-ECFP Reportermäusen konzentrieren. Außerdem kann zusätzlich zu diesen endogenen Bewegungen kann Organ Driften auf, aber in diesem Fall hinteren Driftkorrektur kann mit der Kamera-Software durchgeführt werden.

Eine weitere große Herausforderung in invasive bildgebende Experimente ist es, die Maus am Leben und gesund, so lange wie möglich in Narkose zu halten. Der Darm wird durch Öffnen der Bauchhöhle zu erreichen. Somit ist das Verfahren mehr als die für invasive Brusttumordarstellung, die für bis zu 40 Stunden, da die Integrität des Peritoneums geführt werden können. Die maximale Erfassung mit der Bauchhöhle geöffnet getan war 6 Stunden, aber die Maus war noch am Leben ohne offensichtliche Anzeichen von Leiden, so kann sogar noch länger Nahme möglich sein.

In dieser Studie kann myeloischen Zellverhalten verfolgt und in der Darmtumor durch Verwendung von fluoreszierenden Reporter-Mäuse und auch fluorochromkonjugierten t analysiert werdenRennfahrer oder Antikörper. Dieser Ansatz kann auch für die Beobachtung anderer Zelltypen wie Treg, dendritische Zellen oder Fibroblasten unter Verwendung von Foxp3-EGFP oder CD11c-DTR-EGFP oder Fsp1-EGFP Reportermäusen jeweils, wie es in der Brusttumor-Studie verwendet werden ⁶ . Auch kann fluoreszierende Antikörper gegen andere Zellpopulationen als Neutrophile iv injiziert Zusätzlich werden kann, kann auch das Zellverhalten unter verschiedenen Bedingungen, wie Hypoxie analysiert werden. Solche Experimente können neue Einblicke in das Verhalten dieser Stromazellen nach der Behandlung mit Chemotherapie oder zielgerichtete Therapie zu geben. Schließlich kann dieses Protokoll mit anderen Mausmodellen von Darmkrebs und in verschiedenen Stadien der Tumorprogression verwendet werden. Apc ^{Min / +-Mäusen} entwickeln sich nur Darm adenomatösen Polypen, die nicht zur Malignität nicht voran, weil die Mäuse haben eine verkürzte Lebenserwartung. Es wird interessant sein, die Dynamik der myeloischen Zellen in anderen Darmkrebs-Modelle mit mehr agg studierenressive und invasiven Tumoren, wie zB Mäusen, die Mutationen in K-ras ^19-21 oder Smad4 ²² Gene zusätzlich zu den Apc-Mutation.

Materials

<em>Apc<sup>Min/+</sup></em> mice	Jackson Laboratory	2020
ACTB-ECFP mice	Jackson Laboratory	3773
cfms-EGFP mice	Jackson Laboratory	18549
2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated	Invitrogen	D7139
Isoflurane	Butler Animal Health Supply	29450
Nitrogen	UCSF
Oxygen	UCSF
1x PBS	UCSF cell culture facility
Saline Buffer	UCSF cell culture facility
Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647	UCSF Monoclonal antibody core		Stock 1 mg/ml. Use at 7 &mu;g/mouse
Atropine	LARC UCSF		Use at 1 mg/kg mouse
Alcohol wipes	Becton Dickinson	326895
28 G x 1/2 in. insulin syringe	Becton Dickinson	329465
Remium cover glass	Fisher Scientific	12-548-5M	24×50-1
Betadine	LARC UCSF
Heat blanket	Gaymar Industries
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45	Turn ON 30 min before use
Cotton tipped apllicators 6-inch	Electron Microscopy Sciences	72310-10
Anesthesia system	Summit Anesthesia Support
Inverted microscope	Carl Zeiss Inc	Zeiss Axiovert 200M
Stage insert	Applied Sientific Instrumentation
Mouse Ox oximeter, software and sensors	Starr Life Sciences	MouseOx
Nebulizer	Summit Anesthesia Support
Imaris	Bitplane
&mu;Manager	Vale lab, UCSF		Open-source software
ICCD camera	Stanford Photonics	XR-Mega-10EX S-30
Spinning disk confocal sacan-head	Yokogawa Corporation	CSU-10b