Methodenartikel

Erzeugung Enterobacter Sp. Ysu Auxotrophe Mit Transposon-Mutagenese

DOI:

10.3791/51934

⸱

31. Oktober 2014

1Department of Biological Sciences, Center for Applied Chemical Biology, Youngstown State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enterobacter sp. Ysu wächst in Glucose-Minimalsalzmedium. Auxotrophe werden durch Transformation mit einem transposome die zufällig fügt sich in das Wirtsgenom erzeugt. Mutanten werden durch Replika-Plattierung aus komplexen Medium, um Minimalmedium gefunden. Unterbrochen Gene durch Gen Rettungs- und Sequenzierung identifiziert.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prototrophe Bakterien wachsen auf M-9 Minimalsalzmedium mit Glucose (M-9-Medium) ergänzt, die als Kohlenstoff- und Energiequelle verwendet wird. Auxotrophe können mit einem transposome erzeugt werden. Die im Handel erhältlichen, Tn 5 stamm transposome in diesem Protokoll verwendet wird, besteht aus einem linearen DNA-Segment, das ein Replikationsursprung R6K γ, der ein Gen für Kanamycinresistenz und zwei Mosaiksequenz endet, die als Transposase-Bindungsstellen dienen. Die transposome, als DNA / Transposase Proteinkomplex vorgesehen ist, wird durch Elektroporation in die prototrophen Stamm, Enterobacter sp eingeführt. Ysu und schließt sich zufällig in diesWirtsGenom. Transformanten werden auf Luria-Replika-Bertani-Agarplatten ausplattiert, die Kanamycin (LB-kan) und auf M-9 Medium-Agar-Platten mit Kanamycin (M-9-kan). Die Transformanten, die auf LB-kan Platten auf M-9-kan Platten wachsen, aber nicht gelten als Auxotrophen sein. Gereinigter genomischerDNA aus einer auxotroph ist teilweise verdaut, ligiert und in einen pir + Escherichia coli (E. coli) Stamm transformiert. Die R6Kγ Replikationsursprung ermöglicht das Plasmid in pir + E. replizieren coli-Stämme und die Kanamycin-Resistenzmarker-Plasmid ermöglicht die Auswahl. Jede Transformante besitzt ein neues Plasmid, das das Transposon durch die unterbrochene chromosomale Region flankiert. Sanger-Sequenzierung und die Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) deuten auf eine vermeintliche Identität des unterbrochenen Gens. Es gibt drei Vorteile bei der Verwendung dieses transposome Mutagenese-Strategie. Erstens ist es nicht auf die Expression einer Transposase-Gen von der Wirts verlassen. Zweitens wird die transposome in den Ziel-Host durch Elektroporation, anstatt durch Konjugation oder Transduktion eingeführt und ist daher effizienter. Drittens macht die R6Kγ Replikationsursprung es leicht zu identifizieren, die die mutierte gene, die in einem rekombinanten Plasmid teilweise zurückgewonnen wird. Diese Technik kann verwendet werden, um die in anderen Eigenschaften von Enterobacter sp beteiligten Gene zu untersuchen. Ysu oder einer größeren Vielzahl von Bakterienstämmen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prototrophe Bakterien wachsen in M-9-Minimalsalzmedium, das Glucose (M-9-Medium) enthält, Glukose durch Umwandeln zentralen Kohlenstoffwechselwege für die Vor-, wie Aminosäuren, Nucleinsäuren und Vitamine zu erzeugen, für die Biosynthese 1. M-9-Medium enthält Ammoniumchlorid als Stickstoffquelle, Natrium- und Kaliumphosphat als Puffer und Phosphorquelle, Magnesiumsulfat als Schwefelquelle und Glucose als Kohlenstoff- und Energiequelle. Luria-Bertani (LB) Medium reich an Aminosäuren aus Trypton und Vitamine und Wachstumsfaktoren aus Hefeextrakt. Es unterstützt das Wachstum von auxotrophen Mutanten, die Aminosäuren, Vitamine und andere Wachstumsfaktoren für das Wachstum auf M-9 Medium benötigt nicht synthetisieren kann. So wird Prototrophe in LB und M-9 Medium wachsen, während Auxotrophen wird in LB-Medium, aber nicht in M-9 Medium wachsen. Durch Einführen von Mutationen in einen prototrophen Population von Bakterien und Identifizierung mutierter Gene, die auxotrophen Phänotyp verursachen, ist es possible um ein besseres Verständnis des Stoffwechsels in einem Bakterienstamm zu erhalten.

Transposon-Mutagenese kann verwendet werden, um viele der für das Wachstum auf Glucose in M-9-Medium erforderlichen Gene zu identifizieren. Transposons fügen sich zufällig in das Wirtsgenom 2. Durch Tüpfeln Transposon Transformanten auf LB-Agar-Platten und Replika Plattierung sie auf M-9 Medium-Agar-Platten, ist es möglich, für Auxotrophe screenen. Unterbrochen Gene durch Gen-Rettungs identifiziert. In dieser Studie wird ein handelsüblicher Tn5 abgeleitetes transposome die als Lösung eines linearen DNA-Segments mit Transposon-Transposase-Protein gemischt geliefert wird. Das DNA-Segment fehlt ein Transposase-Gen, enthält jedoch ein Gen für Kanamycinresistenz, einen γ R6K-Replikationsursprung und zwei Mosaik Motive, die DNA-Sequenzen für Transposase Bindung an jedem Ende des Segments 3,4 sind. Da das Transposase-Protein direkt an die DNA, die DNA-Segment alleine hinzugefügtals Transposon definiert, und die DNA / Protein-Komplex Transposase als transposome definiert. Die transposome durch Elektroporation 5 in eine Kanamycin empfindlich Host (1A) transformiert. Kolonien, die auf LB-Agarplatten mit Kanamycin (LB-kan) wachsen Transposon Einsätze (1B) und replikaplattiert Anten, die auf M-9 Medium-Agar-Platten mit Kanamycin (M-9-kan) sind auxotrophen nicht wachsen (Figire 1C). Genomischer DNA aus einer Mutante gereinigt und teilweise mit dem 4-Basisschneidende Restriktionsendonuklease, BFU CI (1D) verdaut. Die ligierte DNA wird in einem Stamm von Escherichia coli (E. coli) transformiert, dass das pir-Gen (1E) enthält. Dieses Gen ermöglicht das neue Plasmid, das Transposon und flankierenden chromosomalen Wirts-Region in E. replizieren 6 coli. Das Kanamycin-Resistenz-Gen dient als alselectable Marker für das neue Plasmid. Schließlich Sequenzierung unter Verwendung von Primern, die komplementär zu jedem Ende des Transposons und Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) Analyse der erhaltenen 7,8-Sequenz verwendet werden, um die Identität des unterbrochenen Gene zu bestimmen.

Diese transposome Mutagenesestrategie bietet drei Vorteile 3. Erstens, da die Transposase-Protein direkt mit dem Transposon gebunden, Insertion nicht auf die Expression der Transposase-Gens im Wirt ab. Sobald das Transposon integriert sich in das Wirtsgenom wird die Transposase verschlechtert, verhindert weitere Bewegung des Transposons. Allerdings können zusätzliche Bewegung nicht verhindert werden, wenn der Host besitzt eine endogene Tn 5 Transpositionselement. Zweitens Einführung des transposome durch Elektroporation macht es möglich, sie in einer Vielzahl von Wirten verwendet werden. Es entfällt auch die Notwendigkeit, das Transposon durch bakterielle Konjugation oder durch Einführung viral-Infektion. Beide Verfahren erfordern eine Wirtsempfindlichkeit. Drittens Aufnahme des Kanamycin-Resistenz-Gen und den Replikationsursprung R6K γ im transposome macht es einfacher, das unterbrochene Gen zu identifizieren. Transposon-unterbrochenen Bereiche gespeichert und sequenziert, wie Plasmide, wodurch die Notwendigkeit, die inverse Polymerasekettenreaktion (PCR) zur Identifizierung von Genen verwendet werden.

Die in diesem Video vorgestellt Protokoll beschreibt jeden Schritt zur Transposon-Mutagenese von Enterobacter sp. Ysu 9 mit einem transposome von seiner Einführung in den Bakterienzellen zur Identifikation der putativen Gens er unterbrochen. Zusätzlich zum zuvor veröffentlichten Protokollen 3,4,10 werden detaillierte Verfahren zur Verwendung Replika-Plattierung für Auxotrophe Bildschirm dargestellt. Dieses Mutagenese-Technik kann zur Untersuchung von anderen Phänotypen, wie Antibiotika-Resistenzen und Metall verwendet werden, in verschiedenen Arten von Bakterien, identifying die minimale Anzahl von Genen für Wachstums unter definierten Kulturbedingungen in der synthetischen Biologie Studium erforderlich ist oder für den Unterricht ein Labor Bestandteil einer Genetik oder mikrobielle Physiologie natürlich.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Elektroporation von Competent Cells 5,11

  1. Eine verdünnte O / N-Kultur von LB Enterobacter sp. Ysu 1/20 in 50 ml frischem LB-Medium und wachsen zu einer OD (600 nm) von 0,4 bis 0,6 unter Schütteln bei 120 rpm und 30 ° C. Optional wachsen andere Bakterienstämme auf ihre optimale Wachstumstemperatur.
  2. Kühlen der Zellen auf Eis für 5 Minuten und Zentrifugation bei 4 ° C und 7.000 × g für 5 min.
  3. Überstand verwerfen, Resuspendieren der Zellen in 50 ml sterilem eiskaltem Wasser und Zentrifuge bei 4 ° C und 7.000 × g für 5 min. Wiederholen Sie diesen Schritt.
  4. Überstand verwerfen und die Zellen werden in einem Volumen von eiskaltem Wasser gleich dem Zellpelletvolumen. Für die Langzeitlagerung, Waschen der Zellen mit 10 ml eiskalter 10% (v / v) Glycerin, resuspendieren in einem gleichen Pelletvolumen eiskaltem 10% (v / v) Glycerin, bei -80 ° C und Auftauen auf Eis vor der Elektroporation.
  5. Mit 0,5 ul der transposome 40 ulZellen. Das im Handel erhältliche transposome Lösung wird bei einer DNA-Konzentration von 0,33 ug / ul geliefert. Obwohl 0,33 ug empfohlen wird, ist 0,165 & mgr; g DNA ausreichend.
  6. Legen Sie die Zelle / transposome Mischung in einer eiskalten, 0,2 mm, Elektroporationsküvette und tippen Sie die Mischung auf dem Boden der Küvetten. Schock die Zellen in 25 & mgr; F, 200 Ω und 2,5 kV. Um sicherzustellen, dass die Zellen bleiben gekühlt, vor dem Gebrauch die Elektroporationsküvetten in einem -20 ° C Gefrierschrank lagern.
  7. Unmittelbar, fügen 960 ul Filter sterilisiert SOB-Medium mit Katabolitrepression (SOC) Medium. Mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren und übertragen Sie die Zellen in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
    HINWEIS: Die Zellen beginnen, nach dem Schock sterben, aber das Salz in der SOC-Medium können sie sich zu erholen. Um zu sparen, ist es nicht notwendig, transposome hinzuzufügen oder um die negativen Kontrollzellen zu schocken. Fügen Sie einfach 960 ul sterilem SOC-Medium zu.
  8. Inkubieren der Zellen bei 30 ° C foder 45-60 min mit 120 rpm schütteln. Dies bietet Zeit für die transposome mit dem Wirtsgenom und die Zellen rekombinieren Kanamycinresistenz exprimieren.
  9. Verbreiten Sie 100 ul von Zellen auf einer LB-kan-Agar-Platte und Inkubation der Platte O / N bei 30 ° C. Bewahren Sie die restlichen Transformationsmischung im Kühlschrank bei 4 ° C. Verbreiten Sie zusätzliche Beträge zu einem späteren Zeitpunkt bis zu 2 Wochen nach der ersten Elektroporation, falls erforderlich.

2. Gridding von Transformanten

  1. Band ein Gitter auf den Deckel eines leeren 100 x 15 mm Petrischale. Kopieren Sie ein Raster von "A Short Course in Bacterial Genetics" 12.
  2. Zeichnen Sie eine Linie auf dem Boden eines LB-kan-Agar-Platte. Mit einem kleinen Stück Klebeband, um es in die gerasterten Deckel zu verankern, so dass das Netz durch den Agar sichtbar ist. Sicherzustellen, daß die Linie, auf der Unterseite der Platte ist mit dem oberen, in der Mitte des Gitters ausgerichtet. Die Verankerung der Platte mit Klebeband hält sie rutscht, was eine noch Gridding. Die Linie erleichtert Kolonie Identifikation nach Replikaplattierung.
  3. Wählen Sie eine einzelne Transformante mit einem sterilen Zahnstocher und Spot es in der Mitte eines Platzes in der Startaufstellung. Berühren Sie einfach die Kolonie und die Stelle. Graben Sie nicht die Zahnstocher in den Agar. Um eine Verunreinigung der Platte zu vermeiden, behandeln den Zahnstocher nur an einem Ende.
  4. Finde einen anderen Transformante in ein angrenzendes Feld, wie in Schritt 2.3. Wenn die Platte voll ist, bebrüten es O / N bei 30 ° C. Dies ist der Masterplatte.

3. Replikaplattierung die Auxotrophie Phänotyp 12 Bestimmen

  1. Für jede Platte, die gerasterten wurde, stellen Sie einen Stapel von drei frischen Agarplatten nummeriert eins bis drei: eine für LB-kan, zwei für M-9-kan und drei für LB-kan. Trocknen der Platten auf den Kopf, O / N bei 37 ° C vor dem Gebrauch.
  2. Zeichnen Sie eine Linie auf der Oberseite jeder Platte wie in Schritt 2.2.
  3. Wischen Sie die Replica-Plating-Tool mit 70% Ethanol, legen Sie eine sterile velveteen Quadrat auf der Oberseite des Replika-Plattierung aufol und klemmen Sie die velveteen Quadrat nach unten. Hände sind mit Mikroben wimmelt sogar nach dem Waschen sie. Verhindern, dass der Einführung von verunreinigenden Mikroben durch den Umgang mit den Samt Quadrat am Rand an.
  4. Richten Sie die Linie auf der Masterplatte mit einer Linie auf der Klemme gezogen und legen Sie die Platte auf der Oberseite des velveteen Quadrat. Drücken Sie vorsichtig, um die Bakterien von der Platte auf den Samt Quadrat übertragen. Achten Sie darauf, um die Bakterien zu verschmieren. Entfernen Sie die Masterplatte aus der Samt Platz.
  5. Richten Sie die Zeile auf Platte Nummer eins gezogen mit der Linie auf der Klemme und setzen Sie ihn auf der Samt Platz. Drücken Sie vorsichtig, um die Bakterien aus der Samt Quadrat auf die Platte übertragen. Entfernen Platte Nummer eins.
  6. Entsorgen Sie die velveteen Quadrat in ein Becherglas mit Wasser und legen Sie eine saubere, sterile velveteen Quadrat auf der Replikaplattierung Werkzeug wie in Schritt 3.3. Dieser Schritt verhindert Überimpfung, die bahnbrechende Wachstum und falsch positiven Ergebnissen führt.
  7. Richten Sie dieLinie auf Platte Nummer eins mit der Linie auf der Klemme und setzen Sie ihn auf der neuen Samt Platz. Drücken Sie vorsichtig, um die Bakterien von der Platte Nummer eins auf den Samt Quadrat übertragen. Entfernen Platte Nummer eins.
  8. Richten Sie die Zeile auf Platte Nummer zwei gezogen mit der Linie auf der Klemme und setzen Sie ihn auf der Samt Platz. Drücken Sie vorsichtig, um die Bakterien aus der Samt Quadrat Platte Nummer zwei zu übertragen. Entfernen Platte Nummer zwei.
  9. Wiederholen Sie Schritt 3.8 für Platte Nummer drei. Die dritte Platte ist eine Steuerung für eine vollständige Übertragung von der Master-Platte zu den beiden anderen Platten. Entsorgen Sie die velveteen Quadrat in einen Becher Wasser. Um die velveteen Quadrate wiederverwenden, Autoklavieren den Becher mit dem kontaminierten velveteen Quadrate, waschen Sie sie, trocknen sie, wickeln Sie sie in Alufolie und neu autoklavieren.
  10. Die Inkubation bei 30 ° CO / N. Kolonien, die auf beiden LB-kan-Agar-Platten wachsen, aber keine Einigung über M-9-kan Platten wachsen werden als Auxotrophen (sein Abbildung 2).
  11. Streak aus Auxotrophen von Platte Nummer eins auf eine frische LB-kan-Agar-Platte, und Inkubation der Platte bei 30 ° CO / N.
  12. Streak für Trennung 3 Kolonien von der Ausstrichplatte in Schritt 3.11 auf eine frische LB-kan Platte. Die Platte bei 30 ° CO / N. Dies stellt sicher, dass die Mutante ist gut isoliert. Teilen Sie die Platte in Drittel und streifen aus jeder Kolonie in einem Abschnitt.
  13. Spot-Kolonien aus den ausgestrichen Kolonien von Schritt 3.12 auf eine frische LB-kan Platte abgeleitet, um ein Gitter, wie in den Schritten 2.1-2.4 bilden. Jede Mutante ist in dreifacher Ausfertigung erneut getestet.
  14. Replizieren Platte wieder wie in den Schritten von 3,1 bis 3,10, um den Auxotroph Phänotyp zu bestätigen.

4. Gene Rettungs

  1. Wachsen Sie ein 3 ml O / N-Kultur eines isolierten Mutante Kolonie aus Schritt 3.13 in flüssigem LB-kan-Medium bei 30 ° C. Reinige genomischer DNA aus 1 ml der Kultur unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen genomischen DNA-Reinigungskits.
  2. Richten Sie eine Mischung aus 0.025 UBFU CI-Restriktionsendonuclease und 14 & mgr; l von 1 & mgr; g / & mgr; l genomische DNA in einer 20 ul Reaktion auf Eis. Da BFU CI schneidet das Transposon an zwölf verschiedenen Stellen, kann es effizienter sein, Restriktionsendonuclease, Bfa I oder Hae III, welches das Transposon an zwei und drei verschiedenen Stellen schneidet, jeweils verwenden.
  3. Inkubieren der Reaktion bei 37 ° C für 25 min und dann bei 80 ° C für 20 Minuten, um das Enzym zu inaktivieren. Analyse 3 ul des teilweise verdaute DNA auf einem 0,8% Agarosegel (Abbildung 3). Eine erfolgreiche partiellen Verdau ergibt einen Ausstrich von über 10 kb bis zum Boden des Gels.
  4. Ligieren 15 ul teilweise verdauten genomischen DNA mit 800 Einheiten T4-DNA-Ligase in einem 500 & mgr; l Reaktion. Inkubieren Sie die Reaktions O / N bei 4 ° C. Die großen Reaktionsvolumen maximiert die Ligation von einzelnen Fragmenten, sich selbst und minimiert die Wechselwirkung zwischen zwei oder mehr DNA-Fragmente.
  5. Niederschlagste der ligierten DNA durch Zugabe von 50 ul 3 M Natriumacetat, pH 5,5, und 1 ml 95% Ethanol und Inkubation bei -20 ° C für 20 min.
  6. Mikrozentrifugen die DNA bei 4 ° C und 13.500 g für 10 min, waschen Sie die Pellet mit 70% Ethanol, trocknen in einer Kreisel Vakuum-Konzentrator und resuspendieren es in 10 ul Nuklease freiem Wasser. Alternativ kann die DNA der Luft bei RT für 15 min getrocknet werden.
  7. Verwenden Sie 4 ul resuspendiert DNA von E. Transformation coli-Stamm ECD100D pir oder ECD100D pir116 durch Elektroporation, wie in Abschnitt 1. Die R6K γ Replikationsursprung erfordert ein Bakterienstamm mit einem pir-Gen zu replizieren 6. Der PIR-Stamm führt zu geringer Kopien Plasmide und die pir116 Stamm enthält ein pir mutierten Gens, die in hoher Kopien Plasmide führt. Jede Transformante enthält ein neues Plasmid mit dem Transposon und einem Bereich der unterbrochenen Chromosom (1E).
  8. Inoculaß 5 ml LB-Kan-Medium mit einer Einzelkolonie wachsen sie O / N bei 120 UpM und 37 ° C schütteln und zu reinigen Plasmid-DNA aus der gesamten O / N-Kultur unter Verwendung eines kommerziellen Kits.
  9. Digest 14 ul der Plasmid mit der Restriktionsendonuklease Xho I. Sicherstellen, dass das Endvolumen der Reaktion beträgt 20 & mgr; l. Dieses Enzym erkennt eine Stelle in der Mitte des Transposons in das 5'-Ende des Kanamycin-Resistenz-Gen. Analyse 10 ul der unverdauten und verdauten Plasmid auf einem 0,8% Agarosegel (Abbildung 3). Das Plasmid besteht aus dem 2 kb Transposon zzgl flankierenden Wirts-DNA.

5. DNA-Sequenzierung

  1. Sequenz, die das Plasmid unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Sequenzierungs-Kits, Primer, die homolog zu jedem Ende des Transposons sind, und eine Kapillare Sequenzierungsanalyse-System. Alternativ kann das Plasmid an einer Außen Einrichtung zur Sequenzierung versendet.
  2. Verwenden Sie den Molekulargewichtsstandard (1 kb Leiter) indas Gel, um die Größe des Plasmids zu schätzen. Dann schätzen die Zahl der Nanogramm (ng) Plasmid, das für 50 fmol erforderlich ist.
  3. Messung der Konzentration der Plasmid-DNA unter Verwendung eines Spektrophotometers bei Wellenlängen von 260 nm (A 260) und 280 nm (A 280). Sicherstellen, dass die Länge des Lichtweges durch die Küvette beträgt 1 cm. Bestimmung der Konzentration durch Multiplikation der Absorption bei 260 nm von 50 ng / & mgr; l. Hochwertige Plasmid-DNA wird einen A 260 / A 280 Verhältnis zwischen 1,8 und 2,0.
  4. Das Volumen der für jede Sequenzierungsreaktion erforderlichen DNA ist die Anzahl der NG 50 fmol dividiert durch die Konzentration des Plasmids erforderlich. Mischen das notwendige Volumen des Plasmids mit Wasser, um das Gesamtvolumen auf 10 ul zu bringen.
  5. Erhitzen der Plasmid-DNA / Wasser-Gemisch bei 96 ° C für 1 min und dann auf RT kühlen.
  6. Hinzufügen 8 ul Mastermix aus der Sequenzierungs-Kit und 2 & mgr; l von 1,6 & mgr; M einer der Sequenzierungsprimer.
  7. FolNieder das Protokoll aus der Sequenzierungs-Kit für den Thermocycler-Programm und Reaktions Bereinigung.
  8. Analysieren Sie jede Probe unter Verwendung einer Kapillare DNA-Analyse-System.
  9. Verwenden Sie einen im Handel erhältlichen Software-Paket, um die DNA-Sequenz zu sehen. Die Suche nach der Sequenz "5'-GAGACAG-3 '", die die letzten 7 bp des Transposons (Figur 4) ist. Die Sequenz vor dem 5'-Ende dieser 7 bp-Segment ist in dem Transposon. Die Sequenz nach dem 3'-Ende dieser 7 bp-Segment ist in dem unterbrochenen Gens.
  10. Ermitteln Sie die mögliche Funktion des unterbrochenen Gens unter Verwendung der Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 7,8. Verwenden Sie die folgende link: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch . Fügen die Sequenz der Unterbrechungsed-Gen in das Suchfeld, wählen Sie "Andere" unter der Datenbank und klicken Sie auf "BLAST" am unteren Rand der Seite. Wenn das Ergebnis angezeigt wird, scrollen Sie die Seite, um die Alignment-Ergebnisse (Abbildung 5) zu sehen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transformation von Enterobacter sp. Ysu durch Elektroporation mit dem transposome eingeleitet Zufalls Genom Insertion in das Wirtsgenom (1A, B). Eine erfolgreiche Elektroporation ergab mehrere tausend Transformanten, auf LB-kan Platten wuchs. Um 300-400 zu erhalten, gut verteilte Kolonien pro Platte, wurde die Menge der Transformationsmischung Spread an jedem LB-kan-Agar-Platte optimiert. Jeder Trans enthalten mindestens ein Transposon-Einsatz, aber es war nicht klar, ob ein wichtiges Gen für d...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transposon-Mutagenese unter Verwendung eines transposome ist ein effizientes Werkzeug zur Erzeugung Auxotrophen in Enterobacter sp. Ysu und andere Arten von Gram-negativen und Gram-positiven Bakterien 3,4. Das Verfahren wurde durch Einführung der Tn5 abgeleitetes transposome in den Wirt durch Elektroporation eingeleitet. Kolonien mit Inserts zu identifizieren, hatten die nicht-transformierten Target-Stamm empfindlich sein gegenüber Kanamycin, um die Resistenzmarker von dem Transposon auszuwä...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Autor hat nichts zu offenbaren.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Autor möchte allen meinen Bachelor Independent Research Studenten und alle meine Microbial Physiology Studenten, die während der 2010-2014 Frühjahr Semester meines Transposon-Mutagenese Ideen getestet danken. Diese Arbeit wurde durch das Department of Biological Sciences an Youngstown State University finanziert.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
EZ-Tn5 R6Kγ ori/KAN-2 Tnp Transposomen-KitEpizentrum (Illumina)TSM08KR
EC100D pir+ Elektrokompetentes E. coli-Epizentrum(Illumina)ECP09500Kann Plasmide mit einem R6K&gamma-Replikationsursprung bei einer niedrigen Kopienzahl replizieren
EC100D pir-116 Elektrokompetentes E. coli-Epizentrum(Illumina)EC6P095HKann Plasmide mit einem R6K&gamma replizieren; Replikationsursprung bei einer hohen Kopienzahl
5X M-9 SalzeThermo FisherDF048517
Lennox LB BouillonThermo FisherBP1427-2
AgarAmresco, Inc.J637-1KGFeste Medien enthielten 1,6 % (w/v) Agar
Kanamycinsulfat Amresco, Inc.0408-25GBei Bedarf enthielten die Medien 50 μm; g/ml Kanamycinsulfat
D-Glukose-MonohydratAmresco, Inc.0643-1KG
HefeextraktAmresco, Inc.J850-500G
TryptonAmresco, Inc.J859-500G
KClSigma-AldrichP4504-500G
NaClAmresco, Inc.X190-1KG
MgCl2Fisher ScientificBP214-500
MgSO2Fisher ScientificBP213-1
Super Optimale Bouillon mit Katabolit-Repressionsmedium (SOC) Medium0,5 % (w/v) Hefeextrakt, 2 % (w/v) Trypton, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 und 20 mM Glukose
BfuC INEBR0636STeilverdau genomischer DNA
Xho INEBR0146SPlasmidaufschluss
T4 DNA-LigaseNEBM0202S
Nukleasefreies WasserAmresco, Inc.E476-1LZum Auflösen von gefällter DNA und Restriktions-Endonuklease-Reaktionen
GenomeLab DTCS - Quick Start Kit BeckmanCoulter608120DNA-Sequenzierungs-Wizard
Genomic DNA-AufreinigungskitPromegaA1120A
Wizard Plus SV Minipreps DNA-AufreinigungssystemPromegaA1460Plasmid-Aufreinigung
Replica Plating BlockThermo Fisher09-718-1
Velveteen SquaresThermo Fisher09-718-2Replica Beschichtung
PetriStickersDiversified BiotechPSTK-1100Gitter für Replica Beschichtung
PetrischalenThermo FisherFB0875712
Gene Pulser IIBioRadElektroporation
Elektroporation Küvetten – 2 mmBioExpressE-5010-2
CentriVap DNA-VakuumkonzentratorLabconco7970010Trocknung von DNA
CEQ 2000XL DNA-AnalysesystemBeckman CoulterDNA-Sequenzierungsvektor
NTI Advance 11.5.0Life TechnologiesDNA-Sequenzanalyse
, 12605099

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kim, B. H., Gadd, G. M. Bacterial physiology and metabolism. , Cambridge University Press. Cambridge. (2008).
  2. Hayes, F. Transposon-based strategies for microbial functional genomics and proteomics. Annual review of genetics. 37, 3-29 (2003).
  3. Hoffman, L. M. Random chromosomal gene disruption in vivo using transposomes. Methods in molecular biology. 765, Clifton, N.J. 55-70 (2011).
  4. Goryshin, I. Y., Jendrisak, J., Hoffman, L. M., Meis, R., Reznikoff, W. S. Insertional transposon mutagenesis by electroporation of released Tn5 transposition complexes. Nature biotechnology. 18 (1), 97-100 (2000).
  5. Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High Efficiency Transformation of E. coli by High Voltage Electroporation. Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).
  6. Metcalf, W. W., Jiang, W., Wanner, B. L. Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance of R6Kγ origin plasmids at different copy numbers. Gene. 138 (1-2), 1-7 (1994).
  7. Morgulis, A., Coulouris, G., Raytselis, Y., Madden, T. L., Agarwala, R., Schäffer, A. a Database indexing for production MegaBLAST searches. Bioinformatics. 24 (16), Oxford, England. 1757-1764 (2008).
  8. Zhang, Z., Schwartz, S., Wagner, L., Miller, W. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of computational biology a journal of computational molecular cell biology. 7 (1-2), 203-214 (2000).
  9. Holmes, A., Vinayak, A., et al. Comparison of two multimetal resistant bacterial strains: Enterobacter sp. YSU and Stenotrophomonas maltophilia OR02. Current microbiology. 59 (5), 526-531 (2009).
  10. Hoffman, L. M., Jendrisak, J. J., Meis, R. J., Goryshin, I. Y., Reznikoff, W. S. Transposome insertional mutagenesis and direct sequencing of microbial genomes. Genetica. 108 (1), 19-24 (2000).
  11. Ausubel, F., Brent, R., et al. Short Protocols in Molecular Biology. , John Wile., & Sons, Inc. New York, NY. (1997).
  12. Miller, J. H. A short course in bacterial genetics: a laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, N.Y. (1992).
  13. Gibson, M. I., Gibson, F. Preliminary studies on the isolation and metabolism of an intermediate in aromatic biosynthesis: chorismic acid. The Biochemical journal. 90 (2), 248-256 (1964).
  14. Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), (2003).
  15. Reznikoff, W., Winterberg, K. Transposon-Based Strategies for the Identification of Essential Bacterial Genes. Microbial Gene Essentiality: Protocols and Bioinformatics SE. 2, 13-26 (2008).
  16. Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. Random genome deletion methods applicable to prokaryotes. Applied Microbiology and Biotechnology. 79 (4), 519-526 (2008).
  17. Malley, M. A., Powell, A., Davies, J. F., Calvert, J. Knowledge-making distinctions in synthetic biology. BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 30 (1), 57-65 (2008).
  18. Zheng, Y. -N., Li, L. -Z., et al. Problems with the microbial production of butanol. Journal of industrial microbiolog., & biotechnology. 36 (9), 1127-1138 (2009).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Auxotroph GenerierungElektroporationstechnikReplica PlatingKanamycin Resistenzgenomische DNA AufreinigungSanger SequenzierungBLAST AnalyseR6K Replikationsursprung

Verwandte Artikel