Methodenartikel

Von Fast Fluoreszenz-Imaging, um molekulare Diffusion Gesetz über Live Cell Membrane in einem kommerziellen Mikroskop

DOI:

10.3791/51994

⸱

9. Oktober 2014

 ,  ,  , 
1NEST Laboratory, Scuola Normale Superiore, 2Center for Nanotechnology Innovation, Instituto Italiano di Tecnologia, 3Laboratory for Fluorescence Dynamics, Department of Biomedical Engineering, University of California, Irvine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die räumliche Verteilung und zeitliche Dynamik von Plasmamembranproteinen und Lipiden ist ein heißes Thema in der Biologie. Hier wird dieses Problem durch eine räumlich-zeitliche Bildfluktuationsanalyse gelöst, die konzeptionell die gleichen physikalischen Größen der Einzelpartikelverfolgung liefert, jedoch kleine molekulare Markierungen und Standardmikroskopie-Setups verwendet.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Es wurde zunehmend klar, daß die räumliche Verteilung und die Bewegung der Membran-Komponenten wie Lipide und Proteine ​​sind Schlüsselfaktoren bei der Regulation vieler zellulärer Funktionen. Aufgrund der schnellen Dynamik und die winzigen Strukturen beteiligt sind, wird eine sehr hohe Raum-Zeit-Auflösung erforderlich ist, um das reale Verhalten von Molekülen zu fangen. Hier präsentieren wir die Versuchsprotokoll für die Untersuchung der Dynamik von fluoreszenzmarkierten Plasma-Membran-Proteine ​​und Lipide in lebenden Zellen mit hoher örtlicher und zeitlicher Auflösung. Bemerkenswerterweise ist dieser Ansatz nicht jedes Molekül zu verfolgen, aber es Population Verhalten unter Verwendung aller Moleküle in einer bestimmten Region der Membran berechnet. Der Ausgangspunkt ist eine schnelle Bebilderung einer bestimmten Region auf der Membran. Danach wird eine komplette räumlich-zeitlichen Autokorrelationsfunktion korreliert erfassten Bilder mit zunehmender Zeitverzögerungen, beispielsweise alle 2, 3, n Wiederholungen berechnet. Es ist möglich zu zeigen, dass die Breiteder Peak der räumlichen Autokorrelationsfunktion nimmt bei zunehmender Zeitverzögerung in Abhängigkeit von der Partikelbewegung aufgrund von Diffusion. Daher, passend der Serie von Autokorrelationsfunktionen ermöglicht, extrahieren die tatsächliche Protein mittlere quadratische Verschiebung von Bildgebung (IMSD), hier in der Form des scheinbaren Diffusions vs mittlere Verschiebung vorgestellt. Dies ergibt eine quantitative Blick auf die durchschnittliche Dynamik einzelner Moleküle mit Nanometer-Genauigkeit. Durch die Verwendung eines GFP-markierten Variante des Transferrinrezeptors (TfR) und einer ATTO488 Bezeichnung 1-Palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (PPE) ist es möglich, die Raumzeit-Regulierung von Protein-und Lipid-Diffusion beobachten um große Membranregionen der Mikro zu-Milli zweiten Zeitbereich.

Einleitung

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Ausgehend von der ursprünglichen "fluid mosaic"-Modell von Singer und Nicolson, das Bild der zellulären Plasmamembran kontinuierlich in den letzten Jahrzehnten um die Rolle der Schwellen Zytoskelett-und Lipid-Domänen enthalten 1,2 aktualisiert.

Die ersten Beobachtungen wurden durch Fluoreszenzerholung nach Photobleichen (FRAP) enthüllt, dass ein signifikanter Anteil von Membranproteinen unbeweglich 3-5 erhalten. Diese bahnbrechenden Studien, wenn auch sehr informativ, von der relativ schlechte Auflösung im Raum (Mikrometer) und die Zeit (in Sekunden) von FRAP-Setups gelitten. Auch als ein Ensemble Mittelung Messung, fehlt in FRAP mit Informationen über Einzelmolekülverhalten.

In diesem Zusammenhang ist die Möglichkeit, spezifisch zu markieren ein einzelnes Molekül mit sehr hellen Tags (die die Untersuchung des Diffusionsprozesses ein Molekül zu einem Zeitpunkt) ist sehr erfolgreich gewesen. Besonders, indem Sie dieZeitauflösung der Single Particle Tracking (SPT) Ansatz für die Mikrosekunden-Zeitskala, Kusumi et erhielten Zugang zu unbekannten Funktionen von Lipid-und Proteindynamik, die sich stark auf die Anerkennung der Rolle der Aktin-basierten Membranskelett in Membranphysiologie 6 beigetragen al. , 7. Diese Ergebnisse erzeugt die so genannte die "Lattenzaun und" Modell, in dem Lipid-und Proteindiffusion durch Aktin-Skelett-basierte geregelt. , Um den Zugriff auf die riesige Menge von Informationen, die von SPT viele experimentelle Fragen gestellt haben müssen jedoch angesprochen werden. Insbesondere wird das Markierungsverfahren typischerweise durch viele Schritte wie Herstellung, Reinigung und die Einführung der markierten Spezies in das System besteht. Weiterhin großen Labels, wie Quantenpunkte oder Metall-Nanopartikel, sind oft erforderlich, um die Sub-Millisekunden-Zeitskala und die Vernetzung der Zielmoleküle durch das Label nicht in vielen Fällen vermieden werden, zu erreichen. Schließlich sind viele Bahnenhaben aufzuzeichnenden statistischen Kriterien passen und damit eine niedrige Dichte des Etiketts erforderlich ist, um Tracking zu ermöglichen.

Im Vergleich zu SPT, Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS), die Überwindung viele dieser Nachteile stellt einen vielversprechenden Ansatz, um Molekulardynamik zu studieren. Tatsächlich funktioniert FCS gut auch mit dim und dichte Etiketten, so dass die Dynamik des fluoreszierenden Protein-markierte Moleküle in transient transfizierten Zellen zu studieren. Außerdem ermöglicht es erreichte hohe Statistiken in einem begrenzten Zeitraum. Schließlich trotz der "hohen" Dichte von Etiketten FCS bietet einzelne Moleküle Informationen. Dank all dieser Eigenschaften stellt FCS einen sehr einfachen Ansatz und wurde ausgiebig angewendet, um Lipid und Proteindynamik sowohl in Modellmembranen und im Live-Zellen 8-10 studieren. Viele verschiedene Ansätze vorgeschlagen worden, um die Fähigkeit von FCS auf die Details der molekularen Diffusion zeigen erhöhen. Zum Beispiel war es sheigenen, die durch Ausführen FCS auf unterschiedlich großen Beobachtungsgebiete kann man ein "FCS Diffusionsgesetz" aufschlussreich versteckt Merkmale des Molekularbewegung 11,12 definieren. Neben der Verwendung in der Größe variiert wurde die Schwerpunktbereich auch dupliziert 13, bewegt im Raum entlang der Linien 14-20 bzw. konjugiert mit schnellen Kameras 21,22. Mit Hilfe dieser "Raum-Zeit-'Korrelation Ansätze wurden relevante biologische Parameter von mehreren Membrankomponenten quantitativ auf beiden Modellmembranen und der tatsächlichen biologischen diejenigen, wodurch man einen Einblick in die räumliche Organisation Membran beschrieben.

Jedoch in aller FRAP und FCS Anwendungen bisher beschriebenen die Größe der Fokusfläche eine Grenze der räumlichen Auflösung, die nicht überwunden werden können. Mehrere Super-Resolution-bildgebenden Verfahren wurden kürzlich entwickelt, um diese Grenze zu umgehen. Einige sind auf Lokalisierungsgenauigkeit basiert, wie stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie (STORM) 23,24, Photoaktivierung Lokalisationsmikroskopie (PALM) 25, Fluoreszenz PALM (FPALM) 26 und single-particle tracking PALM (sptPALM) 27: Die relativ große Menge an Photonen bei jeder Momentaufnahme erforderlich ist, begrenzt jedoch die Zeitauflösung Diese Verfahren, um mindestens einige Millisekunden, wodurch ihre Anwendbarkeit in vivo hemmt.

Im Gegensatz dazu haben eine vielversprechende Alternative zur Super-Resolution Imaging von räumlichen Modulation der Fluoreszenzemission mit Stimulated Emission Depletion-Methoden (STED oder reversible optische Sättigungsfluoreszenzübergänge (RESOLFT)) 28,29 geöffnet. Diese Ansätze kombinieren die Gestaltung der Beobachtungsvolumen deutlich unter der Beugungsgrenze mit der Möglichkeit, schnelle Scan-Mikroskope und Detektionssysteme zu verwenden. In Kombination mit Fluoreszenzfluktuationsanalyse, erlaubt der STED-Mikroskopie, um direkt Sonde die raumzeitliche Dynamik von nanoskaligen Lipide und proteins live Zellmembranen 30,31.

Die gleichen physikalischen Größen STED-Mikroskopie anhand kann durch eine modifizierte raumzeitlichen Bildkorrelationsspektroskopie (Stics 32,33) Verfahren, die für die Untersuchung der Dynamik von fluoreszenzmarkierten Membranproteine ​​und / oder Lipiden in lebenden Zellen erhalten werden und von einem kommerziellen Mikroskop. Das experimentelle Protokoll hier präsentiert wird nur von wenigen Schritten zusammen. Die erste erfordert eine schnelle Abbildung des Bereichs von Interesse auf der Membran. Dann wird der resultierende Stapel von Bildern verwendet, um die durchschnittlichen räumlichen-zeitlichen Korrelationsfunktionen zu berechnen. Vs -Mittlere Verschiebung Grundstück - von der Montage der Serie von Korrelationsfunktionen, die molekulare 'Diffusionsgesetz "kann direkt von der Bildgebung in Form einer scheinbaren Diffusionskoeffizienten (D app) erhalten werden. Dieses Grundstück kritisch hängt von der Umgebung durch die Moleküle erforscht und ermöglicht direkt die Anerkennung der tatsächlichen Diffusionsartender Lipid / Protein von Interesse.

In mehr Details, wie zuvor gezeigt, 34, die räumlich-zeitliche Autokorrelationsfunktion des erworbenen Bild-Serie hängt entscheidend von der Dynamik der Moleküle sich in den gesammelten Bild-Serie (bitte beachten Sie, dass die gleiche Argumentation kann in einer Linie Erwerb angewendet werden wo nur eine Dimension im Raum wird berücksichtigt). Insbesondere definieren wir die Korrelationsfunktion als:

figure-introduction-1 (1)

wo figure-introduction-2 die gemessene Fluoreszenzintensität an der Position x, y, und zum Zeitpunkt t, figure-introduction-3 und figure-introduction-4 stellt den Abstand in der x-undy-Richtung jeweils figure-introduction-5 repräsentiert die Zeitverzögerung, und figure-introduction-6 stellt den Mittelwert. Diese Funktion kann wie folgt ausgedrückt werden:

figure-introduction-7 (2)

wobei 'n' die durchschnittliche Anzahl der Moleküle in dem Überwachungsbereich, figure-introduction-8 stellt die Faltungsoperation im Raum, und figure-introduction-9 stellt die Autokorrelation der Instrumental Taille. Diese letztere kann als Maß dafür, wie die Photonen eines einzelnen Emitter sind verstreut im Raum aufgrund der optischen / Recording Setup interpretiert werden (die so genannte Point Spread Function, PSF, Gen-Kundgebung gut durch eine Gauß-Funktion angenähert). Schließlich figure-introduction-10 die Wahrscheinlichkeit, ein Teilchen in einem Abstand zu finden figure-introduction-11 und figure-introduction-12 nach einer Zeitverzögerung figure-introduction-13 . Wenn wir ein Diffusionsdynamik, in denen Teilchen bewegen sich zufällig in alle Richtungen und Nettoflüsse vorhanden sind nicht der Ansicht, diese Funktion ist auch gut mit einer Gauß-Funktion, bei der die Varianz kann als der mittlere quadratische Verschiebung (MSD) des beweglichen Teilchen identifiziert werden angenähert . Somit ist die Taille der Korrelationsfunktion (auch bezeichnet als figure-introduction-14 ), Kann als die Summe der Partikel MSDS und Instrumental Taille festgelegt und kann durch eine Gaußsche Form gemessen werdenlung der Korrelationsfunktion für jede Zeitverzögerung. Die gemessene I MSD verwendet, um eine scheinbare Diffusivität der beweglichen Moleküle zu berechnen figure-introduction-15 und einen mittleren Verschiebungs figure-introduction-16 Beispiel:

figure-introduction-17 (3)

figure-introduction-18 (4)

Paar Überlegungen über die verwendeten Versuchsaufbau können die Leser in den folgenden Abschnitten zu führen. Um die Fluorophore auf der Basalmembran von lebenden Zellen werden wir eine Totalreflexion (TIR) ​​Beleuchtung zu verwenden, mit einem handelsüblichen TIR Fluoreszenz selektiv anzuregen (TIRF)-Mikroskop (Details finden Sie in der Materialabschnitt zu finden). Darüber hinaus, um zu sammeln the Fluoreszenz wir eine hohe Vergrößerung Ziel verwenden und ein EMCCD Kamera (physikalische Größe der Pixel auf dem Chip 16 um) (100X NA 1,47, wird eine hohe numerische Apertur für TIRF-Beleuchtung erforderlich). Um eine Pixelgröße von 100 nm zu erreichen wenden wir eine zusätzliche Vergrößerungslinse von 1.6X. Wie nachstehend erörtert, würde eine Zeitauflösung von weniger als 1 msec benötigt, um richtig beschreiben die Dynamik schneller Membranlipide unter 100 nm ist. Um diese zeitliche Auflösung zu erreichen müssen wir eine Region of Interest (ROI) wählen kleiner als der ganze Chip der Kamera (512 x 512). Auf diese Weise wird die Kamera eine verringerte Anzahl von Leitungen die Erhöhung der zeitlichen Auflösung zu lesen. Jedoch wird in diesem Auslese Regime die Rahmenzeit würde durch die erforderliche Zeit, um die Ladungen von dem Kontakt mit dem Auslesechip der Kamera zu verschieben und in der Regel in der Größenordnung von Millisekunden für 512 x 512 Pixel EMCCD- begrenzt. Um diese Grenze zu schlagen, ermöglicht eine neue Technologie Verschieben der den gesamten Rahmen ROI-Linien nur statt, wit einem praktischen effektive Reduktion des freigelegten Chipgröße (genannt Gestellte Sensor-Modus in unserem EM-CCD). Für diese Konfiguration wirksam zu sein, muss der Chip außerhalb der ROI von einem Paar von Schlitzen in dem optischen Weg angeordnet abgedeckt werden. Dank dieser Einrichtung eine Zeitauflösung von bis zu 10 -4 Sekunden erreicht werden kann. Bitte beachten Sie jedoch, dass dieser Ansatz mit vielen verschiedenen Versuchsanordnungen gekoppelt werden, wie im Abschnitt "Diskussion", erklärte.

Demonstration des Verfahrens wird in lebenden Zellen bereitgestellt werden, indem sowohl ein ATTO488 Bezeichnung 1-Palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (ATTO488-PPE) und ein GFP-markierten Variante des Transferrinrezeptors (GFP TFR). Im Fall von ATTO488-PPE kann dieser Ansatz erfolgreich eine nahezu konstante D app als Funktion der durchschnittlichen Verschiebung angibt, dass sie eine freie Diffusion zu erholen, wie zuvor berichtet 30,35. Dagegen TfR-GFP zeigt eine abnehmende D 6. Darüber hinaus wird in dem letzteren Fall ist es möglich, das lokale Diffusionskonstante und der mittleren Einschlussbereich über viele Mikrometer auf der Membranebene zu quantifizieren.

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Protokoll

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1. Systemkalibrierung

  1. Point Spread Function (PSF) Kalibrierung
    1. Verdünne 10 ul 30 nm Fluoreszenz Wulst Lösung (etwa 5 um) in 90 ul destilliertem Wasser und dann beschallt die Lösung für 20 min. Schneiden Sie ein Quadrat (1 cm x 1 cm) Stück Agarose-Gel (3%) und beträgt 10 ul der Lösung auf die Oberseite des Gels. Drehen Sie das Stück Gel auf der unteren Glas einer 2 cm Petrischale und drücken Sie die Tropfen auf dem Glas.
    2. Schalten Sie den Erwerb Setup, legen Sie die Probe in den Halter, stellen Sie die Kamera Belichtung und EMgain (100 ms und 1000 sind gute Parameter, sondern optimieren nach dem System) und warten Sie die Kamera abkühlen.
    3. Stellen Sie die Kamera Belichtung bis 100 ms, Kamera EMgain bis 1000, Erfassungsmodus zu übertragen, Wiederholung und 100 Auto-Save-Einstellung Rahmen.
    4. Mit Hilfe des Okulars und Durchlicht Fokus auf der Grenze des Gels und bewegen Sie dann das Ziel in der Mitte des Gels, stellen Sie den Fokus und start der Laserausrichtung Verfahren (LAS AF, wählen Sie "TIRF-Setup" und folgen Sie den Ausrichtungsvorgang auto).
    5. Finden Sie ein Sichtfeld mit isolierten einzelnen Spots, genau konzentrieren sich auf die helleren Fleck (die in der Regel stellt Perlen Aggregat) als Referenz, zu erwerben 100 Bilder und wiederholen Sie den Schritt 5-6 mal um mehrere einzelne Spots zu erwerben.
    6. Importieren Sie die erworbenen Serie mit einem Datenverarbeitungsprogramm und im Durchschnitt den Stapel in der Zeit (Abbildung 1A) und wählen Sie einen einzelnen isolierten Perle. Achten Sie darauf, um die Kleinsten zu wählen Partikelaggregate zu vermeiden.
    7. Die gewählten Intensitätsverteilung (ein Beispiel für Einzelperlen Profil ist in 1B vorgelegt) mit einer Gauß-Funktion mit dem Befehl "gaussfit" (in den ICS-Matlab-Tools in den Materialien in Matlab). Überprüfen Sie, ob die Güte der Anpassung durch Einsicht in die erhaltenen Reste (ein Beispiel für Einbau Gauß-Profil mit den entsprechenden Residuen vorgestellt in Abbildung 1B).
  2. Kamerakalibrierung
    1. Schalten Sie die Kamera, und warten Sie die Kamera abkühlen. Stellen Sie die Kamera Erwerb Einstellung, (dh für die verwendete Kamera setzen wir die Exposition gegenüber 0,5 ms, Kamera EMgain bis 1000, Erfassungsmodus zu Gestellte Modus, der ROI Größe 32 x 128, 10.000 Wiederholungen) und starten Sie die Übernahme von der Kamera Hintergrund Signal.
    2. Import erworben Rahmen Serie mit einem Datenverarbeitungsprogramm. Berechnen und überprüfen Sie die durchschnittliche Intensität in jedem Pixel, um zu überprüfen, dass die Kamera Hintergrund ist ungefähr Wohnung in der ausgewählten Region des Chips. In Freigestellte Modus, entfernen Sie den ersten und den letzten horizontalen Linien (3 bis 10, je nach der Größe der ROI) für jeden Rahmen, weil die Kamera Hintergrund wird in der Regel in den Grenzlinien vorgespannt ist.
    3. Erstellen Sie ein Histogramm der Werte (auch definiert digitale Ebene, DL) in aufgenommenen Bildern Stack (mit dem Befehl "hist" in Matlab) und plotten den Logarithmusder resultierende Frequenz (unter Verwendung semilogy Befehl in Matlab). Ein Beispiel für DL Verteilung Kamera Hintergrund ist in Figur 2 dargestellt.
      HINWEIS: Wenn die Kamera gut funktioniert, wird das Grundstück eine etwa Gauß-Peak (ein Parabelprofil in Log-Skala), die die Verteilung der Werte auf Null Photon, gefolgt von einem exponentiellen Abfall (eine Linie mit negativer Steigung in Log-Skala zugeordnet zeigen ), die die Verteilung der Werte 1 Photon (Figur 2) zugeordnet sind, stellen. Insbesondere das Zentrum und die Varianz der Gaußschen Funktion zeigen die Kamera-Offset-Fehler und jeweils während der Zerfallskonstante des exponentiellen Teil stellt eine Schätzung des DL von der Kamera auf jedes einzelne Photon zugeordnet. In Matlab verwenden Sie den Abschnitt "CalibrateCamera" der Script in Hilfsmaterialien.
    4. Wiederholen Sie den Vorgang für alle ausgewählten Kamera EMGain und Verstärkung.

2. beschriftetZellpräparation

  1. Um die für die Lipid-Einbau 36 erforderlich Liposomen Man löst getrennt 1 mg DOPE (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin), 1 mg DOTAP (1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propan), und 1 mg PPE-ATTO488 in 1 ml Chloroform. Mischen Sie 0,5 ml DOPE-Lösung, 0,5 ml DOTAP-Lösung und 25 ul PPE-ATTO488 Lösung und trocken unter Vakuum für 24 Stunden. 0,5 ml HEPES-Puffer, 20 mM, Vortex für 15 min mit Ultraschall 15 Minuten bei 40 ° C aufweist.
  2. Um die Zelle zu bereiten, waschen Sie 3-mal mit PBS eine p100 Gericht konfluenter CHO-K1 (Chinese Hamster Ovar), 1 ml Trypsin und speichern in Inkubator für 5 min. Aussetzen abgelösten Zellen die Zugabe von 9 ml DMEM / F12-Medium mit 10% FBS und Saatgut 150 ul Zell-Lösung in eine Petrischale mit 800 ul des gleichen Mediums.
  3. Lager im Brutschrank 24 h bei 37 ° C und 5% CO 2. Für die Lipid-Gründung, ersetzen Zellmedium mit 500ul serumfreiem Medium; nach 30 min, fügen 2 ul Liposomen-Lösung; nach 15 min mit Wasch PSB und neue DMEM / F12-Medium für die Bildgebung.
  4. Für die Transfektion Transfektion Zellen nach Lipofectamin-Protokoll (Hersteller Anleitung) mit TfR-GFP-Plasmid und Speicher 24 h im Inkubator vor Bildgebung.

3. Datenerfassung

  1. Setup Vorbereitung
    1. Um das Mikroskop Thermostat 24 Stunden vor dem Experiment Einschalten des Inkubators.
    2. Um die schnellsten erreichbaren Erfassungszeit gelten, die Arbeit in Freigestellte Sensor-Modus (siehe Einleitung) und verwenden Sie eine erste Kamera für die Bildgebung (Kamera 1) und zweiten Kamera, um die Zelle (Kamera 2) zu wählen. Ein Schema des Setup-Konfiguration ist in Abbildung S1 Ergänzende vorgestellt. Dann, um die zwei Kameras wiederum auf dem Mikroskop ausrichten und warten, bis die Kameras um sich abzukühlen.
    3. Auf beiden Kameras die Parameter für Durchlicht-Bildgebung (dh 20 ms für Belichtungszeit, 1 für EM Gain) und legte das Mikroskop im Hellfeld-Modus.
    4. Setzen Sie die Proben in der Halterung und konzentrieren sich mit Okular, senden Sie das Licht auf Kamera 1 und schieben Sie die Schlitze so dass das Licht nur auf der ROI für Cell Imaging (hier ein 32 x 32 Pixel ROI) verwendet.
    5. Bewegen Sie eine Zelle in der ausgewählten Region und senden Sie das Licht an der Kamera 2 ist, dann ziehen Sie eine ROI in der Software, Kamera 2, um eine Referenz zu haben steuern.
  2. Abbildungs ​​(3A)
    1. Zunächst richten Sie den Laser TIRF nach dem Verfahren von Ihrem Setup. In unserem Setup, wählen Sie die "TIRF-Setup" und starten Sie die automatische Ausrichtungsverfahren. Wenn der Laser ausgerichtet Satz 70 nm Eindringtiefe (ca. 70 °).
    2. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 70 ms und 100 EMGain sowohl auf Kamera 1 und Kamera 2; Dann wählen Sie eine Zelle mit Kamera 1, dann schicken Sie das Licht auf Kamera 2 und genau fokussieren die Zellmembran. Stellen Sie die minimale Exposition auf camera 2, 1000 EMGain, Bolero Sensor-Modus, 10 5 Wiederholungen und stellen Autosave als FITS-Dateien (Flexible Image Transport System, ein Format, das leicht sein können verwaltet werden).
    3. Starten Sie die Aufnahme, die Bildserien aufnehmen. Lassen Sie die Verstärkung und das zugeschnittene Mode auf Temperaturstabilisierung für den Erwerb eines neuen Zelle zu ermöglichen, dann wiederholen Sie die letzten beiden Schritte, um 8-10 Zellen zu erwerben.

4. Berechnung der mittleren quadratischen Verlagerung von Imaging (i MSD)

HINWEIS: Das folgende Protokoll kann direkt an Rohdaten angewendet werden. Zur gleichen Zeit ist die ganze Protokoll für Datenübernahmen simuliert sowohl in Matlab und in SimFCS. Der Link zu den entsprechenden Anleitungen finden Sie in der Rubrik "Materialien" gefunden werden.

  1. Berechnung von Matlab
    1. Importieren Sie die erworbenen Serie in Matlab mit ImportImageSeries Skript. Berechnen der durchschnittlichen Intensität von jedem Bild mit der Zeit zusammenmmand auf den ersten 2 Dimensionen bedeuten und benutzen Grundstück, um den resultierenden Vektor zu sehen.
    2. Wenn mehr als 10% der Photobleaching vorhanden ist, entsorgen Sie die Serie oder entfernen Sie den ersten Teil von ihnen. Wenn sie niedriger ist, versuchen, die Auswirkungen auf die Korrelationsfunktion durch Subtraktion für jedes Bild seine mittlere Intensität zu korrigieren, wie früher 37 gezeigt.
    3. Berechnen der durchschnittlichen Intensität von jedem Pixel unter Verwendung Schnitts auf die dritte Dimension und sehen sich ergebende Bild.
      HINWEIS: Besondere Aufmerksamkeit ist erforderlich, um Artefakt Korrelationen zu vermeiden. In der Tat, wie zuvor für ähnliche Techniken 38, Zellgrenzen sowie unscharf Vesikel konnte gezeigt werden, eine starke Korrelation vor. Wenn die Kontrolle des Durchschnitts Bild deckt Zellgrenzen oder unscharf Vesikel, versuchen, die Region beteiligt ansonsten verwerfen die Übernahme auszuschließen. Um die Wirkung dieser unbeweglichen Strukturen korrigieren subtrahieren den durchschnittlichen zeitlichen Intensität von jedem Pixel 39.
    4. Berechnen Sie ter räumlich-zeitliche Korrelation (G (ξ, χ, τ)) mit der Funktion CalculateSTICScorrfunc. Entfernen G (ξ, χ, 0), da die Korrelation aufgrund der Schrotrauschen bei schlechten Licht Regime dominiert G (0,0,0); die Korrelation durch den Detektor dominiert G (± 1,0,0) und Partikelbewegung während der Belichtungszeit kann G (ξ, χ, τ) für τ = 0 zu verformen, indem die gemessenen Taillen (dieser Effekt verschwindet τ > 0) 34.
    5. Durchschnittliche G (ξ, χ, τ> 0) unter Verwendung einer logarithmischen Zeit-Bin, um das Rauschen mittels der Funktion "LogBinStack" in Hintergrundmaterial zu reduzieren und dann passen die resultierende G (ξ, χ, τ) mit der Funktion "gaussfit" von die ICS-Matlab-Tools in den Materialien, die ich MSD (in der zweiten Spalte der resultierenden Array) erholen.
    6. Plotten der erhaltenen Taille σ (τ) 2 (i MSD) als Funktion der Zeit. Wenn die Daten zu laut, zu versuchen, die Anzahl der acqu erhöhenired Rahmen, erhöhen die Laserleistung, durchschnittlich mehr G (ξ, χ, τ) zusammen.
  2. Berechnung durch SimFCS
    1. Öffnen Sie die erworbenen Dateien mit ImageJ mit BioFormat Importeur Plugin und sparen erworben Serie als Tiff-Sequenz.
    2. Öffnen SimFCS und wählen RICS-Tool und wählen Sie Datei> Importieren mehrerer Bilder (Ergänzende Abbildung S2).
    3. Wählen Fit, legen Sie die richtigen Aufnahmeparameter und schließen Sie das Fenster passen (Ergänzende Abbildung S3).
    4. Wählen Sie Anzeige> durchschnittliche Intensität> CH1 und überprüfen Sie die Anwesenheit von Photobleaching (Ergänzende Abbildung S4).
    5. Wenn mehr als 10% der Photobleaching vorhanden Entsorgen Sie die Serie oder wenn es möglich ist, Last wieder die Bildfolge Entfernen des ersten Teils der Serie.
    6. Wenn Bleichen ist es weniger als 10% wählen Sie Extras> i MSD> Parameter einstellen, überprüfen 'Use gleitenden Durchschnitt', in der ROI-Panel auf der linken Seite ein gesetztumber des Rahmens für den gleitenden Durchschnitt zu achten, dass der Korrespondent Zeit höher ist als die charakteristische Diffusionszeit (für Teilchen, das sich in 1 um 2 s -1 eine Zeit von 10 s eine gute Bewegungsdurchschnitt)
    7. Wählen Sie Extras> IMSD> Berechnen i MSD (Ergänzende Abbildung S5) und Passform und exportieren Sie die i MSD aus dem Notizblock (Ergänzende Abbildung S6).

5. Berechnung des Diffusionsgesetz aus dem i MSD

  1. Setzen Sie die ersten paar Punkte, um den Achsenabschnitt (σ 0 2) extrapolieren (5 Punkte sind in der Regel genug, aber mehr Punkte eingepasst werden kann, wenn sie ein lineares Verhalten zeigen) und vergleichen Sie diesen Wert mit der zuvor gemessenen PSF 2. Wenn sie vergleichbar sind, wird die Dynamik des isolierten Fluorophore verfolgt. Im Gegensatz dazu, wenn σ 0 2 2 >> PSF versuchen schneller zu erwerben, um zu gewährleisten, dasskeine versteckten Dynamik vorhanden sind 34.
  2. Berechnen Sie den scheinbaren Diffusionskoeffizienten (D app) und die durchschnittliche Verschiebung (R) unter Verwendung der Gleichungen 3 und 4 (siehe Einleitung).
  3. Grundstück D App als Funktion der R, eine Diffusionsgesetz vergleichbar mit dem, was mit Spot-Variation auf der Basis FCS 12 (3D) gemessen zu erhalten.

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Ergebnisse

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Um die Taille Instrumental kalibrieren kann das Bild eines einzelnen fluoreszierenden Nano Wulst Maßnahme im Sinne des Protokolls Schritt 1.1 beschrieben. Ein typisches Fluoreszenzbild dieser Perlen ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Montage Intensitätsverteilung durch eine 2D-Gauß-Funktion gibt zurück gute Residuen und ermöglicht die Messung der Taillen instrumental bei 270 nm auf. Dieser Wert ist in guter Übereinstimmung mit der von der Rayleigh-Gleichung geschätzt erwarteten Beugungsgrenze. Diese Ka...

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Diskussion

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Einzelpartikelverfolgung (SPT) ist eine der häufigsten Strategien zur Molekulardynamik zu studieren, und es hat den großen Vorteil der Messung Partikelbahnen. Dies wiederum ermöglicht Sondieren das Verhalten noch wenige markierten Partikel in einem komplexen System. Um jedoch diesen Vorteil SPT muss in der Regel eine geringe Dichte der Sonde und sehr hell Etiketten zu erreichen. In diesem Fall ein komplexes Verfahren der Produktion, die Kennzeichnung und das Einsetzen in das System notwendig ist: insbesondere auf hohe z...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Diese Arbeit wird teilweise unterstützt durch NIH-P41 P41-RRO3155 und NIH P50-GM076516 (Zuschuss an EG) und Fondazione Monte dei Paschi di Siena (Zuschuss an FB).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
iXon Ultra 897AndorDU-897U-CS0
SolisAndor
CHO-K1ATCCCCL-61
ATTO 488 gelabelt PPEATTO-TEC GmbHAD 488-151
DOPEAvanti Polar Lipids, Inc.
DOTAPAvanti Polar Lipids, Inc.890890
100x Penicillin-Streptomycin-GlutaminGibco10378-016
DMEM/F-12Gibco21331
FBSGibco10082147
HEPESGibco15630-106 
PBSGibco10010-023
SimFCS 3.0Globals SoftwareDie Software kann hier heruntergeladen werden: http://www.lfd.uci.edu/globals/
DMI6000 mit TIRF-ModulLeica
LAS AFLeica
Lipofectamine 2000Lipofectamine11668019
MatlabMathWork
ImageJNIH
[header]
C-terminales GFP getaggt mit Tranferrin ReceptorOriGeneRG200980
AgarSigma AldrichA5306
ChloroformSigma Aldrich528730
Latexkügelchen, fluoreszierend gelb-grün, 30 nmSigma AldrichL5155
SONICA UltraschallreinigerSOLTECETH S3
PetrischalenWillcoGWSt-3522
Bioformat-Importer für Matlabhttp://www.openmicroscopy.org/site/support/bio-formats5/users/matlab/
ICS-MatLab Toolshttps://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip
Simulation durch Matlab Tutorialhttps://www.cellmigration.org/resource/imaging/icsmatlab/ICSTutorial.html
Simulation durch SimFCS Tutorialhttps://www.cellmigration.org/resource/imaging/ppt-pdf/RICS%20Simulations.ppt
850725

Referenzen

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  3. Ishihara, A., Hou, Y., Jacobson, K. The Thy-1 antigen exhibits rapid lateral diffusion in the plasma membrane of rodent lymphoid cells and fibroblasts. 84 (5), 1290-1293 (1987).
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  5. Jacobson, K., Derzko, Z., Wu, E. S., Hou, Y., Poste, G. Measurement of the lateral mobility of cell surface components in single, living cells by fluorescence recovery after photobleaching. J. Supramol. Struct. 5 (4), 10-1002 (1976).
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