In-vitro-Test zur Methylierung Protein-Arginin-Methylierung Studieren

Rama Kamesh Bikkavilli; Sreedevi Avasarala; Michelle Van Scoyk; Manoj Kumar Karuppusamy Rathinam; Jordi Tauler; Stanley Borowicz; Robert A. Winn

doi:10.3791/51997

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Methodenartikel

In-vitro-Test zur Methylierung Protein-Arginin-Methylierung Studieren

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DOI:

10.3791/51997

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5. Oktober 2014

Rama Kamesh Bikkavilli¹ , Sreedevi Avasarala¹ , Michelle Van Scoyk¹ , Manoj Kumar Karuppusamy Rathinam¹ , Jordi Tauler¹ , Stanley Borowicz¹^,² , Robert A. Winn¹^,³

¹Department of Pulmonary, Critical Care, Sleep, and Allergy, University of Illinois at Chicago, ²Department of Hematology and Oncology, University of Illinois at Chicago, ³Jesse Brown Veterans Affairs Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Protein-Arginin-Methylierung durch eine Klasse von Enzymen katalysiert viz., Protein-Arginin-Methyltransferasen (PRMTs), ist das Verfahren der enzymatischen Addition von Methyl-Gruppe (n) Arginine in Proteinen. Die in-vitro-Methylierungstest ist die zuverlässigste Werkzeug für die Beurteilung der Methylierungsstatus von bekannten oder neuen PRMT Substraten.

Zusammenfassung

Protein-Arginin-Methylierung ist eine der am häufigsten vorkommenden posttranslationalen Modifikationen in den Zellkern. Protein-Arginin-Methylierung können identifiziert und / oder durch proteomische Ansätze bestimmt und / oder Immunoblotting mit Methyl-Arginin-spezifischen Antikörpern. Diese Techniken können manchmal irreführend sein und oftmals falsch positive Ergebnisse. Am wichtigsten ist, können diese Techniken nicht einen direkten Beweis zur Unterstützung der PRMT Substratspezifität. In vitro Methylierung Assays auf der anderen Seite, sind nützlich biochemische Assays, die empfindlich sind und durchweg zeigen, ob die identifizierten Proteine sind in der Tat PRMT Substraten. Eine typische in vitro-Methylierungsassay enthält gereinigtes, aktives PRMTs gereinigte Substrat und einem Radioisotop markiert Methyldonors ^{(S-Adenosyl-L-[Methyl-3} H]-Methionin). Hier beschreiben wir eine Schritt-für-Schritt-Protokoll zu katalytisch aktiven PRMT1, ein ubiquitär exprimiert PRMT Familienmitglied zu isolieren. Die michthyl-Transferase-Aktivitäten der gereinigten PRMT1 wurden später auf Ras-GTPase-aktivierendes Protein-Bindungsprotein 1 (G3BP1), einem bekannten PRMT Substrat getestet, in Gegenwart von ^{S-Adenosyl-L-[Methyl-3} H] Methionin als Methyl-Donor. Dieses Protokoll kann nicht nur zur Bestimmung des Methylierungsstatus von neuen physiologischen PRMT1 Substrate, sondern auch für das Verständnis des grundlegenden Mechanismus der Protein-Arginin-Methylierung eingesetzt werden.

Einleitung

Protein-Methylierung wurde erstmals im Jahre 1968 beschrieben ^1. Es war nicht bis zum ersten Klonen von PRMT1 im Jahr 1996, dass die Forscher begannen, die Bedeutung dieser post-translationale Modifikation ² zu schätzen wissen. Interessanterweise etwa 2% der Argininreste in den Proteinen des Zellkernextrakten methyliert ^3, was die Häufigkeit dieser Modifikation. Arginin ist eine positiv geladene Aminosäure mit basischer Seitenkette und der Stickstoff / s in den Seitenketten von Arginin kann posttranslational durch die Zugabe einer Methylgruppe, einem Verfahren, wie Arginin Methylierung ^4-6 bekannt sind, modifiziert. Arginin....