Die Soft-Agar Koloniebildungstest

Zusammenfassung

Der Assay zur Bildung von Weichagar-Kolonien ist eine Methode, die verwendet wird, um zelluläres Verankerungsunabhängiges Wachstum in vitro zu bestätigen. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine stringente Methode zum Nachweis des tumorigenen Potenzials transformierter Zellen und der tumorsuppressiven Wirkung von Proteinen auf transformierte Zellen zu veranschaulichen.

Zusammenfassung

Verankerungsunabhängiges Wachstum ist die Fähigkeit transformierter Zellen, unabhängig von einer festen Oberfläche zu wachsen, und ist ein Kennzeichen der Krebsentstehung. Der Assay zur Bildung von Weichagar-Kolonien ist eine etablierte Methode zur Charakterisierung dieser Fähigkeit in vitro und gilt als einer der strengsten Tests für die maligne Transformation in Zellen. Dieser Assay ermöglicht auch eine semiquantitative Bewertung dieser Fähigkeit als Reaktion auf verschiedene Behandlungsbedingungen. In dieser Arbeit werden wir den Assay zur Bildung von Weichagar-Kolonien anhand einer murinen Lungenkarzinom-Zelllinie, CMT167, demonstrieren, um die tumorsuppressive Wirkung von zwei Mitgliedern des Wnt-Signalwegs, Wnt7A und Frizzled-9 (Fzd-9), zu demonstrieren. Die gleichzeitige Überexpression von Wnt7a und Fzd-9 führte zu einer Hemmung der Koloniebildung in CMT167-Zellen. Dies zeigt, dass die Expression des Wnt7a-Liganden und seines Frizzled-9-Rezeptors ausreicht, um das Tumorwachstum in einem murinen Lungenkarzinommodell zu unterdrücken.

Einleitung

Die Koloniebildung in Weichagar-Assay ist eine Technik häufig verwendet, um Zelltransformation in vitro zu bewerten. Historisch weiterer Assay, der klonogenen Assay von Puck et al. 1956 wurde verwendet, um die Fähigkeit der Zellen, um Kolonien zu bilden, ¹ auszuwerten. In dieser Technik wurden die Zellen auf eine Kulturplatte verteilt und in Gegenwart von "Feeder" Zellen oder konditioniertes Medium die notwendigen Wachstumsfaktoren bereitzustellen gewachsen. Die Einschränkung dieser Technik war, dass es nur zur Verfügung gestellten Informationen über die Koloniebildung. Normale Zellen werden von verankerungsunabhängiges Wachstum gehindert, aufgrund einer bestimmten Art von apoptotischen Tod rief anoikis ^2. Jedoch haben transformierten Zellen die Fähigkeit zu wachsen und sich zu teilen, ohne die Bindung an ein Substrat. Um auf diesem Konzept profitieren, entwickelten Forscher die Soft-Agar Koloniebildungstest. Die Koloniebildung in Weichagar-Assay seit modifiziert wurden, in den letzten Jahren zu sp adressierenecific Bedürfnisse. Eine Variante beinhaltet Einbau von fluorimetrischen Farbstoff für Hochdurchsatz-Koloniezählung zu ermöglichen. Eine weitere Variation ist die Verwendung von spezialisierten Agar-Lösung, um abgerufen zu der lebensfähigen Zellen nach der Koloniebildung zu ermöglichen, wenn Protein oder DNA-Proben notwendig.

Im herkömmlichen Koloniebildung in Weichagar-Assay werden die Zellen in einer Schicht von weichem Agar mit Zellkulturmedium, das auf einer anderen Schicht aus weichem Agar, auch mit Zellkulturmedium gemischt aufliegt gemischt angebaut, aber mit einer höheren Konzentration von Agar. Dies verhindert, dass Zellen aus dem Kulturplatte haften, noch erlaubt transformierten Zellen zu sichtbaren Kolonien zu bilden. Das Grundprinzip hinter dieser Technik ist, dass normale Zellen abhängen Zelle an extrazelluläre Matrixkontakt in der Lage, zu wachsen und zu verteilen. Umgekehrt transformierten Zellen die Fähigkeit haben, zu wachsen und sich zu teilen, unabhängig von ihrer Umgebung. Daher Zellen in der Lage, Kolonien in einer Verankerung unabhängig bilden waren considered transformiert und krebserregend. Das Gesamtziel dieses Verfahrens ist es, diese Funktion in Zellen in einem semi-quantitative und strenge Weise zu messen.

Der Wnt-Signalweg ist entscheidend in der Embryogenese und in der Tumorgenese ^3-6 häufig dereguliert. Es gibt verschiedene Wege mit Wnt-Signalweg verbunden. Die kanonische Weg beinhaltet Wnt-Signalisierung und die Regulierung der Transkription stromabwärts über ihre Auswirkungen auf die transkriptionale Koaktivator beta-catenin. Wnts Signal auch durch einige nicht-kanonische Wege, beispielsweise die planare Zellpolarität Weg, die Elemente in Zytoskelettstruktur ⁷ beteiligt regelt, und der Wnt-Signalweg Calcium, die Freisetzung von Calcium aus dem endoplasmatischen Retikulum ⁸ regelt. Wnt-Liganden üben ihre Wirkung durch Bindung Frizzled-Rezeptoren. Obwohl mehrere Wnts wurde gezeigt, dass bei Lungenkrebs hochreguliert werden, hat sich gezeigt, Wnt7a in nicht-Smal herunterreguliert werden,l kleinzelligem Lungenkrebs durch Promotormethylierung ^9. Wnt7a bindet FZD9 und wirkt als Tumorsuppressor durch eine nicht-kanonische Weg. Wiederherstellung der Wnt-7a und Frizzled-9 hemmt das Wachstum von nicht-kleinzelligen Lungenkrebszellen ^10. Die Wirkungen von Wnt7a / FZD9 werden durch die Aktivierung von ERK-5, die wiederum aktiviert Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptor γ (PPAR) ^11,12 vermittelt. Hier zeigen wir, dass die Überexpression von Wnt7a und FZD9 resultiert in der Unterdrückung des verankerungsunabhängigen Wachstums von einem murinen Lungenkarzinom-Zelllinie. Murine CMT167 Zellen wurden aus einem Lungenkarzinom in C57BL / lcrf Mäusen ¹³ abgeleitet und wurden stabil mit Wnt7a und FZD9 transfiziert. Eine Überexpression von Wnt7a und FZD9 wurden durch quantitative-PCR (Q-PCR) und der Funktionalität Wnt7a und FZD9 Expression bestätigt wurde durch nachgeschaltete Aktivierung von PPAR & ggr bestätigt.

Protokoll

1. Herstellung von Materialien und Reagenzien

1. Beschriften Sie jede Vertiefung einer Gewebekultur behandelt 6-Well-Platte passend für jede Zelllinie oder der Zustand untersucht.
2. Vorbereitung 2x Zellkulturmedium durch Auflösen von 1 g Pulver Medium und 0,2 g Natriumbicarbonat in entionisiertem Wasser auf ein Endvolumen von 50 ml.
3. Geben dieses Medium durch ein 0,2-um-Filter sterilisiert.
4. Hinzufügen zusätzlicher Komponenten für normale Kultur der Zelllinie von Interesse erforderlich ist. Zum Beispiel wachsen CMT 167 Zelllinie in RPMI 1640-Medium mit 10% FBS und 1% Penicillin / Streptomycin-Lösung ergänzt. Warme Medium auf 37 ° C in heißes Wasserbad vor der Verwendung.
5. Bereiten 1x Zellkulturmedium getrennt, wie Sie es für die normale Zellkultur der Zelllinie von Interesse.
6. Bereiten Sie 1% Edel Agar durch Zugabe von 1 g edlen Agar auf 100 ml VE-Wasser.
   HINWEIS: Edel-Agar nicht vollständig unter Rühren alleine lösen.
7. Vorbereiten0,6% edle Agar durch Zugabe von 0,6 g Edel Agar in 100 ml entionisiertem Wasser. Beide Lösungen können Agar in 100 ml Glasflaschen mit verschließbarem Deckel für Langzeitlagerung erfolgen.
8. Autoklaven wird das edle Agar Mischungen zu sterilisieren. Diese Gemische können im Voraus hergestellt werden und bei 4 ° C gelagert, sondern sollte zum Zeitpunkt des Experiments wieder erhitzt, bis Agar vollständig gelöst werden.
9. Vorbereitung Nitroblautetrazoliumchlorid Lösung durch Herstellung einer 1 mg / ml Stammlösung in 1x PBS (8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na ₂ HPO ₄ und 0,24 g KH ₂ PO ₄ in H ₂ O auf ein Endvolumen von 1000 ml ). Dies wird am Ende des Experiments werden die Kolonien zu färben.

2. Überzug der Bodenschicht aus Agar

1. Lösen Sie die Schutzkappe auf der Flasche von 1% Edel Agar und Mikrowelle für ca. 1-2 min. Unter Erhitzen in einer Mikrowelle, überwachen die Lösung eng zu vermeiden Überkochen. Weiter Heizung, beim Mischen mit Unterbrechungen,bis Agar vollständig gelöst und die Lösung klar ist.
   HINWEIS: Verwenden Sie hitzebeständige Handschuhe, um Kolben nach dem Erhitzen zu behandeln. Geschieht dies nicht, kann Verbrennungen oder schweren Verletzungen führen.
2. Zeigen geschmolzen Agarlösung und vorgewärmten 2x Kulturmedium in einem Eiskübel mit heißem Leitungswasser (42 ° C) gefüllt. Legen auch eine 50 ml konischen Röhrchen in einem Rohrhalter im Eiskübel mit heißem Wasser. Übertragen Sie Eimer, um die Zellkultur Kapuze für nachfolgende Schritte.
3. Für die untere Schicht aus Agar, benötigen Sie 1,5 ml einer Mischung aus Agar und Medium pro Vertiefung einer 6-Well-Platte.
4. Um eine ausreichende Menge der Mischung zu gewährleisten, bereiten insgesamt 12 ml pro 6-Well-Platte.
5. Gestartet durch Zugabe von 6 ml Kulturmedium, zu dem 50 ml konischen Röhrchen und dann 6 ml der 1% Edel Agarlösung.
6. Kehren Sie die konischen Rohr mehrmals, um zu mischen. Arbeiten bei flottem Tempo wird ein vorzeitiges Aushärten des Soft-Agar zu verhindern.
7. Auszuarbeiten etwa 5,5 ml Mischung in eine 5 ml serologische piPette.
8. Lassen Sie die Luftblasen nach oben von Pipettensäule vor Hinterlegung 1,5 ml dieser Mischung in jedes Well steigen. Seien Sie vorsichtig, um die Ablagerung von Luftblasen in die Plattenvertiefungen zu vermeiden.
9. Die Platten abdecken und lassen Agar Gemisch bei Raumtemperatur verfestigt, in Zellkulturhaube, für 30 min.

3. Überzug der oberen Schicht der Agar enthaltenden Zellen

1. Nachdem die untere Schicht aus Agar sich verfestigt hat, beginnen Herstellung der oberen Schicht.
2. Zuerst Ernte die Zellen durch Trypsinierung und verdünnte sie 1: 5 in Kulturmedium (zB 1 ml Trypsin, 4 ml Medium) in eine 15 ml konischen Röhrchen.
3. Zählen von Zellen und die Berechnung der Anzahl der benötigten Zellen pro Vertiefung, um eine Zellsuspension zu dieser Zeit vorzubereiten. Diese Zahl wird je nach Zelltyp variieren. Verwenden 5.000 Zellen / Well als Ausgangspunkt und nach Bedarf anpassen. Aus diesem Zellzahl, können Sie eine Zellsuspension von 6667 Zellen / ml vorbereiten würde (dh jeden well werden 0,75 ml dieser Suspension und 0,75 ml des Agar mit einem Gesamtvolumen von 1,5 ml zu erhalten; 2 für eine endgültige Gesamtzellzahl von 5000): die Konzentration der Zellen wird auch 1 verdünnt werden.
4. Das Volumen, die pro Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen Zellsuspension wird erneut 1,5 ml betragen. Bereiten Sie zusätzliche Zellsuspension in Höhe von 12 ml pro 6-Well-Platte.
5. Schmelz 0,6% Agar-Lösung in einer Mikrowelle, wie oben und setzen in Eis Eimer mit heißem Wasser zusammen mit einem 50 ml konischen Röhrchen in einem Rohrhalter und der Zellsuspension aus Schritt 3.3.
6. Übertragen Sie die Eiskübel mit geschmolzenem 0,6% Agar, um die Zellkultur Kapuze für nachfolgende Schritte.
7. Mischungs 0,6% Agar und Zellsuspension in einem Verhältnis 1: 1, Herstellung eines Gesamtvolumens von 12 ml pro Platte mit 6 Vertiefungen. 1,5 ml pro Vertiefung wird erforderlich sein, aber Extra sollte wie oben durchgeführt werden.
8. Pipette 6 ml der Zellsuspension in 50 ml konischen Röhrchen.
9. Dann 6 ml 0,6% Agar in das Röhrchen.
   HINWEIS: Die Temperatur dieser Mischung mussgehalten etwa 42 ° C, um ein vorzeitiges Härten zu vermeiden und das Überleben der Zelle zu maximieren.
10. Schnell arbeiten, Pipetten diese Mischung 2-3x um Zellen zu verteilen, dann erarbeiten 5,5 ml Mischung in eine 5 ml serologische Pipette.
11. Lassen Sie eventuell vorhandene Luftblasen, um zum Anfang der Pipettensäule vor Hinterlegung 1,5 ml dieser Mischung in jedes Well steigen. Seien Sie vorsichtig, um die Ablagerung von Luftblasen in die Plattenvertiefungen zu vermeiden.
12. Erlauben Zelle / Agar Gemisch bei Raumtemperatur, bevor sie in eine 37 ° C befeuchteten Zellkulturbrutschrank zu verfestigen, in Zellkulturhaube, für 30 min.
13. Die angemessene Koloniebildung erforderliche Zeit variiert für jede Zelllinie, typischerweise etwa 21 Tage.
14. Eine Schicht aus Wachstumsmedium sollte über die obere Agar-Schicht, um ein Austrocknen zu verhindern, aufrechterhalten werden. 100 ul Medium zweimal wöchentlich hinzugefügt ist für diesen Zweck ausreichend.

4. Die Färbung der Platten und das Zählen der Kolonien

1. Flecken Zellen durch Zugabe von 200 _6; l Nitroblau-Tetrazolium-Chlorid-Lösung pro Well über Nacht bei 37 ° C inkubiert Platten.
2. Sobald Kolonien gefärbt sind, fotografieren von Brunnen mit einem Imager und zählen Kolonien mit Bildanalyse-Software.

Ergebnisse

Der Ausdruck Wnt7a und FZD9 in CMT167 Zellen wirksam ist Tumorsuppression wie unsere Koloniebildung in Weichagar-Assay veranschaulicht. Vorbereitend, Q-PCR verwendeten wir zu zeigen, dass Wnt7a und FZD9 mRNA sind in geringen Mengen in CMT167 Zellen exprimiert. CMT167 Zellen zeigten geringe endogene Wnt7a und FZD9 Vergleich zu MLE-12-Zellen, eine SV40-transformierte murine Lungen-Epithel-Zelllinie (1). Dann transfiziert CMT167 Zellen mit zwei retroviralen Vektoren, die Überexpression menschlichen Konstru...

Diskussion

In vitro Bestätigung tumorsuppressive Funktion von Signalproteinen, ist schwierig. Eine der härtesten Tests zur Verfügung, um diese Eigenschaft zu untersuchen ist die Soft-Agar Koloniebildungstest. Hier haben wir die Koloniebildung in Weichagar-Assay unter Verwendung eines Maus-Lungenkarzinom-Zelllinie stabil überexprimieren Wnt7a und FZD9 Vergleich zu seinem Eltern CMT167 Zelllinie dargestellt.

Es gibt mehrere wichtige Punkte zu berücksichtigen hinsichtlich der Soft-Agar-Assays. De...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Cancer Cell Line of Interest	Sigma-Aldrich	10032302	CMT-167 Zellen
Pulverisiertes RPMI 1640 Medium	Gibco	31800-089	Wird zur Herstellung von 2x Zellkulturmedium verwendet.
Flüssiges RPMI 1650 Medium	Cellgro	10-040-CV	Wird als 1x Zellkulturmedium bezeichnet.
Fötales Rinderserum	HyClone	SH30910.03	Wird zur Ergänzung des Zellkulturmediums verwendet.
Penicillin/Streptomycin	CellGro	30-002-Cl	Zur Verwendung in Zellkulturmedium.
Difco Noble Agar	BD Biosciences	214230	Wird zur Herstellung von 1,0% und 0,6% Agar verwendet.
Natriumbicarbonat	Fisher	BP-328-1	Wird in 2x Zellkulturmedium verwendet.
Trypsin	Cellgro	25-050-Cl
Sterilfilter mit Flaschenaufsatz	Fisher	09-761-126	Zum Sterilfiltrieren von 2x Medium.
Lipofectamine Reagenz	Invitrogen	18324-020	Wird im PPAR-RE Luciferase-Assay verwendet.
6-Well-Platten mit Gewebekultur behandelt
37 ° C/5% CO2 Inkubator
Chemi-Doc Imager	Bio-Rad		Wird zum Fotografieren von Bienenvölkern verwendet.
Quantity One Software	Bio-Rad		Wird zur Zählung von Zellkolonien verwendet.
15 ml konische Röhrchen
50 ml konische Röhrchen
250 ml Erlenmeyerkolben
Mikrowelle
5 ml serologische Pipetten
Pipettenhilfe
Mikropipette
Hämazytometer mit Deckel Slip
Pipettenspitzen
Inverses Lichtmikroskop
Zentrifuge
Hitzebeständige Handschuhe
Saran Wrap
Eiskübel