Der Assay zur Bildung von Weichagar-Kolonien ist eine Methode, die verwendet wird, um zelluläres Verankerungsunabhängiges Wachstum in vitro zu bestätigen. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine stringente Methode zum Nachweis des tumorigenen Potenzials transformierter Zellen und der tumorsuppressiven Wirkung von Proteinen auf transformierte Zellen zu veranschaulichen.
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Verankerungsunabhängiges Wachstum ist die Fähigkeit transformierter Zellen, unabhängig von einer festen Oberfläche zu wachsen, und ist ein Kennzeichen der Krebsentstehung. Der Assay zur Bildung von Weichagar-Kolonien ist eine etablierte Methode zur Charakterisierung dieser Fähigkeit in vitro und gilt als einer der strengsten Tests für die maligne Transformation in Zellen. Dieser Assay ermöglicht auch eine semiquantitative Bewertung dieser Fähigkeit als Reaktion auf verschiedene Behandlungsbedingungen. In dieser Arbeit werden wir den Assay zur Bildung von Weichagar-Kolonien anhand einer murinen Lungenkarzinom-Zelllinie, CMT167, demonstrieren, um die tumorsuppressive Wirkung von zwei Mitgliedern des Wnt-Signalwegs, Wnt7A und Frizzled-9 (Fzd-9), zu demonstrieren. Die gleichzeitige Überexpression von Wnt7a und Fzd-9 führte zu einer Hemmung der Koloniebildung in CMT167-Zellen. Dies zeigt, dass die Expression des Wnt7a-Liganden und seines Frizzled-9-Rezeptors ausreicht, um das Tumorwachstum in einem murinen Lungenkarzinommodell zu unterdrücken.
Einleitung
Die Koloniebildung in Weichagar-Assay ist eine Technik häufig verwendet, um Zelltransformation in vitro zu bewerten. Historisch weiterer Assay, der klonogenen Assay von Puck et al. 1956 wurde verwendet, um die Fähigkeit der Zellen, um Kolonien zu bilden, 1 auszuwerten. In dieser Technik wurden die Zellen auf eine Kulturplatte verteilt und in Gegenwart von "Feeder" Zellen oder konditioniertes Medium die notwendigen Wachstumsfaktoren bereitzustellen gewachsen. Die Einschränkung dieser Technik war, dass es nur zur Verfügung gestellten Informationen über die Koloniebildung. Normale Zellen werden von verankerungsunabhängiges Wachstum gehindert....
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Protokoll
1. Herstellung von Materialien und Reagenzien
- Beschriften Sie jede Vertiefung einer Gewebekultur behandelt 6-Well-Platte passend für jede Zelllinie oder der Zustand untersucht.
- Vorbereitung 2x Zellkulturmedium durch Auflösen von 1 g Pulver Medium und 0,2 g Natriumbicarbonat in entionisiertem Wasser auf ein Endvolumen von 50 ml.
- Geben dieses Medium durch ein 0,2-um-Filter sterilisiert.
- Hinzufügen zusätzlicher Komponenten für normale Kultur der Zelllinie von Interesse erforderlich ist. Zum Beispiel wachsen CMT 167 Zelllinie in RPMI 1640-Medium mit 10% FBS und 1% Penicillin / Streptomycin-Lösung ergänzt. Warme Medium auf 37 ° C i....
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Ergebnisse
Der Ausdruck Wnt7a und FZD9 in CMT167 Zellen wirksam ist Tumorsuppression wie unsere Koloniebildung in Weichagar-Assay veranschaulicht. Vorbereitend, Q-PCR verwendeten wir zu zeigen, dass Wnt7a und FZD9 mRNA sind in geringen Mengen in CMT167 Zellen exprimiert. CMT167 Zellen zeigten geringe endogene Wnt7a und FZD9 Vergleich zu MLE-12-Zellen, eine SV40-transformierte murine Lungen-Epithel-Zelllinie (1). Dann transfiziert CMT167 Zellen mit zwei retroviralen Vektoren, die Überexpression menschlichen Konstru.......
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Diskussion
In vitro Bestätigung tumorsuppressive Funktion von Signalproteinen, ist schwierig. Eine der härtesten Tests zur Verfügung, um diese Eigenschaft zu untersuchen ist die Soft-Agar Koloniebildungstest. Hier haben wir die Koloniebildung in Weichagar-Assay unter Verwendung eines Maus-Lungenkarzinom-Zelllinie stabil überexprimieren Wnt7a und FZD9 Vergleich zu seinem Eltern CMT167 Zelllinie dargestellt.
Es gibt mehrere wichtige Punkte zu berücksichtigen hinsichtlich der Soft-Agar-Assays. De.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Studie wurde durch einen Merit Award des U.S. Department of Veterans Affairs und einen NIH-Zuschuss unterstützt, der an RW R01CA1385282522717 wurde.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Cancer Cell Line of Interest | Sigma-Aldrich | 10032302 | CMT-167 Zellen |
| Pulverisiertes RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-089 | Wird zur Herstellung von 2x Zellkulturmedium verwendet. |
| Flüssiges RPMI 1650 Medium | Cellgro | 10-040-CV | Wird als 1x Zellkulturmedium bezeichnet. |
| Fötales Rinderserum | HyClone | SH30910.03 | Wird zur Ergänzung des Zellkulturmediums verwendet. |
| Penicillin/Streptomycin | CellGro | 30-002-Cl | Zur Verwendung in Zellkulturmedium. |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | 214230 | Wird zur Herstellung von 1,0% und 0,6% Agar verwendet. |
| Natriumbicarbonat | Fisher | BP-328-1 | Wird in 2x Zellkulturmedium verwendet. |
| Trypsin | Cellgro | 25-050-Cl | |
| Sterilfilter mit Flaschenaufsatz | Fisher | 09-761-126 | Zum Sterilfiltrieren von 2x Medium. |
| Lipofectamine Reagenz | Invitrogen | 18324-020 | Wird im PPAR-RE Luciferase-Assay verwendet. |
| 6-Well-Platten mit Gewebekultur behandelt | |||
| 37 ° C/5% CO2 Inkubator | |||
| Chemi-Doc Imager | Bio-Rad | Wird zum Fotografieren von Bienenvölkern verwendet. | |
| Quantity One Software | Bio-Rad | Wird zur Zählung von Zellkolonien verwendet. | |
| 15 ml konische Röhrchen | |||
| 50 ml konische Röhrchen | |||
| 250 ml Erlenmeyerkolben | |||
| Mikrowelle | |||
| 5 ml serologische Pipetten | |||
| Pipettenhilfe | |||
| Mikropipette | |||
| Hämazytometer mit Deckel Slip | |||
| Pipettenspitzen | |||
| Inverses Lichtmikroskop | |||
| Zentrifuge | |||
| Hitzebeständige Handschuhe | |||
| Saran Wrap | |||
| Eiskübel |
Referenzen
- Puck, T. T., Marcus, P. I., Cieciura, S. J. Clonal growth of mammalian cells in vitro; growth characteristics of colonies from single HeLa cells with and without a feeder layer. J Exp Med. 103, 273-283 (1956).
- Taddei, M. L., Giannoni, E., Fiaschi, T., Chiarugi, P.
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Nachdrucke und Genehmigungen
