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Methodenartikel

Die Implantation von Fibrin Gel auf Maus Lung Lung spezifischen Angiogenese Studieren

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DOI:

10.3791/52012

⸱

21. Dezember 2014

 , 
1Vascular Biology Program, Department of Surgery, Boston Children's Hospital and Harvard Medical School

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Rekapitulation der organspezifischen Mikroumgebung, die die lokale Angiogenese stimuliert, ist für eine erfolgreiche Regeneration von geschädigtem Gewebe unerlässlich. Dieser Bericht demonstriert eine neuartige Methode zur Implantation von Fibringelen auf die Lungenoberfläche lebender Mäuse, um zu untersuchen, wie die lungenspezifische Mikroumgebung die Angiogenese und Alveolärregeneration bei erwachsenen Mäusen moduliert.

Zusammenfassung

Neue bedeutende Fortschritte in der Stammzellforschung und der Biotechnologie Techniken haben große Fortschritte bei der Nutzung von Biomaterialien zur Regeneration und Reparatur von Schäden in einfachen Gewebe in den orthopädischen und Zahn Feldern. Versuche, die Strukturen und Funktionen von komplexeren dreidimensionalen (3D) Organen wie Lunge regenerieren waren nicht sehr erfolgreich, da die biologischen Prozesse der Organregeneration wurden nicht gut erforscht. Es wird deutlich, dass die Angiogenese, die Bildung neuer Blutgefäße, spielt eine Schlüsselrolle bei Organregeneration. Die neu gebildeten Gefäßsystemen liefern nicht nur Sauerstoff, Nährstoffen und verschiedenen Zellbestandteile, die für die Organregeneration erforderlich sind, aber auch lehr Signale an die Regeneration von lokalen Geweben. Deshalb, um erfolgreich zu regenerieren Lungen bei einem Erwachsenen, ist es notwendig, die lungenspezifische Mikroumgebungen, bei denen Angiogenese Antriebe Regeneration lokalen Lungengewebe zu rekapitulieren. Obwohl Conventional in vivo Angiogenese-Assays, wie subkutane Implantation von extrazellulärer Matrix (ECM) -reiche Hydrogele (zB Fibrin oder Kollagengelen oder Matrigel - ECM Proteingemisch durch Engelbreth-Holm-Swarm-Maus-Sarkom-Zellen sezerniert), werden in großem Umfang genutzt, um das zu erforschen allgemeine Mechanismen der Angiogenese, lungenspezifischen Angiogenese ist nicht gut charakterisiert, weil Verfahren zur orthotope Implantation von Biomaterialien in der Lunge wurden nicht gut etabliert. Das Ziel des Protokolls ist es, eine einzigartige Methode einzuführen, um Fibrin-Gel auf der Lungenoberfläche von lebenden erwachsenen Maus implantiert werden, der eine erfolgreiche Wiederholung der Host Lunge abgeleitete Angiogenese innerhalb des Gels. Dieser Ansatz ermöglicht es Forschern, die Mechanismen, mit denen die lungenspezifischen Mikroumgebung steuert Angiogenese und alveoläre Regeneration in normalen und pathologischen Bedingungen zu erforschen. Seit implantierte Biomaterialien Release und liefern physikalischen und chemischen Signale zu benachbarten lung Gewebe kann Implantation dieser Biomaterialien auf kranken Lunge möglicherweise normalisieren die angrenzenden krankem Gewebe, so dass die Forscher neue Therapieansätze für verschiedene Arten von Lungenerkrankungen zu entwickeln.

Einleitung

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, ein Verfahren einzuführen, um Fibrin-Gel auf der Lungenoberfläche der erwachsenen Maus, die Forscher die molekularen Mechanismen der Lungenkreislauf und alveoläre Entwicklung charakterisieren können implantieren, und dieses Wissen, um biomimetische Materialien zu entwickeln in der Lage zu nutzen von rekapituliert physiologische Lungengefäß und alveoläre Bildung auf verschiedene Lungenkrankheiten zu behandeln.

Mehr als 35 Millionen Amerikaner leiden an chronischen Lungenerkrankungen wie chronisch obstruktive Lungenerkrankung und Lungenfibrose. Diese Patienten haben lang anhaltende chronische respiratorische Symptome wie Kurzatmigkeit, Brustenge, quälende Husten und Müdigkeit, die ihr tägliches Leben 1-3 erheblich beeinträchtigen. Trotz einer großen Aufwand zu wirksamen Therapien für diese Lungenerkrankungen zu entwickeln, derzeit gibt es keine Heilung; deshalb ist die Lebensqualität für diese Patienten schlecht und wirtschaftlichen und menschlichen Kosten sind hallogh 4-7. Derzeit ist eine Lungentransplantation die einzige Möglichkeit, Patienten im Endstadium einer chronischen Lungenerkrankungen zu speichern. Aufgrund der Knappheit von Transplantatspender, hohe Kosten, schweren Komplikationen und geringe Überlebensrate 8-11 Jedoch ist die Transplantation keine optimale Ansatz. Neue schnelle Fortschritte im Tissue Engineering Techniken konnten die Forscher implantierbaren Lungen von Bestandsauffüllung dezellularisierte ganze Lunge mit verschiedenen Arten von Vorläuferzellen oder induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) 12,13 bioengineer. Allerdings sind diese biotechnologisch Lunge nur für einige Stunden nach der Implantation 12,14,15 Funktions in Wirtstiere. Verwendung von Biomaterialien, die komplexen Strukturen und Funktionen der Lunge zu regenerieren ist ebenfalls recht erfolgreich. Dies kann, weil die wichtigsten biologischen Prozesse, die erwachsenen Lungenregeneration regeln wurden nicht gut erforscht. In der Lunge ist die Bildung des vaskulären Systems eines der frühesten und bedeutendsten Ereignisse during Entwicklung und Regeneration 16-21. Neu in der Lunge liefern nicht nur Sauerstoff, Nährstoffen und verschiedenen Zellkomponenten für Organbildung erforderlich ist, sondern auch lehrreich Regulationssignale zur umgebenden Zellen 22-25 gebildeten Gefäßsystemen. So spielt die Angiogenese eine Schlüsselrolle bei der regenerativen Alveolarisierung bei erwachsenen Lungen 24,26,27. Zusätzlich trägt deregulierten Angiogenese zu chronischen Lungenerkrankungen, wie chronische obstruktive Lungenerkrankung (COPD) 28, bronchopulmonale Dysplasie (BPD), 21-23, und Lungenfibrose 29. Um somit effizienter Strategien für das Engineering Lungen oder der Behandlung von chronischen Lungenerkrankungen zu entwickeln, ist es notwendig, die grundlegenden Mechanismen der lungenspezifischen Angiogenese zu verstehen.

Jedes Organ zeigt außergewöhnliche mechanische und chemische Eigenschaften, die zwischen physiologischen und pathologischen Bedingungen 30-33 unterscheiden. Diese organspezifische microenvirongen regeln Endothelzellen Verhaltensweisen und orchestrieren Gefäßnetzwerkbildung in einer organspezifisch 24,34-36. Um somit effizienter Strategien für Lungenregeneration zu entwickeln, wobei der Mechanismus lungenspezifischen Angiogenese Basiswert muss verstanden werden. Während herkömmliche In-vivo-Angiogenese-Assays, wie subkutane Implantation Hydrogel wurden ausgiebig für Angiogeneseforschung 37-39 verwendet wurde, müssen diese Methoden nicht rekapitulieren organspezifischen Angiogenese. Kürzlich wurde ein neues Verfahren auf Matrigel in einer elastischen Form auf der Mauslunge implantieren ist entwickelt worden und dargestellt, die Blutgefäße und Lungenepithelzellen erfolgreich rekrutieren in die Gele 22. Dieser einzigartige Ansatz wird es den Forschern ermöglichen, den Mechanismus der lungenspezifischen Angiogenese sowie Wechselwirkungen zwischen Blutgefäßen und nicht-vaskulären Lungenzellen in physiologischen und pathologischen Bedingungen zu erforschen. Seit 1) Matrigel ist nicht geeignet für die klinische Anwendung; 2) die Elastic Form, um das Gel kann Wechselwirkungen zwischen Hydrogelen und Wirtslungengewebe und 3) die elastische Form an der Lunge möglicherweise verursacht eine Beeinträchtigung der Lungenfunktion und Schmerzen während der Atmung beeinflussen geworfen, als mehr klinisch relevanten Ansatz verwendet, ein 3D-Fibrin-Matrix, die angiogenen Faktoren (vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF) / basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF)) wurde auf der Mauslunge ohne Casting in der elastischen Form implantiert worden und hat Gast Lunge abgeleitete Angiogenese erfolgreich rekapituliert. Fibrin-Gel, Polymerfibrillen aus Thrombin gespaltenen Fibrinogen erzeugt wird, wird zum Einfangen einer Vielzahl von angiogenen Faktoren wie bFGF und VEGF die Angiogenese in vivo 40,41 beschleunigen bekannt. Wegen ihrer Regenerationsfähigkeit und biologisch abbaubare Natur 42 wird Fibringel verbreitet auf dem Gebiet des Tissue Engineering eingesetzt.

Dieser Artikel stellt einen neuen und einzigartigen Ansatz zur Fibringel auf der Lungenoberfläche lebender adul implantierent-Maus und zeigt, dass die Host-Lungen-abgeleitete Angiogenese in den Gelen in vivo rekapituliert. Diese Methode, die Forscher ermöglicht, lungenspezifischen Angiogenese zu untersuchen, wird wahrscheinlich zur Entwicklung neuer Therapieansätze für verschiedene Arten von Lungenerkrankungen führen und die Bemühungen um adulten Lunge erfolgreich regenerieren erheblich voranbringen.

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Protokoll

HINWEIS: Die in-vivo-Tierstudie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen in der Bedienungsanleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Das Protokoll wurde überprüft und von der Animal Care und Verwenden Committee von Boston Kinderkrankenhaus (Protokoll-Nummern: 13-10-2526R, 14-02-2568R) zugelassen. Alle Arzneistoffe in diesem Protokoll verwendet werden pharmazeutischer Qualität und diese Medikamente werden unter sterilen Bedingungen hergestellt.

1. Fibrin Gel Vorbereitung

  1. Bereiten Fibringel dass VEGF und bFGF enthält.
    1. Tau-Stammlösungen von Fibrinogen und Thrombin, die bei -80 ° C bis Raumtemperatur (25 ° C) gelagert werden.
    2. Hinzufügen Thrombin (Endkonzentration: 2,5 U / ml), CaCl 2 (Endkonzentration: 45 mM), VEGF (Endkonzentration: 0-100 ng / ml) und bFGF (Endkonzentration: 0-100 ng / ml) zu der Fibrinogen -Lösung (Endkonzentration: 12,5 mg / ml in 0,9% sodium Chloridlösung 43-45) in einem 1,5-ml-Röhrchen.
    3. Vorsichtig mischen.
    4. Gently Pipette 200 ul der Mischung auf einer sterilen Kunststoffschale in einer tropfenweise Mode mit p200 Pipettenspitze.
    5. Die Tropfen bei 37 ° C für 30-60 min, bis sie sich verfestigen.
      ANMERKUNG: Das erstarrte Gel kann in dem verschlossenen Kunststoffschale bei Raumtemperatur (25 ° C) für mehrere Stunden vor der Implantation (1a) gehalten werden kann.
  2. Schneiden Sie die Fibrin-Gel in ca. 3 x 3 x 3 mm Würfel mit kleinen chirurgische Scheren vor der Implantation.

2. Maus Vorbereitung

  1. Anesthetize adulten Maus (8-12 Wochen) durch intraperitoneale (IP) Injektion von Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg) und bestätigen, dass die Maus ausreichend durch Einklemmen Zehe des Maus anästhesiert.
    1. Verwenden Tierarzt Salbe auf Augen der Maus bis zur Trockenheit während des Experiments zu verhindern.
  2. Shave fur auf der linken Seite des Brustkorbs der Maus.
  3. Führen Intubation der Maus.
  4. Platzieren Sie die Maus auf der Intubation stehen bei 70 ° abgewinkelt und halten Maus anstelle durch Einhaken seine oberen Schneidezähne in einem kleinen Gummiband an der Spitze des Stativs befindet.
  5. Die Zunge vorsichtig zurückziehen, um eine Seite mit stumpfen Pinzette.
  6. Visualisieren des Kehlkopfes mit Hilfe eines faseroptischen Gooseneck Mikroskopleuchte.
  7. Legen endotrachealen elastischen Katheters (21 G) in die Luftröhre.
  8. Überprüfen Sie, ob die Maus spontan atmenden eine reibungslose Umstellung (regular 100-150 Atemzüge / min, keine paradoxen oder flache Atmung).
  9. Platzieren Sie die Maus in Bauchlage unter der Dissektionsmikroskop.
  10. Die Maus mit einem Nagetier Ventilator mechanisch lüften (150 Atemzüge / min und 7 ml / kg Atemvolumen).
  11. Graf Rippen Zwischenrippenraum zwischen 4 und 5. Rippe zu finden.
  12. Erstellen Sie einen sterilen Bereich über den Bereich by gründlich Abwischen mit Alkohol und PVP-Jod. Decken Sie das Operationsfeld ausreichend mit einem sterilen Operationstuch.

3. Maus-Chirurgie

  1. Nachdem lokale Injektion von 0,25% Bupivacain (200 ul) in der Haut, machen Sie einen Querhautschnitt (ca. 1 cm Länge) über den Zwischenrippenraum mit Präparierscheren.
  2. Nach Injektion von 0,25% Bupivacain (200 ul) in die Zwischenrippenmuskel, einen Muskel Einschnitt zwischen dem 4. und 5. Rippe mit feinen kleinen Schere.
  3. Legen Sie eine Sezieren Aufroller zwischen den Rippen, um die linke Lunge vollständig zu visualisieren.
    1. Kratzen Sie einen kleinen Bereich (1 x 1 mm im Quadrat) der Pleura von der Mitte der linken Lunge mit feinen Pinzette.
    2. Drücken Sie vorsichtig auf den Bereich mit einem sterilen Wattestäbchen bis Blutungen und Luftleckagen vollständig gesteuert.
    3. Legen Sie kleine Menge frischer Mischung aus Fibrinogen / Thrombin (Fibrinkleber) (Schritt 20 1.1.2. & #181; l) über den Bereich mit p200 Pipettenspitze.
  4. Legen Sie vorsichtig eine Fibrin-Gel (Schritt 1.2) mit kleinen Zange über den Bereich (Abbildung 1b).
    1. Bestätigen Sie, dass das Gel auch auf den Bereich während der Atembewegungen der Lunge fest.
  5. Stellen Sie sicher, dass es weder massive Luft undicht oder Blutungen aus der Lunge.
  6. Schließen Einschnitte (Muskel- und Hautschichten) mit einer absorbierbaren Naht, welches nicht entfernt werden.
  7. Saugen Sie das Brusthöhle mit 27 G Nadel und 1-ml-Spritze zu Pneumothorax zu verhindern.
  8. Beenden der mechanischen Beatmung.

4. Mauswiederherstellung

  1. Achten Sie darauf, die Maus spontan atmenden eine reibungslose Umstellung (regular 100-150 Atemzüge / min, keine paradoxen oder flache Atmung).
  2. IP Injektion 1 ml vorgewärmtes, 0,9% NaCl, um Austrocknung zu verhindern.
  3. Lassen Sie mit der Maus auf dem zirkulierenden Warmwasserpolster erholen.
  4. Entfernen Sie die endotracheal Rohr nach der Bestätigung, dass die Maus über stabile Atmung.
  5. Injizieren Meloxicam (5 mg / kg, subkutane Injektion (SC), für 3 Tage als postoperative analgetische.
  6. Überwachen Sie die Bewegungen der Maus vorsichtig auf ein Minimum von 15 Minuten-Intervallen, bis es sternale (in der Lage, auf den Bauch rollen und bleiben aufrecht) und bei Bewusstsein.
  7. Nach der Wiederherstellung zurück die Maus, um einen neuen Käfig aus Mäusen isoliert ohne Operation.
  8. Überwachen Sie die Operationsstelle auf Anzeichen einer Infektion (Rötung, Schwellung, Ausfluss), grundlegende biologische Funktionen Tieres (Futter- und Wasseraufnahme, Wasserlassen, Stuhlgang, Gewichtszunahme) sowie klinische Anzeichen von Leiden (Piloerektion, reduziert Bewegungs) täglich im Anschluss an die chirurgischen Eingriffs.

5. Ernten der Lunge

  1. 7 bis 30 Tage nach der Implantation, euthanize der Maus unter Verwendung von CO 2 über Druckgasquelle.
  2. Einen Einschnitt zwischen der Spitze des Schwertfortsatz und der BrustbeinKerbe (mediane Sternotomie) und Ernte ganze Lunge mit dem implantierten Gel zur histologischen und biochemischen Analyse, indem die Luftröhre und seziert alle Verbindungen zum Herz, Lunge und Luftröhre.
  3. Fix implantierte Gel mit Lungenkrebs mit 4% Paraformaldehydlösung über Nacht bei 4 ° C, in OCT-Verbindung eingebettet werden, und nehmen Sie die Serienstufenabschnitte von 30 um Dicke.
  4. Führen histologische (Hämatoxylin und Eosin-Färbung) und immunhistochemische Analysen (endotheliale Marker: CD31, epithelialen Marker: Aquaporin (AQP) 5 und Surfactant Protein (SP) -B) mit konfokalen Mikroskop 22,37,40.
  5. Kompilieren Stapeln optischer Schnitte (30 um dick), um dreidimensionale Bilder der Lungen Endothel- und Epithelzellen mit 3D-Bildanalyse-Software 37 zu bilden.
  6. Quantifizieren projizierten Flächen der neugebildeten Blutgefäßen mit Bildanalyse-Software 46.

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Ergebnisse

Um zu untersuchen, ob Host Lungen abgeleiteten Gefäßbildung im Inneren der Biomaterialien auf die Lunge implantiert rekapituliert Fibringele mit großen angiogenetischen Faktoren VEGF und bFGF supplementiert (0, 10 und 100 ng / ml) wurden auf die Oberfläche von lebenden Maus-Lungen implantiert berichtet mit Matrigel 22. Fibringele 47, die diese angiogene Wachstumsfaktoren enthalten, wurden hergestellt, wie in 1a gezeigt. Nach Thorakotomie wurde ein kleiner Bereich der linken Lungeno...

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Diskussion

Dieser Artikel stellt eine neue Methode zur Biomaterialien auf der Lungenoberfläche lebender erwachsener Mäuse zu implantieren. Mit diesem System wird die Host-Lungen-abgeleitete Angiogenese erfolgreich im Material rekapituliert. Dieses System ermöglicht es den Forschern, um Übersprechen zwischen den Endothelzellen zu erforschen, andere Zellen (beispielsweise Epithelzellen, mesenchymale Zellen, Immunzellen) und verschiedene ECM-Komponenten, die für die lokale Angiogenese 50-53 und alveolären Regenera...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Mittel aus der American Heart Association (AM), US Department of Defense (BC074986) und Boston Kinderkrankenhaus Fakultät Career Development Fellowship (TM, PM) unterstützt. Die Autoren danken Amanda Jiang und Elisabeth Jiang für die technische Unterstützung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Fibrinogen aus menschlicher PlazentaSigmaF4883Zur Herstellung von Fibringel
Thrombin aus RinderplasmaSigmaT9549Zur Herstellung von Fibringel
Rekombinante Maus VEGF 164R& D493-MVZur Ergänzung von Fibringel
Rekombinante Maus bFGFR& D3139-FBZur Ergänzung von Fibringergel Nagetier-Intubationsständer
Braintree Scientific INCRIS 100Zur Intubation
Faseroptische LichtquelleFisher Scientific12-565-35Zur Intubation
21 G Elastischer KatheterB.Braun4251652-02Zur Intubation
MiniVent VentilatorHarvard ApparatCGS-8009Für Beatmung
Stemi DV4 SteromikroskopFisher Scientific12-070-515Für chirurgische
Absobable NahtEthiconPDP304Chirurgisches Nahtmaterial
Antikörper gegen CD31BD Biosciences553370Immunhistochemie
Antikörper gegen AQP5AbcamAB78486Immunhistochemie
Antikörper gegen SP-BAbcamAB40876Immunhistochemie

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