Dünndarm Krypta Organoiden kultiviert ex vivo eine Gewebekultursystem, das Wachstum der Krypten abhängig Stammzellen und ihrer Nische rekapituliert. Wir haben eine Methode, um das metabolische Profil in Echtzeit in der primären Maus Krypta Organoiden testen. Wir fanden Organoiden aufrechtzuerhalten physiologischen Eigenschaften von ihrer Quelle definiert.
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Methodenartikel
Echtzeit-Analyse von Stoffwechselprofil in Ex Vivo Maus Intestinale Crypt Organoide Kulturen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Dünndarmschleimhaut weist eine sich wiederholende Architektur in zwei Grundstrukturen organisiert: Zotten, in das Darmlumen vorspringende und reifer Enterozyten, Becherzellen und enteroendokrinen Zellen zusammengesetzt; und Krypten, wohnhaft proximal der Submukosa und Muskularis, Beherbergung adulten Stammzellen und Vorläuferzellen und reife Panethzellen sowie Stromazellen und Immunzellen der Krypta Mikroumgebung. Bis zu den letzten Jahren, in vitro Untersuchungen von Dünndarm wurde, um Zelllinien entweder benigne oder maligne Tumoren abgeleitet sind, und nicht die Physiologie der normalen Darm Epithelien und den Einfluss der Mikroumgebung, in dem sie sich aufhalten darstellen. Hier zeigen wir ein Verfahren von Sato et al angepasst. (2009) für die Kultivierung von primären Maus-Darm-Krypta Organoide von C57BL / 6-Mäusen abgeleitet sind. Darüber hinaus präsentieren wir die Verwendung von crypt Organoid Kulturen, um die Krypta metabolische Profil in Echtzeit von Maßnahme zu testenment der basalen Sauerstoffverbrauch, glykolytischen Rate, die ATP-Produktion und Atemkapazität. Organoiden aufrechtzuerhalten Eigenschaften durch ihre Quelle definiert und Aspekte ihrer metabolischen Anpassung durch den Sauerstoffverbrauch und die extrazelluläre Ansäuerung Raten wider behalten. Echtzeitstoffwechselstudien in dieser Krypta Organoid Kultursystem sind ein leistungsfähiges Werkzeug zur Krypta Organoid Energiestoffwechsel zu untersuchen, und wie sie durch Ernährungs- und pharmakologischen Faktoren moduliert werden.
Einleitung
Darmkrebs (CRC) ist die dritthäufigste Ursache der durch Krebs Todesfälle in den Vereinigten Staaten. Sporadische Darmkrebs - das heißt, dass die sich später im Leben (> 50 Jahre) und ohne klare prädisponierende genetische Faktoren - Konten für ~ 80% aller Fälle, mit Einfalls stark durch langfristige Ernährungsmuster 1,2 beeinflusst. Diese Tumoren weisen eine metabolische Verschiebung hin Abhängigkeit oxidative Glykolyse als Warburg-Effekt bekannt, das zum Teil machen können höhere Konzentrationen der Zellbausteine und Energie zur Verfügung (über Glutaminolyse) zu hohen Raten der Tumorzellproliferation 3-5 gestatten und vielleicht fah....
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Protokoll
Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Das Protokoll wurde von dem Ausschuss für die Ethik der Tierversuche des Albert Einstein College of Medicine genehmigt.
1. Crypt Isolierung und Kultur
- Isolierung von Krypten aus dem Dünndarm:
- Isolieren Darmkrypten aus jedem Mausmodell von Interesse. Euthanize die Mäuse mit CO 2, gefolgt durch zervikale Dislokation.
- Öffnen Sie den Bauch längs und füllen den Dünndarm (SI) mit eiskaltem Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, PBS (-Ca 2+....
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Ergebnisse
Crypt Organoiden wurden 8 Monate alten C57BL / 6-Mäusen etabliert gereinigt Nagerfutter American Institute of Nutrition 76A (AIN76A). Intestinale Krypta Organoiden können in Kultur über einen längeren Zeitraum von einem einzigen crypt (1A, einzelne rote Pfeil) angebaut werden. Organoiden wachsen aus Krypta-ähnliche Strukturen in 18-20 Tagen in Kultur (1B, rote Pfeile). Krypten wurden alle 3 Wochen agiert und Organoiden effizient nach jedem Durchgang gewonnen.
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Diskussion
Wir testeten die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und die extrazelluläre Ansäuerung Rate (ECAR) der Krypten von 8 Monate alten Mäusen isoliert und in Organoiden ex vivo gewachsen. Nach Messung der Basalrate wurde Krypta Stoffwechsel durch Zugabe Oligomycin, Carbonylcyanid bewertet -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) und Rotenon, nacheinander.
29 min (2A und 2B) - basale OCR und basalen ECAR wurden aus 0 aufgezeichnet. Am 29. min, Olig.......
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Offenlegungen
Es sind keine Angaben.
Danksagungen
Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse RO1 CA 135.561, R01 CA151494, R01 CA174432 und P3013330 von den National Institutes of Health.
Wir möchten Michele Houston, Elena Dhima und Dr. Anna Velcich für ihre wertvollen Kommentare bei der Entwicklung der Krypta Isolierungsprotokoll danken.
Wir danken auch den Diabetes-Schulungen und Forschungszentrum in der Albert Einstein College of Medicine vom NIH P60DK20541 unterstützt, und Dr. Michael Brownlee und Dr. Xue-G. Richter, der direkt und Betrieb der Seahorse Anlage verbunden.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| BD Matrigel Basalmembranmatrix, GFR, phenolrotfrei, LDEV-frei | BD Biosciences | 356231 | |
| PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung), kein Magnesium, kein Kalzium, pH 7,2 | Life Technologies | 20012-027 | |
| Advanced DMEM/F-12 (1x) | Life Technologies | 12634-028 | |
| Dulbecco′ s modifizierter Eagle′ s Medium ohne Glukose, L-Glutamin, Phenolrot, Natriumpyruvat und Natriumbicarbonat | Sigma-Aldrich | D5030 | |
| Phenolrotes Natriumsalz | Sigma-Aldrich | P4758 | Endkonzentration 15 mg/l in DMEM (D5030) - step 2.2.2 |
| Antibiotikum-Antimykotikum, 100x, 100 ml | Life Technologies | 15240-062 | Endkonzentration 1x oder 2x |
| Penicilin-Streptomycin, flüssig | Life Technologies | 15140-122 | Endkonzentration 1x |
| Gibco® GlutaMAX&Handel; Zusatz | Life Technologies | 35050061 | Endkonzentration 1x |
| Gibco® HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonsäure), 1 M | Life Technologies | 15630-080 | Endkonzentration 10 mM |
| N-Acetyl-L-Cystein, 25 g | Sigma-Aldrich | A9165-25G | Endkonzentration 1 mM |
| 100x N-2 Supplement, flüssig | Invitrogen | 17502-048 | Endkonzentration 1x |
| 50x B-27® Supplement minus Vitamin A, flüssig | Invitrogen | 12587-010 | Endkonzentration 1x |
| Rekombinante Maus R-Spondin 1, CF, 50 μ g | F& D Systems | 3474-RS-050 | Endkonzentration 500 ng/ml |
| Rekombinant Maus EGF, 100 μ g | Peprotech | 315-09 | Endkonzentration 50 ng/ml |
| Rekombinantes murines Noggin, 20 μ g | Peprotech | 250-38 | Endkonzentration 100 ng/ml |
| Gibco® L-Glutamin, 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | Endkonzentration 2 mM |
| Gibco® Glukosepulver | Life Technologies | 15023-021 | Endkonzentration 5 mM |
| Ambion® 0,5 M EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), pH 8,0 | Life Technologies | AM9260G | Endkonzentration 3 mM für step 1.1.5; 2 mM für step 1.1.8 |
| [header] | |||
| DTT (Dithiothreitol), 1M | Life Technologies | P2325 | Endkonzentration 3 mM |
| Albumin aus Rinderserum (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | 0,1% in PBS |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | 1% in PBS |
| Recovery™ Zellkultur Gefriermedium | Life Technologies | 12648-010 | |
| ROCK-Inhibitor (Y-27632) | Sigma-Aldrich | Y0503 | Endkonzentration 10 μ M |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | Endkonzentration 1 μ M |
| Carbonylcyanid-p-trifluor-methoxy-phenylhydrazon (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | Endkonzentration 1 μ M |
| Rotenon | Sigma-Aldrich | R8875 | Endkonzentration 1 μ M |
| Natriumhydroxid | Sigma-Aldrich | 221465 | Endkonzentration 0,1 N in PBS |
| XF24 Extrazellulärer Flussanalysator (XF-Analysator) | Seahorse Bioscience |
Referenzen
- Jemal, A., et al. CA Cancer J Clin. 58, 71-96 (2008).
- Slattery, M. L., Boucher, K. M., Caan, B. J., Potter, J. D., Ma, K. N. Eating patterns and risk of colon cancer. Am J Epidemiol. 148, 4-16 (1998).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
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Nachdrucke und Genehmigungen
