Wir präsentieren ein Verfahren zur Herstellung von Glimmer unterstützt Lipid-Doppelschichten für die hochauflösende Mikroskopie. Mica ist durchsichtig und flach auf atomarer Skala, aber nur selten in der Bildgebung aufgrund der Handhabungsschwierigkeiten verwendet werden; unserer Zubereitung ergibt sogar Abscheidung der Glimmerschicht und reduziert die Doppelschicht in Herstellung verwendeten Material ab.
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Methodenartikel
Herstellung von Mica Unterstützte Lipiddoppelschichten für Hochauflösende Optische Mikroskopie Imaging
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Unterstützt Lipiddoppelschichten (SLBs) sind weit verbreitet als Modell für die Untersuchung Membraneigenschaften (Phasentrennung, Clustering, Dynamik) und seine Wechselwirkung mit anderen Verbindungen, wie Drogen oder Peptide eingesetzt. Allerdings SLB Merkmale unterscheiden sich je nach verwendetem Unterstützung.
Häufig verwendete Techniken für die SLB-Bildgebung und Messungen sind Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie, FCS-und Rasterkraftmikroskopie (AFM). Da die meisten optischen Bildgebungsstudien werden auf einem Glasträger durchgeführt, während AFM erfordert eine extrem flache Oberfläche (in der Regel Glimmer), können die Ergebnisse von diesen Techniken nicht direkt verglichen werden, da die Ladung und Glätte Eigenschaften dieser Materialien stark beeinflussen Diffusion. Leider ist die hohe Fingerfertigkeit für das Schneiden und Kleben dünne Scheiben aus Glimmer an den Glasobjektträger erforderlich stellt eine Hürde für den routinemäßigen Einsatz von Glimmer für SLB Vorbereitung. Dies würde zwar die Methode der Wahl, wie Glimmer vorbereitet seinFlächen am Ende oft uneben (wellig) und schwer zu Bild, insbesondere mit kleinen Arbeitsabstand, hohe numerische Apertur Linsen. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache und reproduzierbare Verfahren zur Herstellung von dünnen, flachen Glimmeroberflächen für die Lipid-Vesikel-Abscheidung und SLB Vorbereitung. Außerdem haben wir unsere maßgeschneiderten Kammer benötigt nur sehr kleine Volumina von Vesikeln für SLB-Bildung. Das Gesamtverfahren führt die effiziente, einfache und kostengünstige Herstellung von qualitativ hochwertigen Lipiddoppelflächen, die direkt vergleichbar mit denen in AFM-Untersuchungen verwendet werden.
Einleitung
Das Gesamtziel des vorliegenden Protokolls ist es, ein Verfahren zur Herstellung von Glimmeroberflächen für hochauflösende Bildgebung von Glimmer unterstützt Lipid-Doppelschichten (SLBs) mit optischen Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRF) oder die konfokale Mikroskopie, die auch mit Atomkraft kombiniert werden konnten zeigen, Mikroskopie (AFM).
SLBs sind ein weit verbreitetes Modell für zahlreiche Studien von Lipid-Clustering, Phasentrennung, Dynamik der Doppelschicht-Komponenten oder ihre Wechselwirkungen mit Peptide, Proteine oder andere Verbindungen 1-5. Unterschiedlichen Substraten kann zur Bildung SLB (z. B.<....
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Protokoll
1. Mica und Slides Vorbereitung
- Platz Nr. 1 ½ (0,17 mm) Deckgläser in Färbung Rack.
- Beschallen für 30 min in 2% Detergens bei 60 ° C
- Mit VE-Wasser waschen 20-mal.
- Folien mit einer Pinzette entfernen und trocken blasen mit Druckluft oder Stickstoff.
- Schneiden Glimmer Blatt in 10 x 10 mm quadratische Stücke mit einer Schere oder Rasierklinge.
- Schneiden Sie die einzelnen Glimmer Stück in 2-3 dünner Blättchen mit Rasierklinge.
HINWEIS: Dieser Schritt erfordert die Verwendung von scharfen Klinge.
2. Mica Montage-und Befestigungskammer
- Saubere mikroskopischen G....
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Ergebnisse
Das Diffusionsverhalten von Fluoreszenzsonden in Lipid SLBs ist je nach dem Substrat. TIRFM kombiniert mit der SMT-Technik ist eine wertvolle Methode zur Visualisierung von Partikelbewegungen und Extrahieren ihre Diffusionskoeffizienten. Einzelmolekülsignale einer Sphingomyelin-ATTO647N Sonde Diffundieren in DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin)-Doppelschicht auf Glas und Glimmer gelagert sind in der beigefügten Figur gezeigt animiert. Der Glimmer-Oberfläche wurde nach dem hier vorgestellten Protokoll .......
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Diskussion
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung glatte und dünne Glimmeroberflächen für Lipid-Doppelschicht Abscheidung und hochauflösende Bildgebung. Die Technik erfordert nur minimale manuelle Fertigkeiten, vor allem auf die sorgfältige Demontage der Glasglimmer-Glas-Sandwich (Schritt 2.8), die entscheidend für die Erzielung einer hohen Qualität Glimmeroberfläche ist begrenzt. Inspektion der frisch gespaltenen Glimmer wird immer an diesem Punkt notwendig, da es möglich ist, die Glimmer, von der optischen Kle.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Die Autoren haben keine Bestätigungen.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Bad-Ultraschallgerät | Fisher Scientific | FB15051 | |
| Deckgläser 24 x 50 mm - Nr. H1,5 | Marienfeld | 102222 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipide | 850357 | |
| Hellmanex III (Waschmittel) | Hellma Analytics | 320.003 | |
| Glimmer V-1 Klasse | SPI Lieferanten | 1872-CA | |
| Optischer Klebstoff (hoch Viskosität) | Norland Products | NOA63 | |
| Optischer Klebstoff (niedrige Viskosität) | Norland Products | NOA60 | |
| Sphingomyelin-ATTO647N | AttoTec | AD 647N-171 | |
| UV-Lampe | Synoptics Ltd. | GelVue GVM20 | Die Lampe wurde auf 100% Leistung eingestellt |
Referenzen
- Giocondi, M. -C., et al. Surface topography of membrane domains. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 703-718 (2010).
- Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. Surface analysis of membrane dynamics. Biochim Biophys Acta. 1798, 766-776 (2010)....
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Nachdrucke und Genehmigungen
