Methodenartikel

Die Verwendung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie und einer Kundendatenbank zu den Bakterien Indigene auf eine einzigartige Höhle Umwelt (Kartchner Caverns, AZ, USA) Charakterisieren

DOI:

10.3791/52064

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2. Januar 2015

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1School of Mathematical and Natural Sciences, Arizona State University, 2Applied Maths NV

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Diese Arbeit beschreibt Verfahren zur schnellen Identifizierung von Bakterien mittels MALDI-TOF MS. Zu den Identifizierungsverfahren gehören die Erfassung des Spektrums, der Aufbau einer Datenbank und Folgeanalysen. Es werden zwei Identifizierungsmethoden vorgestellt, die auf dem Ähnlichkeitskoeffizienten und die auf Biomarkern basierende Methode.

Zusammenfassung

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MALDI-TOF-Massenspektrometrie hat sich als schnelles und zuverlässiges Werkzeug zur Identifizierung von Bakterien der Gattung und Spezies und in einigen Fällen auch auf Stammebene erwiesen. Kommerziell erhältliche und quelloffene Softwaretools wurden entwickelt, um die Identifizierung zu erleichtern. In der Literatur wurde jedoch keine universelle/standardisierte Datenanalyse-Pipeline beschrieben. Hier bieten wir eine umfassende und detaillierte Demonstration von Verfahren zur Identifizierung von Bakterien mit einem MALDI-TOF-Massenspektrometer. Massenspektren wurden von 15 verschiedenen Bakterien gesammelt, die aus den Kartchner Caverns, AZ, USA, isoliert und durch 16S rDNA-Sequenzierung identifiziert wurden. Die Datenbanken wurden in BioNumerics 7.1 erstellt. Es wurden Folgeanalysen von Massenspektren durchgeführt, einschließlich Clusteranalysen, Peak-Matching und statistischer Analysen. Die Identifizierung erfolgte anhand von blind kodierten Proben, die nach dem Zufallsprinzip aus diesen 15 Bakterien ausgewählt wurden. Es werden zwei Identifizierungsmethoden vorgestellt: Ähnlichkeitskoeffizienten-basierte und Biomarker-basierte Methoden. Die Ergebnisse zeigen, dass beide Identifizierungsmethoden die Bakterien auf Speziesebene identifizieren können.

Einleitung

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Die Matrix-unterstützte Laserdesorption/Ionisationszeit-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF) hat sich als schnelles und zuverlässiges Werkzeug zur Identifizierung von Bakterien der Gattung, Spezies und in einigen Fällen der Stammstufen1-4 erwiesen. MALDI-TOF MS ionisiert biologische Moleküle (typischerweise Proteine), die von Zelloberflächen, intrazellulären Membranen und Ribosomen aus bakteriellen ganzen Zellen oder Proteinextrakten stammen1,5. Die dabei entstehenden Peaks bilden charakteristische Muster oder "Fingerabdrücke" der analysierten Bakterien1. Die Identifizierung von Bakterien basiert auf diesen "Fingerabdrücken" von Masse zu Ladung.

Zwei der am häufigsten verwendeten Identifizierungsstrategien sind bibliotheksbasierte und bioinformatische Strategien1. Bibliotheksbasierte Ansätze beinhalten den Vergleich der Massenspektren von Unbekannten mit zuvor gesammelten Massenspektren bekannter Bakterien in Datenbanken/Bibliotheken zur Identifizierung. Kommerziell erhältliche Software wie BioNumerics, Biotyper und SARAMIS Softwarepakete sowie Open-Source-Softwaretools wie SpectraBank6 stehen zur Verfügung, um den Vergleich und die Quantifizierung der Ähnlichkeit zwischen Massenspektren von Unbekannten und Referenzbakterien zu erleichtern. Bioinformatik-basierte Ansätze stützen sich in der Regel auf vollständig sequenzierte Genome von Bakterien zur Identifizierung. Im Gegensatz zu bibliotheksbasierten Ansätzen, die keine Identifizierung der biologischen Natur bestimmter Peaks beinhalten, beinhalten bioinformatikbasierte Ansätze die Proteinidentifizierung1.

Die Mehrzahl der neueren MALDI-Fingerabdruck-basierten Studien hat bibliotheksbasierte Ansätze zur Identifizierung von Bakterien verwendet1. Bibliotheksbasierte Ansätze erfordern den Aufbau von Datenbanken und den Vergleich der Ähnlichkeit zwischen Massenspektren. Studien zeigen, dass viele experimentelle Verfahren, wie z. B. Medium3,7, Kultivierungszeit8, Probenvorbereitungsmethode3 und verwendete Matrix9, die erhaltenen Massenspektren beeinflussen. Darüber hinaus erzeugen einige eng verwandte Spezies und Stämme Spektren mit nur feinen Unterschieden. Daher erfordern bibliotheksbasierte Ansätze streng standardisierte Verfahren, um hochgradig reproduzierbare Massenspektren zwischen Replikaten zu erzeugen. Geringfügige Abweichungen in den Protokollen können die Wirksamkeit der Identifizierung beeinträchtigen, insbesondere bei den Unterarten und Stammesstufen1,3,10. Weder die vom Hersteller bereitgestellten Referenzdatenbanken noch die gemeldeten benutzerdefinierten Datenbanken enthalten jedoch visuell dokumentierte Verfahren für den Datenbankaufbau und/oder die Anwendung einer Datenanalyse-Pipeline. Aus diesem Grund war es das Ziel dieser Arbeit, ein umfassendes und detailliertes Verfahren zur bibliotheksbasierten bakteriellen Identifizierung mittels MALDI-TOF MS zu entwickeln, anzuwenden und zu demonstrieren.

In dieser Demonstration wurden Massenspektren von 15 Bakterien, die aus einer Karstumgebung (Kartchner Cavern, AZ, USA) isoliert wurden, gesammelt und in eine Software importiert, um eine Modelldatenbank zu erstellen. Die Datenverarbeitung und die Analysepipeline wurden anhand der Modelldatenbank detailliert beschrieben. Abschließend wurden Massenspektren von blind kodierten Bakterien, die zufällig aus diesen 15 Bakterien ausgewählt wurden, erneut gesammelt und mit den Referenzspektren in der Modelldatenbank zur Identifizierung verglichen. Die Ergebnisse zeigen, dass Bakterien entweder anhand von Ähnlichkeitskoeffizienten oder potenziellen Biomarkern/Peakklassen korrekt identifiziert werden können.

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Protokoll

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Achtung: Nicht identifizierte Bakterien aus jeder Umgebung kann pathogen sein und müssen mit Vorsicht mit geeigneten Biosicherheit Protokolle behandelt werden. Arbeit mit lebenden Kulturen müssen in einer Klasse II Biosicherheitswerkbank mit biologischen Sicherheitsstufe 2 (BSL-2) Verfahren durchgeführt werden. Mehr Informationen über BSL-2 Verfahren ist im CDC / NIH-Handbuch mit dem Titel "Biosicherheit in Mikrobiologischen und Biomedizinischen Laboratorien", Seiten 33 bis 38 zur Verfügung. Das Dokument ist im Internet unter http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf . Geeignete Schutzausrüstung (PSA), einschließlich Laborkittel / Kleider, Schutzbrille und Nitril oder Latex-Handschuhe, zu tragen. Standard mikrobiologische Verfahren und Vorsichtsmaßnahmen sind zu beachten, und biologischer Abfälle müssen fachgerecht entsorgt werden.

Bakterien in dieser Demonstration verwendet wurden Kartchner Caverns isoliert,AZ, USA, aus vier Umgebungen, einschließlich Trockenhöhlensinter, Flussstein, feuchten Höhlensinter und Stalaktiten Tropf (Tabelle 1). Alle Isolate wurden von 16S rDNA identifiziert und bei -80 ° C in 25% Glycerin-R 2 B-Medium gehalten. Alle Experimente wurden bei RT abgeschlossen.

Hinweis: Wir empfehlen mit dem gleichen Probenvorbereitungsmethode auf Massenspektren für die Datenbankerstellung und Massenspektren der Unbekannten zu erwerben. Probenvorbereitungsverfahren wurde zuvor auf Spektrum Qualität und Reproduzierbarkeit 3 beeinflussen gezeigt. Die Verwendung eines anderen Probenvorbereitung kann falsche Identifizierung der Unbekannten, vor allem bei höheren taxonomischen Auflösung (zB, auf Stammebene) führen gewünscht wird.

1. Die Ablagerung auf der MALDI-Target

Achtung: Mehrere Protokolle zu erhalten Proteinextrakte erfordern die Verwendung von Säuren und organischen Lösungsmitteln, die in Übereinstimmung mit GUID verwendet werden müssenelines und Informationen in ihren jeweiligen Materialsicherheitsdatenblätter (MSDS) enthalten. Geeignete PSA müssen getragen werden kann und von Art und Menge der verwendeten Chemikalien variieren (zB Laborkittel / Kleider, Handschuhe, Schutzbrille und Atemschutz muss bei der Arbeit mit erheblichen Mengen an toxischen, brennbaren Lösungsmitteln, wie Acetonitril verwendet werden, und korrosiven Säuren, wie Ameisensäure und Trifluoressigsäure).

  1. Kaution 1 ul Proteinextrakt, die keine lebensfähigen Zellen auf eine Edelstahlplatte MALDI-Target und trocknen lassen (unter Verwendung von geeigneten, zuvor beschriebenen Protokolle 11-13 erhalten). Überlagern der getrockneten Protein-Extrakt mit 1 ul Matrixlösung (α-cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure Lösung) und trocknen lassen.
  2. Für jede biologische Replikation, vor Ort eine entsprechende Anzahl von technischen Wiederholungen (5-20 technische Replikate). Hier, vor Ort 10 technische Wiederholungen für jede biologische Replikation und 3 biologischen Replikaten were vorbereitet.
    Hinweis: Wir empfehlen, mit einem polierten Stahl MALDI Zieltafel bei der Verwendung der Proteinextraktion Probenvorbereitung. Mit geschliffenem Stahl Zieltafeln kann zu verbreiten und unabsichtlichen Vermischung der verschiedenen Proben außerhalb der einzelnen Probenvertiefungen.
  3. Kaution 1 ul Eichsubstanz Standard auf die Zielplatte und lassen Sie ihn trocknen. Overlay mit 1 ul Matrixlösung und lassen Sie ihn trocknen.
  4. Deposit 2 ul Matrixlösung auf die Zielplatte als negative Kontrolle.

2. Massenspektren Acquisition

  1. Verwenden Sie ein MALDI-TOF-Massenspektrometer mit einem Stickstofflaser (λ = 337 nm) ausgestattet und mit Bruker Flexcontrol-Software betrieben.
  2. Sammeln jedes Massenspektrum in positive linearen Modus durch die Ansammlung von 500 Laserschüsse in 100 Schuss-Schritten. Stellen Sie den Spannungsionenquelle 1 bis 20 kV; Ionenquelle 2 Spannung auf 18,15 kV; und der Linsenspannung auf 9,05 kV. Beachten Sie, dass diese Parameter Instrument spezifischenFIC und könnten Anpassung auf andere Instrumente benötigen, um optimale Ergebnisse zu erzielen.
  3. Setze die Masse-Ladungs-Bereich für die automatische Spektrenauswertung 2-20 kDa pro Ladung. Verwenden Sie die Schwerpunktspitzenerkennungsalgorithmus. Stellen Sie die Mindestauflösung Schwelle bei 100 Da. Stellen Sie das Signal-Rausch-Verhältnis (S: N) Schwelle bei 2. Stellen Sie die minimale Intensitätsschwelle bei 100.

3. Aufbau von Datenbanken

  1. Datenbankdesign
    1. Erstellen Sie eine neue Datenbank in BioNumerics 7.1 mit dem "Neue Datenbank-Assistent".
    2. Erstellen Sie ein Spektrum Experiment Art, zB Maldi, mit Befehlen in der "Experiment Typen" Panel.
    3. Erstellen Sie die Ebenen mit dem "Datenbank-Design-Panel". Fügen Sie eine neue Ebene mit dem "Ebene> Neue Ebene ..." Befehl im Menü "Datenbank". Hier erstellen "Species" Ebene "Biologische replizieren" Niveau "und" Technische replizieren "Ebene JEWEILIGENely.
  2. Importieren und Vorverarbeitung von rohen Massenspektren
    1. Exportieren Sie die rohen Massenspektren als .txt-Dateien mit FlexAnalysis indem Sie im Menü "Datei" die "Export> Massenspektrum" -Befehl.
    2. Importieren Sie die rohen Massenspektren (.txt-Dateien) in die Datenbank in der Ebene der technischen Replikaten.
    3. Vorverarbeitung der rohen Massenspektren.
      1. Import und resample (unter Verwendung einer quadratischen Anpassungsalgorithmus).
      2. Führen Sie eine Basis Subtraktion (mit einer Walz Scheibe mit einer Größe von 50 Punkten).
      3. Berechne Lärm [Continuous Wavelet-Transformation (CWT)], glatt (Kaiser-Fenster mit einer Fenstergröße von 20 Punkten und beta von 10 Punkten), und führen Sie eine zweite Basisliniensubtraktion (Rollscheibe mit einer Größe von 200 Punkten).
      4. Detektieren Peaks [CWT mit einer minimalen Signal-Rausch-Verhältnis (S: N) von 10].
    4. Nach Vorverarbeitung, speichern charakteristische Muster jedes Massenspektrum, wie zum Beispiel Peaklisten Peak,Größen Spitzenintensitäten, S: N, usw., die in der Datenbank.
  3. Erstellen von Verbundmassenspektren
    1. Erstellen Sie zusammengesetzte Spektrum von vorverarbeiteten Spektren mit Hilfe des "Fassen Sie ..." Befehl im Menü "Analyse". Wählen Sie die "biologische Replikation" als Zielniveau.
    2. Hier kombinieren Massenspektren von 10 technische Replikate der gleichen Kolonie, ein Verbundmassenspektrum für die Kolonie zu erhalten, was zu drei Verbundmassenspektren für diesen Isolat an der "Biologische replizieren" Ebene.
    3. Hier eine Zusammenfassung der drei zusammengesetzten Spektren zu einem Verbundspektrum für die in der "Species" Ebene zu isolieren erstellen.
      Hinweis: Der zusammengesetzte Spektrum ist die Punkt-für-Punkt-Mittelwert der technische Replikate. Repliziert mit Ähnlichkeit (Pearson-Korrelation) auf den Mittelwert von weniger als 95% (Standardeinstellung) aus dem Verbund ausgeschlossen. Peaks auf der zusammengesetzten Spektren sind nur aufgerufen, wenn sie vorhanden sind, in 75% (Default-Einstellung) der enthaltenen Wiederholungen. Für die biologischen Replikate wurden diese Einstellungen 90 und 60% betragen.

4. Massenspektrum Data Analysis

  1. Wählen Sie die Einträge in der Datenbank, und erstellen Sie einen Vergleich, indem Sie in der "Vergleiche" Feld den Befehl "Neue Vergleich".
  2. Hier verwenden Sie den Massenspektren an der "Technischen replizieren" und / oder "Biologische replizieren" Ebenen, um Vergleiche und Analysen zeigen.
  3. Similarity-Cluster-Analyse und mehrdimensionale Skalierung (MDS)
    1. Erstellen von Gruppen mit Farben. Wählen Sie die drei biologischen Verbundmassenspektren und klicken Sie auf "Neue Gruppe erstellen aus Auswahl" Befehl im Menü "Gruppen", um eine Gruppe für die entsprechende Isolat erstellen. Bestimmen Sie automatisch eine Farbe für diese drei Massenspektren verwendet.
    2. Alternativ definieren Feld Staaten mit entsprechenden Farben mit den Befehlen in der "Datenbankeinträge "Panel, so dass jede Gruppierung auf der Grundlage dieser definierten Feld verwendet die gleiche Farbe für diese Gruppe definiert.
    3. Führen Sie die Clusteranalyse. Klicken Sie auf den "Berechnen Clusteranalyse" Befehl im Menü "Clustering". Auf der Vergleich Einstellungen Seite 1, wählen Sie die "Pearson-Korrelation" und lassen Sie andere Parameter als Standard. Auf Seite 2 wählen Sie "UPGMA". Klicken Sie dann auf "Fertig stellen".
    4. Erhalten MDS Grundstück mit dem "Multi-dimensionale Skalierung ..." Befehl im Menü "Statistik".
  4. Peak-Matching
    1. Klicken Sie auf das Spektrum Typ "Maldi" in der "Experimente" Panel. Wählen Sie dann "Layout> Bild anzeigen". Spectra als Gelbanden angezeigt.
    2. Führen Spitzenanpassung mit dem "Do Spitzen Matching" Befehl im Menü "Spectra".
  5. Ermittlung von Spitzenklassen
    1. Führen Sie die Hauptkomponentenanalyse (PCA). Markieren Sie die "Maldi "Experiment Typ in der" Experimental "Platte und verwenden Sie die" Hauptkomponentenanalyse ... "Befehl im Menü" Statistische "PCA durchzuführen.
    2. Führen bidirektionale Clustering. Klicken Sie auf die "Statistik> Matrix Mining" ... im Fenster "Vergleich". Die Intensität der Peaks zu den Spitzenklassen abgestimmt ist vertreten mit verschiedenen Farben (Heatmap).

5. Bakterien Identifikation mit einer Kundendatenbank

  1. Ähnlichkeit Koeffizient-basierte Verfahren
    1. Erstellen Sie einen Vergleich und erzeugen ein Dendrogramm auf Basis von Massenspektren an der "Technischen replizieren" Niveau wie in Schritt 4.3.3 beschrieben. Speichern Sie die Dendrogramm zum Vergleich der Ähnlichkeit.
    2. Wählen Sie eine unbekannte Massenspektrum, und klicken Sie auf "Analysis> Identifizieren Sie ausgewählte Einträge". Das Dialogfeld Identifikation erscheint.
    3. Wählen Sie den "Vergleich auf der Basis" Sichter des Typs (oder ein gespeichertes classifier) und klicken Sie auf "Weiter". Auf der nächsten Seite wählen Sie die gespeicherte Dendrogramm als Referenz Vergleich und klicken Sie dann auf "Weiter".
    4. Wählen Sie die "Grund Ähnlichkeit" als Kennzeichnungsmethode und klicken Sie dann auf "Weiter".
    5. Wählen Sie die "maximale Ähnlichkeit" als Bewertungsmethode. Geben Sie in den entsprechenden Schwellenwerten und Minimaldifferenzwerte für jeden Parameter und klicken Sie auf "Weiter".
    6. Wenn die Berechnungen abgeschlossen sind, wird das Identifikationsfenster. In der "Ergebnisse" Panel werden die Mitglieder der Datenbank, die am besten die unbekannt aufgeführt.
    7. Speichern Sie die Projektidentifikation und Validierung der Identifizierung mit dem "Kreuzvalidierung Analyse" -Befehl in der "Identifikation Projekt" Panel.
  2. Potenzielle Biomarker-basierte Verfahren
    1. Definieren Spitzenklassen. Im Fenster "Matrix Mining", wählen Sie Gruppen von Gipfeln, die gemeinsame Eigenschaften und definieren Sie diese Spitzen als Spezific Spitzenklassen (potentielle Biomarker) mit "Spectra> Verwalten Spitzenklassentypen ..." im "Vergleichsfenster".
    2. Hier definieren spezifisch für jedes Isolat für alle 15 Isolate Spitzenklassen.
    3. Wählen Sie die Massenspektren der Unbekannten und passen die Spitzen dieser Spektren zu den definierten Spitzenklassen wie zuvor beschrieben.

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Ergebnisse

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Die in dieser Demonstration gebaut Datenbanken hatte vier Ebenen, vom höchsten zum niedrigsten Ebene, einschließlich "Alle Ebenen", "Species", "Biologische replizieren" und "Technische Replikation" bezeichnet (Abbildung 1A). Die "Technische replizieren" Ebene enthalten alle vorverarbeiteten Spektren technische Replikate. Die "biologische Replikation" und "Species" Ebenen enthielt die Verbund (Zusammenfassung) Spektren. "Alle Ebenen" enthalten alle technischen Wiederholungsspektren sowie die ganze zusamm...

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Diskussion

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Diese Demonstration zeigt detaillierte Verfahren der Charakterisierung und Identifizierung von Bakterien mittels MALDI-TOF MS und eine benutzerdefinierte Datenbank. Im Vergleich zu herkömmlichen molekularbiologischen Methoden, beispielsweise der 16S rDNA, MALDI-TOF MS-basierten Fingerabdruckverfahren erleichtern schnelleren Identifizierung der verschiedenen Bakterien. Wegen seiner Robustheit, wird diese Technik häufig verwendet, um Bakterien, Viren, Pilzen und Hefe, die aus der Umgebung und im klinischen Umfeld 1,1...

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Offenlegungen

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Die Autoren Vranckx und Janssens sind Mitarbeiter von Applied Maths NV, dem Hersteller von Datenanalysesoftware, die in diesem Video verwendet wird. Applied Maths NV stellte ausgewählte Softwaremodule, die in diesem Video vorgestellt werden, sowie einen Teil der mit diesem Video verbundenen Veröffentlichungskosten zur Verfügung.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde unterstützt vom New College of Interdisciplinary Arts and Sciences an der Arizona State University, Applied Maths NV, und von der National Science Foundation (ROA Supplement to Award No. MCB0604300). Alle Meinungen, Erkenntnisse und Schlussfolgerungen oder Empfehlungen, die in diesem Material geäußert werden, sind die des Autors/der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten der National Science Foundation wider.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
α-Cyano-4-hydroxy-zimtsäureACROS Organics163440050≥ 97%, CAS 28168-41-8
Bruker FlexControl SoftwareBruker DaltonicsVersion 3.0
Bruker FlexAnalysis SoftwareBruker DaltonicsVersion 3.0
Bionumerics SoftwareApplied MathsVersion 7.1

Referenzen

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Schlagwörter

BakteriidentifizierungBioNumerics 7 1hnlichkeitskoeffizientenmethodebiomarkerbasierte MethodeClusteranalysePeak MatchingMassenspektrenanalyseblindcodierte Proben

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