Herzgenexpressionsprofile bei Zebrafisch Herzentwicklung zu analysieren, wurde Gesamt-RNA aus isolierten Herzen gewonnen werden. Hier präsentieren wir ein Protokoll für das Sammeln von Funktions / klopfenden Herzen durch schnelle manuelle Dissektion von Zebrafischembryonen zu herzspezifischen mRNA zu erhalten.
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Methodenartikel
Großzebrafisch Embryonale Herz Dissection für Transkriptionsanalyse
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der Zebrafisch embryonalen Herzens wird von nur wenigen hundert Zellen bestehen, nur einen geringen Bruchteil des gesamten Embryos. Deshalb, um die Herz Transkriptom nicht durch die globale embryonale Transkriptom maskiert zu verhindern, ist es notwendig, eine ausreichende Zahl von Herzen für weitere Analysen zu sammeln. Darüber hinaus, wie Zebrafisch-Herz-Entwicklung schreitet schnell voran, Herz Sammlung und RNA-Extraktionsmethoden müssen schnell sein, um die Homogenität der Proben zu gewährleisten. Hier präsentieren wir eine schnelle manuelle Dissektion Protokoll zum Sammeln Funktions / schlagenden Herzen von Zebrafischembryonen. Dies ist eine wesentliche Voraussetzung für die nachfolgende herzspezifischen RNA-Extraktion zur herzspezifischen Genexpression bestimmen, durch Transkriptom-Analysen, wie die quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR). Das Verfahren basiert auf Differentialhafteigenschaften des Zebrafisch embryonalen Herzens im Vergleich zu anderen Geweben beruhen; Dies ermöglicht eine schnelle physical Trennung von Herzgewebe aus extra durch eine Kombination von Fluidscherkraft Unterbrechungen schrittweise Filtration und manuelle Sammlung von transgenen fluoreszierend markierten Herzen.
Einleitung
Zebrafisch (Danio rerio) ist weit verbreitet in der Entwicklungsbiologie zur Organogenese in vivo zu untersuchen, durch die schnelle, transparente und extrauterine embryonalen Entwicklung, verbunden mit geringen Größe und der Verfügbarkeit von transgenen Reporter Linien mit gewebespezifische Expression von fluoreszierenden Proteinen. Dieses kleine Wirbeltiere ist besonders gut geeignet, um Herzentwicklung zu studieren, weil die Sauerstoffversorgung des frühen Zebrafischembryo nicht von Herzschlag und Blutfluss verlassen; Diese Eigenschaften haben die Charakterisierung einer großen Anzahl von kardiovaskulären Mutanten 1,2 erlaubt und der Zebrafisch ist nun eine anerkannte Modellorganismus an Herzkrankheiten 3 untersuchen.
Die Genexpression während der Embryonalentwicklung zu untersuchen, werden Transkripte häufig von ganz-mount in situ Hybridisierung (WISH) 4 analysiert, RT-qPCR 5, Microarrays 6 oder Next Generation Sequencing (RNA-Seq) 7. WährendWISH ermöglicht eine räumlich-zeitliche Analyse der Genexpression im gesamten Embryo werden Transkriptniveaus üblicherweise durch RT-qPCR, Mikroarrays oder RNA-Seq Ansätze beurteilt. Allerdings erfordern diese Verfahren Gewebe Bereicherung für spezifische Gene Expression Profiling.
Da der Zebrafisch embryonalen Herzen einen kleinen Teil des gesamten Embryo, Transkriptom-Studien während der Herzentwicklung erfordern ein Protokoll für die Präparation und Anreicherung von Herzen. Darüber hinaus, um physiologisch relevante Daten zu erhalten, ist es wichtig, das Herzgewebe voll funktionsfähig, bis die RNA-Extraktion zu erhalten. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Isolierung schnell physiologisch normal und schlagenden Herzen von Hunderten von Zebrafischembryonen, qualitativ hochwertige RNA-Proben effizient zu erhalten für weitere Analysen. Das vorliegende Verfahren basiert auf dem Protokoll, das von Burns und MacRae 2006 8 ausgewiesen ist. Zur Anreicherung von Herzgewebe, beide Methoden verwenden eine transgene myokardialen Reporter Linienund profitieren Sie von den differentiellen Hafteigenschaften der Zebrafisch embryonalen Herzen gegenüber anderen Geweben. Kurz gesagt, durch Pipettieren viele Embryonen nach oben und unten durch einen schmalen Pipettenspitze, Herzen gleichzeitig von embryonalen Körper freigesetzt und anschließend aus embryonalen Ablagerungen in zwei schnelle Filtrationsschritte voneinander getrennt sind; fluoreszenzmarkierte Herzen werden dann manuell von den restlichen Verunreinigungen sortiert und für die weitere Verarbeitung gesammelt.
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Protokoll
Dieses Protokoll folgt den Tierschutzvorschriften des deutschen und Berliner Landesrecht; Zebrafisch-Handling wurde von der lokalen Behörde für Tierschutz (LAGeSo, Berlin-Brandenburg) überwacht.
1. Gewinnung Zebrafischembryonen für Herz-Extraktion
- Kreuz Herz Reporter Zebrafisch wie der Tg (myl7: EGFP) twu34 transgenen Linie 9 um Embryonen mit herzspezifischen GFP-Expression zu erhalten.
- Pflegen Sie die Embryonen im Ei Wasser bei 28,5 ° C, bis die gewünschte Embryonalstadium 10,11. Stellen Sie sicher, dass die gesammelten Embryo Bevölkerung ist homogen sowohl genetisch und durch Entwicklungsstadium, um Variationen in der Genexpression zu begrenzen.
- Dechorionate die Embryonen manuell.
2. Dissecting Zebrafisch Embryonale Herz
HINWEIS: Bewahren Sie alle Lösungen auf Eis. Wenn möglich, Teamarbeit: eine Person seziert die Herzen der embRYOS während eine andere Person sortiert die Herzen unter dem Fluoreszenz-Stereomikroskop. Dies ermöglicht die Verarbeitung von mehreren hundert Embryonen in ein paar Stunden.
- Übertragen ungefähr 100 Embryonen in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen. Anesthetize die Embryonen mit Tricaine (0,16 mg / ml in E3 Medium). Gehen Sie einmal die Embryonen deutlich narkotisiert (sie nicht schwimmen und Sediment auf den Boden der Röhre, aber ihr Herz noch schlägt).
- Entfernen Sie die Tricaine / E3-Lösung und waschen Sie die Embryonen einmal mit 1 ml L-15/10% FBS-Medium und zu warten auf Eis.
HINWEIS: Die L-15/10% FBS-Medium ist wichtig, Organe und Zellen während der gesamten Dissektion Verfahren am Leben zu erhalten, bis die Herzen wurden in RNAlater oder Trizol übertragen. - 1 ml L-15/10% FBS-Medium zu den Embryonen und Pipette auf und ab 5-8 mal mit einer Runde Spitze für Gel, bis das Eigelb vollständig zerstört. Pipettieren die Embryonen tropfenweise auf die Oberfläche der Lösung, so dass der Tropfen platzen unddie Embryonen werden vorsichtig aufgebrochen.
HINWEIS: Wie stark und wie oft die Embryonen müssen nach oben und unten pipettiert werden, hängt vom Entwicklungsstadium des Embryos, dh mehr Pipettieren in späten Stadien (zB bei 56 HPF) benötigt. - Für die erste Charge von sezierten Embryonen, beurteilen die Integrität der Embryonen und der Anteil der eingeschnittenen Herzen unter einem Stereomikroskop, da einige Herzen können zu den Embryonen befestigt bleiben, wenn sie zu leicht pipettiert. Stellen Sie die Art und Weise der Pipettieren für die nächsten Runden der Präparation entsprechend.
HINWEIS: Verwenden Sie Low Retention Pipettenspitzen, Reaktionsgefäße, die Herzen das Festhalten an dem Kunststoff zu minimieren. - Tragen Sie die Probe auf ein 100 um-Filter auf einem 50 ml Zentrifugenröhrchen platziert; spülen Sie die 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml L-15/10% FBS-Medium und wenden diese auf den Filter, um den Verlust der Probe zu minimieren (einige Herzen haften evtl. an den Wänden der Röhre). Den Filter waschen zweimal mit 1 ml L-15/10% FBS. In diesem Schritt werden die Herzen passieren den Filter und werden in der 50 ml-Röhrchen gesammelt.
- Tragen Sie die Durchfluss auf einen 30 um-Filter auf ein 15 ml Zentrifugenröhrchen platziert und spülen Sie den Filter einmal mit 1 ml L-15/10% FBS-Medium. In diesem zweiten Filtrationsschritt werden die Herzen in den Filter zurückgehalten und kleinere Bruch abgewaschen.
- Drehen Sie den Filter auf den Kopf und spülen das Herz aus dem Filter in einem 1% igen beschichtete Petrischale, indem drei aufeinanderfolgenden Waschungen mit 1 ml L-15/10% FBS.
- Manuell trennen GFP-positive Herzen der nichtfluoreszierenden embryonalen Schmutz (zB Augenlinsen) mit einer Pinzette unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop und konzentrieren sie in der Mitte der Schale. Sammeln Sie gemäß Schritt 3.
HINWEIS: Wenn die Embryonen sind älter als 24 HPF, sollten die Herzen schlagen werden, was darauf hinweist, dass die Gewebe sind noch physiologisch normal.
3. Isolieren von mRNA aus Dissected Herzen
- Sammeln, die Herzen in der kleinstmöglichen Volumen (zB 10 ul) und Pipette in ein 1,5-ml-Röhrchen mit 0,75 ml RNAlater (auf Eis). Stellen Sie sicher, dass keine Herzen bleiben in der Pipettenspitze von unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop betrachten es.
- Alternativ, wenn eine chemische Kapuze ist in unmittelbarer Nähe des Fluoreszenzmikroskops zur Verfügung, übertragen Sie die gesammelten Herzen in Trizol (VORSICHT) unter der chemischen Abzugshaube. Dies umgeht den möglichen Verlust der Herzen Kleben in der Pipettenspitze und auch während der Zentrifugation der Herzen (Schritte 3.4, 3.5 und 3.7). Bündeln die Herzen von mehreren Runden der Isolierung in der gleichen Röhre mit Trizol und gehen Sie direkt zu Schritt 3.8; Das Endvolumen sollte 10% des ursprünglichen Trizol Volumen nicht überschreiten.
HINWEIS: Lesen Sie die Trizol Sicherheitsdatenblatt (MSDS) vor dem Gebrauch. Griff Trizolreagenz unter einer Haube und Verschleiß empfohlenen Schutzausrüstung. Kontakt mit Haut, Augen und clothi vermeidenng. Alle Zündquellen entfernen. - Bündeln die Herzen von mehreren Runden der Isolierung in der gleichen Röhre mit RNAlater (auf Eis), wie die Effizienz der RNA-Isolierung verbessert sich mit der Menge des Gewebes gesammelt. Wenn das Gesamtprobenvolumen 10% des ursprünglichen RNAlater Volumen überschreitet, verwenden Sie ein weiteres Rohr mit 0,75 ml RNAlater für die Lagerung (auf Eis).
- Zentrifugiere die Proben bei 15.700 g 20 min bei 4 ° C, um das Herz zu sedimentieren.
- Unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop, sammeln sorgfältig soviel Überstand wie möglich in einem 1% Agarose-beschichtete Petrischale mit 3 ml L-15/10% FBS-Medium, aber nicht der sedimentierten Herzen in der Unterseite des Zentrifugationsröhrchen stören. Da bis zu 15% der Herzen können im Überstand aufgrund der hohen Viskosität von RNAlater bleiben, rufen sie, wie in Schritt 3.7 beschrieben.
- Unter einer chemischen Abzugshaube, 0,5 ml Trizol an das Rohr, das die sedimentiert Herzen und auf Eis halten.
- Unter dem Fluoreszenz microscope, übertragen die Herzen (von Schritt 3.5) von der 1% Agarose-beschichtete Schale mit dem RNAlater / L-15/10% FBS-Lösung in eine andere 1% Agarose-beschichtete Schale mit 3 ml L-15/10% FBS zu verdünnen aus dem RNAlater. Sammeln Sie die Herzen in der Mitte der Petrischale und übergeben sie in einem kleinen Volumen in das Rohr von sedimentiert Herzen in Trizol unter einer chemischen Abzugshaube.
- Vortex die 1,5-ml-Röhrchen, das die Herzen in Trizol, um die Herzen zu stören und Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
- Unter einer chemischen Abzugshaube, fügen Sie 100 ul Chloroform (VORSICHT), gut mischen und übertragen Sie die Trizol / Chloroform-Lösung in einer 1,5 ml vorge gesponnen PLG Rohr (Zentrifuge 30 Sekunden bei maximaler Geschwindigkeit vor der Verwendung). Inkubieren für 3 min bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Lesen Sie die Chloroform MSDS vor dem Gebrauch. Griff Chloroform Reagenz unter einem Abzug und tragen empfohlenen Schutzausrüstung. Kontakt mit Haut, Augen und Kleidung vermeiden. Weg von inkompatiblen halten, wie Metalle, Alkalien. - Centrifuge die Probe bei 15.700 xg für 15 min bei 4 ° C und übertragen die wässrige Phase in ein neues 1,5-ml-Röhrchen.
- Hinzufügen 5-10 ug Glykogen und 250 ul vorgekühlte (-20 ° C) Isopropanol; gut mischen und Inkubation über Nacht bei -20 ° C.
- Zentrifugieren Sie die Probe bei 15.700 · g für 30 min bei 4 ° C und den Überstand verwerfen.
- Waschen Sie das Pellet mit 1 ml 75% Ethanol, Zentrifuge bei 15.700 · g für 15 Minuten bei 4 ° C und den Überstand verwerfen.
- Lassen Sie das Ethanol verdampft durch Trocknen der Pellets bei Raumtemperatur, bis es weiß wird (zB für 10-15 min).
- Mit 20 & mgr; l RNase-freies ddH 2 O zu dem Pellet und Inkubation für 10-15 Minuten bei 55 ° C, um die RNA zu lösen; dann auf Eis zu halten.
- Beurteilen Sie die RNA-Konzentration und Reinheit durch Absorptionsmessung. Beurteilen Sie die RNA-Integrität, indem Sie die Probe auf einem 1% igen Agarosegel.
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Ergebnisse
Hier beschreiben wir einen repräsentativen Herz Dissektion Experiment unter Verwendung des Zebrafisch-Tg (myl7: GFP) twu34 transgenen Linie 9, die das grün fluoreszierende Protein (GFP) drückt ausschließlich im Myokard (Abb. 1). Wir sammelten sowohl die zergliederten Herzen und den Embryonen von denen sie abgeleitet wurden, um die Reinheit des Herzens Probe zu beurteilen. Kurz gesagt, die homozygot Tg (myl7: GFP) wurden twu34 Zebrafisch 9 mit dem Wil...
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Diskussion
Dieses Protokoll ermöglicht die rasche Anreicherung von Zebrafisch embryonalen Herzgewebe für Genexpressionsanalysen. Die Quantität und Qualität der herzspezifischen RNA-Probe hängt stark von einigen wenigen entscheidenden Schritte: Zunächst wird die Menge der Probe stark verbessert, wenn Verlust der Herzen wird bei jedem Schritt des Protokolls verhindert, da RNA-Reinigung wird nur bei ausreichender arbeiten Ausgangsmaterial. Zweitens ist die Reinheit der Probe, die vollständig auf der Experimentator abhängt, wird durch...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Wir danken C. Burns, C. McRae für die Erläuterung des Grundprinzips dieses Reinigungsprotokolls und F. Priller für die erste Implementierung dieser Methode in unserem Labor. S.A.-S. wird gefördert durch eine Heisenberg-Professur der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG). Diese Arbeit wurde durch die DFG-Förderung SE2016/7-1 gefördert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Geräte für die Aufzucht von Fischen und das Sammeln von Eiern | siehe Zebrafish Book11 für Details | ||
| Fluoreszenz-Stereomikroskop | |||
| Gekühlte Mikrozentrifuge | |||
| UV-Spektralphotometer | z.B. Thermo Scientific Nanodrop 2000 | ||
| Nukleinsäure-Elektrophoresekammer | |||
| Petrischalen 4 cm Ø, beschichtet mit 1% Agarose in E3 Medium | |||
| Mikropipetten und -spitzen (P20, P100, P1000) | |||
| 1,5 ml Zentrifugationsröhrchen | |||
| 15 ml und 50 ml Zentrifugationsröhrchen | |||
| Paar Dumont #5 Pinzetten | |||
| ExactaCruz&Handel; Runde Gel-Ladespitzen im sterilen Rack, 1-200 μm; l | Santa Cruz | sc-201732 | |
| 100 μ m Filter (BD Falcon 100 mm Zellsieb) | BD Biosciences | 352360 | |
| 30 μ m Filter (Vorabscheiderfilter-30 & Mikro; m) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Phasen-Lock-Gel, schwer, 1,5 ml Tuben | Prime | 2302810 | |
| Ei Wasser mittel | 60 μ g/ml Instant-Meersalze aus dem Ozean in ddH2O, 0,00001 % (w/v) Methylenblau | ||
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4 | ||
| Tricain (3-Aminobenzoesäureethylester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | 4 mg/ml Tricain-Stammlösung, pH 7 |
| 1% Agarose (in E3-Medium) | |||
| 1% Agarosegel (in FSME-Puffer) | |||
| Leibovitz´ s L-15 mittel | Gibco | 21083-027 | |
| FBS (Fötales Rinderserum) | Sigma | F4135 | |
| RNAlater | Ambion | AM7020 | |
| Trizol | Ambion | 1559606 | |
| Glykogen | Invitrogen | 10814-010 | 20 µ g/µ l in RNasefreiem Wasser, |
| Chloroform-Isopropanol | |||
| 75% Ethanol (in DEPC-ddH2O) | |||
| Nukleasefreies Wasser oder sterilisiert, DEPC-behandeltes ddH2O | |||
| TBE (Tris/Borat/EDTA)-Puffer für die Elektrophorese |
Referenzen
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