Ermittlung von Protein-Protein-Interaktionsstellen unter Verwendung von Peptid-Arrays

Zusammenfassung

Peptid-Array-Screening ist ein Hochdurchsatz-Assay zur Identifizierung von Protein-Protein-Interaktionsstellen. Dies ermöglicht die Kartierung mehrerer Wechselwirkungen eines Zielproteins und kann als Methode zur Identifizierung von Stellen für Inhibitoren dienen, die auf ein Protein abzielen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zum Screening und zur Analyse von Peptidarrays.

Zusammenfassung

Protein-Protein-Wechselwirkungen vermitteln die meisten Prozesse in lebenden Zellen und die Kontrolle der Homöostase des Organismus. Impaired Protein-Interaktionen können in Krankheit führen, was Protein-Interaktionen wichtige Angriffspunkte für Arzneimittel. Es ist daher sehr wichtig, diese Interaktionen auf molekularer Ebene zu verstehen. Protein-Wechselwirkungen sind mit einer Vielzahl von Techniken, von der zellulären und biochemischen Tests, quantitative biophysikalische Assays untersucht, und diese können mit vollständigen Proteine ​​durchgeführt werden, entweder mit Proteindomänen oder mit Peptiden. Peptide dienen als ausgezeichnete Werkzeuge, um Protein-Wechselwirkungen zu studieren, da Peptide können leicht synthetisiert werden und ermöglichen die Konzentration auf bestimmte Interaktionsstellen. Peptidarrays ermöglichen die Identifizierung der Interaktionsstellen zwischen zwei Proteinen sowie Screening nach Peptiden, die das Zielprotein für therapeutische Zwecke binden. Sie erlauben auch einen hohen Durchsatz SAR-Studien. Zur Identifizierung der Bindungsstellen, eine typical Peptidanordnung enthält in der Regel teilweise überlappenden Peptiden 10-20 Resten der vollen Sequenzen von einem oder mehreren Partnerproteine ​​der gewünschten Zielprotein. Screenen des Arrays zur Bindung des Zielproteins zeigt die Bindungspeptide, die den Bindungsstellen in den Partnerproteine, in einer einfachen und schnellen Verfahren mit nur geringen Menge an Protein.

In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll für das Screening von Peptidarrays für die Abbildung der Interaktionsstellen zwischen einem Zielprotein und seine Partner. Die Peptidanordnung ist auf der Basis der Sequenzen der Partnerproteine ​​unter Berücksichtigung ihrer Sekundärstruktur ausgebildet. Die in diesem Protokoll verwendeten Arrays waren Celluspots Arrays INTAVIS Bioanalytische Instrumente vorbereitet. Das Array wird blockiert, um unspezifische Bindung zu verhindern und anschließend mit dem untersuchten Protein inkubiert. Nachweis unter Verwendung eines Antikörpers offenbart die Bindungspeptide, die den spezifischen Wechselwirkungsstellen zwischen den Proteinen.

Einleitung

Protein-Protein-Wechselwirkungen vermitteln die meisten Prozesse in der lebenden Zelle. Impaired Protein-Interaktionen können in Krankheit führen, was Protein-Interaktionen wichtige Angriffspunkte für Arzneimittel. Es ist daher sehr wichtig, diese Interaktionen auf molekularer Ebene zu verstehen. Protein-Wechselwirkungen sind mit einer Vielzahl von Techniken, von der zellulären und biochemischen Tests, quantitative biophysikalische Assays untersucht, und diese können mit vollständigen Proteine ​​durchgeführt werden, entweder mit Proteindomänen oder mit Peptiden. Peptide dienen als ausgezeichnete Werkzeuge, um Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Dies ist, weil Peptide können leicht synthetisiert werden und ermöglichen die Fokussierung auf einen bestimmten Interaktionsstelle einerseits und auf mehreren Protein-Targets in einem Hochdurch Weise auf der anderen Seite ^1,2. Peptidarray Screening ist eine schnelle, einfache Verfahren zur Gewinnung einer großen Menge von Daten über die Wechselwirkungen eines Zielproteins mit zahlreichen Partnern in einer kurzen Zeit durchzuführen ³. Im Gegensatz zu anderen biochemischen oder biophysikalischen Methoden zur Detektion und Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen, Peptid-Array-Screening erfordert eine sehr geringe Konzentration an Protein und sehr schwache Bindung zu detektieren. Peptid-Arrays können für viele Anwendungen in der Peptid-Protein-Wechselwirkungen, wie Mapping von Protein-Protein oder Rezeptor-Ligand-Interaktionsstellen ^4, Homo- oder Hetero-Oligomerisierung Schnittstellen verwendet werden, kennzeichn Antikörper Epitope ^5, studiert Enzymaktivitäten ⁶ und hohen Durchsatz struktur Aktivitäts-Beziehung (SAR) studiert ^7. Für eine eingehende Bewertung Peptidarray Screening siehe Katz et al. ⁴

Verschiedene Arten von Peptidarrays existieren derzeit. Es gibt zwei Hauptstrategien für die Herstellung von synthetischen Peptidarrays: Synthese der Peptide vor der Befestigung an dem festen Träger oder der Synthese von Peptiden direkt an den festen Träger, vor allem mit Hilfe der SPOT-Technik ^4,8. DiePeptide auf dem festen Träger in der Regel von 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) Chemie ⁸ synthetisiert. Unter den gemeinsamen Syntheseschemata sind Peptid Befestigung durch den N-Terminus (zB JPT Pepstar Arrays ⁹⁾ und Peptid-Anlage durch den C-Terminus (zB PEPSCAN pepchip Arrays ^10, JPT pepspot Arrays ⁹ und INTAVIS celluspot Arrays ^{11) 4.} Der feste Träger kann variieren und damit auch die Chemie der Peptidkupplung zu. Cys-terminierten Peptide können über die Thiolgruppe ¹² auf Glasobjektträgern befestigt werden. Der N-Terminus eines Peptids kovalent an eine Hydroxylgruppe an der Cellulose-Membran, durch Veresterung der Aminosäure gebunden befestigt ^8.

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für das Screening von Peptid-Arrays als ein Verfahren zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen. Das Array verwendeten wir die Celluspots Array, das ein Mikroarray mit großen amo istunt von Flecken (Duplikate bis 384 Spots) auf einer kleinen Cellulosemembran durch einen Glasträger unterstützt. Dies ermöglicht das Arbeiten mit geringen Mengen an Protein und Antikörper und erhalten erhebliche Menge an Daten pro einzigen Experiment. Dieses Array enthält auch eine hohe Dichte, die Peptid-Detektion mit geringer Affinität bindenden ermöglicht. Das Array wurde zur Kartierung des STIL-CHFR Interaktion, die sehr wichtig für die normale Zellproliferation ¹³ Steuerung verwendet wird. Unkontrollierte Wechselwirkung zwischen den beiden Proteinen zur Entwicklung von Krebs. Durch die Abbildung dieser Wechselwirkung fanden wir die spezifische Bindungsstelle und Bindungsreste ^14. Dies ebnet den Weg für die Entwicklung rationeller Inhibitoren, die diese Protein-Protein-Wechselwirkung hemmen.

Protokoll

1. Entwerfen einer Peptidarray

1. Teilen die Sequenz des Zielproteins in teilweise überlappenden Peptiden 10-20 Resten. Variieren Sie die Größe der Überlappung von der spezifischen Experiment und die Ressourcen der Durchführung Labor, aber im Prinzip, je länger die Überlappung, desto besser. Bei der Gestaltung der Peptide Berücksichtigung bekannter Sekundärstrukturelemente in das Protein, das für die Interaktion verantwortlich sein kann dauern.
2. Bestellen Sie die entworfen Peptidarray durch kommerzielle Anbieter. Hierbei kann die Verwendung Peptide kovalent an die Anordnung durch den C-Terminus gebunden ist.

2. Blockieren nicht-spezifischer Bindung

1. Einen 50 mM Tris oder Phosphat-Pufferlösung, enthaltend 0,05% Tween 20 (TBST / PBST) und Anpassung an den gewünschten pH-Wert mit einer abgemessenen Menge von HCl oder NaOH (um die exakte Ionenstärke weiß) und die gewünschte Ionenstärke mit NaCl . Hier verwenden einen pH-Wert von 7,5 und eine Ionenstärke von 150 mM.
2. Machen Sie eine Blockierungslösung von2,5% (w / v) Magermilchpulver in TBST / PBST.
3. Um unspezifische Bindung zu vermeiden, tauchen Sie das Array in 5 ml Blockierungslösung. Inkubieren des Arrays für 2-4 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ºC auf einem Schüttler.

3. Inkubation mit dem Protein

1. Zuerst mit 5 ml Blockierungslösung für 30 Sekunden und dann zweimal mit 5 ml TBST / PBST für 5 min auf einem Schüttler bei Raumtemperatur Waschen des Arrays.
2. Inkubieren der gewaschenen Array mit 5 ml His-tagged Protein-Lösung, die 2,5% (w / v) Magermilchpulver zu verhindern, nicht-spezifische Bindung. Hier verwenden 4,5 & mgr; M-Protein-Lösung (STIL 500-650) in der beschriebenen Blockierungslösung gelöst.
   HINWEIS: In der Regel 5-10 & mgr; M-Protein für das Screening verwendet werden, aber die Proteinkonzentration kann sogar so niedrig wie 2-3 & mgr; M, abhängig von der Bindungsaffinität und die lokalen Konzentrationen der Peptide, die auf dem Array gebunden (Effizienz der Synthese). Der Puffer, in dem das Proteinaufgelöst wird, kann variieren, ist aber üblich, die Protein verdünnt unter Verwendung des gleichen oben beschriebenen Blockierungslösung.
3. Inkubieren der Anordnung in der Proteinlösung für 3-8 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ºC.

4. Inkubation mit dem Antikörper

1. Dreimal mit 5 ml TBST / PBST waschen Array. Die erste Wäsche wird für 30 sec, gefolgt von zwei Wäschen 5 min am Schüttler bei Raumtemperatur.
2. Inkubieren der gewaschenen Array mit 5 ml der verdünnten HRP-konjugiertem Antikörper (1: 1500) in einem Inkubationspuffer, der die gleichen Bestandteile enthält, in den gleichen Konzentrationen als Blockierungslösung für 1 Stunde auf einem Schüttler bei Raumtemperatur. Der Antikörper kann entweder das Zielprotein oder den Tag bindet.
3. Kontrollexperimente durchzuführen Testen der Wechselwirkung des Antikörpers mit Peptiden, die auf der Anordnung, insbesondere dann, wenn das Array Peptide von dem Zielprotein (zB zur Oligomerisierung Studien) durch Wiederholung des gleichen Protokoll ohne step 3, Inkubation mit dem Protein.
4. Dreimal mit 5 ml TBST / PBST waschen Array. Die erste Wäsche wird für 30 sec, gefolgt von zwei Wäschen 5 min am Schüttler bei Raumtemperatur.

5. Lesen Sie den Array

1. Führen Sie Chemilumineszenz Entwicklung mit einer ECL-Western-Blot-Substrat-Kit.
2. Führen Sie die Erkennung mit einem Leucht Bildanalysators.
3. Analysieren Sie die Ergebnisse. Stellen Sie sicher, dass beide Duplikate auf dem Array zeigen die gleichen Signale, so dass die Ergebnisse zuverlässig sind. Wenn die Struktur der Proteinpartner bekannt ist, suchen auf der Struktur um die Bindungspeptide und nach den Bindungsstellen. Auch Peptide, die weit in der Sequenz sind nahe beieinander in der Tertiärstruktur und schaffen eine Bindungsstelle.

Ergebnisse

STIL ist ein sehr wichtiger zentrosomalen Protein. Es steuert die normale Zellteilung und Zellproliferation ^{13,15 - 19.} STIL interagiert mit mehreren Proteinen, ^18,20,21, und die meisten Interaktionen durch seinen zentralen Teil, die ein intrinsisch ungeordneten Bereich (IDR) ¹⁴ auf. Wir haben eine Reihe von Peptiden aus dem STIL Bindungsprotein CHFR abgeleitet sind. CHFR ist ein Tumorsuppressor, der in Reaktion auf Stress induzierten mitotischen ^22. Da die Struktur der Bindun...

Diskussion

Peptidarray-Screening ist ein ausgezeichnetes Werkzeug für die Identifizierung der Bindungsstellen eines Zielproteins in seine Partner. Dieser Test ist schnell und einfach durchzuführen und die Ergebnisse können in einem oder zwei Tagen erhalten werden. Peptidarray Screening ist vielseitig und kann für viele Zwecke verwendet werden. Es kann für die Charakterisierung von Übersetzungs- Modifikationen wie Phosphorylierung und Identifizieren Substrate von Kinasen eingesetzt werden. Zum Beispiel: der FLT3-Kinase, die verwand...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Peptid-Array	INTAVIS Bioanalytical Instruments
His-Sonde Antikörper (H-3) HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-8036 HRP
EZ-ECL Kit	Biologische Industrie	20-500-120
Magermilch	Becton, Dickinson and Company	232100
LAS-3000 Kamera	FUJI-Film