Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Ein Ex-vivo- Modell eines Oligodendrozyten-gerichtete T-Cell Attack in akuten Hirnschnitten

6.6K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/52205

⸱

5. Februar 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, University of Münster, 2Germany and Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Münster, 3Institute of Physiology I - Neuropathophysiology I, University of Münster

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Um die Mechanismen der Demyelinisierung und der neuronalen Apoptose in kortikalen Läsionen von entzündlichen demyelinisierenden Erkrankungen zu untersuchen, werden verschiedene Tiermodelle verwendet. Wir beschreiben hier einen ex vivo Ansatz, bei dem Oligodendrozyten-spezifische CD8+ T-Zellen auf Hirnschnitten verwendet werden, was zum oligodendroglialen und neuronalen Tod führt. Mögliche Anwendungen und Grenzen des Modells werden diskutiert.

Zusammenfassung

Der Tod von Oligodendrozyten, begleitet von der Zerstörung von Neuronen und Axonen, sind typische histopathologische Befunde bei kortikalen und subkortikalen Läsionen der grauen Substanz bei entzündlichen demyelinisierenden Erkrankungen wie Multiple Sklerose (MS). Bei diesen Erkrankungen werden hauptsächlich CD8+ T-Zellen mit mutmaßlicher Spezifität für Myelin- und Oligodendrozyten-verwandte Antigene gefunden, so dass die neuronale Apoptose in Läsionen der grauen Substanz ein Kollateraleffekt dieser Zellen sein kann. Es werden verschiedene Arten von Tiermodellen etabliert, um die zugrundeliegenden Mechanismen der genannten pathophysiologischen Prozesse zu untersuchen. Obwohl sie einige Aspekte der MS nachahmen, ist es unmöglich, den genauen Mechanismus und den zeitlichen Verlauf des "kollateralen" neuronalen Zelltods zu entschlüsseln. Um diesen Kurs zu untersuchen, zeigen wir hier ein Protokoll zur Untersuchung der Mechanismen und der zeitlichen Reaktion neuronaler Schäden nach einem Oligodendrozyten-gerichteten CD8+ T-Zell-Angriff. Um nur auf die Myelinscheide und die Oligodendrozyten abzuzielen, werden in vitro aktivierte Oligodendrozyten-spezifische CD8+ T-Zellen in akut isolierte Hirnschnitte transferiert. Nach einer definierten Inkubationszeit können Myelin- und neuronale Schäden in verschiedenen Regionen von Interesse analysiert werden. Mögliche Anwendungen und Grenzen dieses Modells werden diskutiert.

Einleitung

Der Tod von Oligodendrozyten und die Zerstörung der Myelinscheide, begleitet von Verlust von Neuronen und Axonen, sind typische pathologische Befunde bei Läsionen der grauen Substanz bei Personen, die an Multipler Sklerose (MS) leiden)1,2. Kortikale Läsionen lassen sich bisher in drei verschiedene Subtypen2 unterteilen: subpiale, intrakortikale und leukokarkale Läsionen. Im Vergleich zu Plaques der weißen Substanz zeichnen sich Infiltrate durch eine Dominanz von CD8+ T-Zellen aus, was auf eine möglicherweise entscheidende Rolle bei der Entzündung der grauen Substanz hindeutet3. Darüber hinaus finden sich oligoklonale Expansionen im Blut, in der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) und innerhalb entzündlicher Läsionen für CD8+ T-Zellen selbst4-6.

Dementsprechend wird davon ausgegangen, dass CD8+ T-Zellen spezifisch für verschiedene Myelinproteine sein könnten7,8. In der Tat finden sich CD8+ T-Zellen in der Nähe von Oligodendrozyten und Myelinscheiden9,10, die eine MHC I-Expressionaufweisen 11 und daher für den Verlust der Myelinscheide verantwortlich sein könnten. Dieser Prozess wird oft zusammen mit ausgedehnten "kollateralen" neuronalen und axonalen Schäden in der grauen Substanz des Zentralnervensystems (ZNS) beobachtet1,2. Tatsächlich wird der direkte und indirekte Tod von Oligodendrozyten und Neuronen durch CD8+ T-Zellen über zwei verschiedene Mechanismen induziert: (i) Schwellung und Ruptur der Zellmembran aufgrund der Bildung zytotoxischer Granula nach der Freisetzung von Perforinen und Granzymen und (ii) Ligation zu den Fas-Rezeptoren oder Exposition von FasL auf ihrer Oberfläche8,12,13.

Verschiedene Arten von Tiermodellen werden etabliert, um den zugrundeliegenden Mechanismus der genannten Prozesse zu untersuchen. In dieser Hinsicht können geprimte CD8+ T-Zellen, die spezifisch für Autoantigene mit induzierter Expression in ZNS-Gliazellen sind, wie Oligodendrozyten oder Astrozyten, adoptiv übertragen werden, um anschließend den "kollateralen" neuronalen und axonalen Tod in der grauen Substanz zu analysieren14,15. Die Durchführung solcher in vivo Experimente ist eine große Hilfe, um einige pathophysiologische Aspekte der MS nachzuahmen, jedoch ist dieser Ansatz nicht geeignet, um den zugrunde liegenden Mechanismus und die Kinetik der axonalen Schädigung und der neuronalen Apoptose aufzuklären.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde ein ex vivo-Ansatz entwickelt, um die Mechanismen und den zeitlichen Verlauf des neuronalen Zelltods nach einem Oligondendrozyten-gerichteten CD8+ T-Zell-Angriff zu untersuchen. Da nur die Produktion von Oligodendrozyten und damit die Produktion von Myelinscheiden von Immunzellen angesteuert werden sollte, werden MHC-Klasse-I-beschränkte, Ovalbumin (OVA)-reaktive OT-I-T-Zellen verwendet16. Diese Zellen werden anschließend in Hirnschnitte übertragen, die von Mäusen gewonnen wurden, die selektiv OVA in Oligodendrozyten exprimieren (ODC-OVA-Mäuse)17.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Alle Versuche mit Mäusen sollte in Übereinstimmung mit den Richtlinien der jeweiligen institutionellen Tierpflege und Verwendung Ausschuss durchgeführt werden.

1. Allgemeine Kommentare zu Maus Experimente

  1. Halten Sie die Maus unter pathogenfreien Bedingungen und ihnen Zugang zu Futter und Wasser ad libitum.
    HINWEIS: Es ist wichtig, Alter und Geschlecht abgestimmte Mäuse in Versuchsgruppen zu verwenden, da immunologische Muster können mit Alter und Geschlecht variieren.

2. Herstellung und Aktivierung von OVA-spezifischen CD8 + T-Zellen (OT-I)

  1. Führen Stimulation der OT-I T-Zellen, wie unter 5 Tage vor der Vorbereitung Hirnschnitten beschrieben.
    HINWEIS: 5 × 10 5 aktiviert Effektor CD8 + OT-I T-Zellen (CD8 + T-Zellen von transgenen Mäusen, die Anerkennung nur die OVA 257-264-Peptid im Kontext der MHC-I-Moleküle) pro Schicht benötigt Die Konzentration 5 x 10 5 wurde Experiment gewählteVerbündeter als optimal ein, um eine gute Zell-Zell-Interaktion einmal bevorzugen, dass die Zellen beginnen, in die Scheibe der Migration und, zur gleichen Zeit, ist die Menge der Zellen nicht zu hoch ist, um eine Überreaktion ermöglicht Einzelzellzählung 8,18 induzieren.
  2. Bereiten Sie das Medium zur Kultivierung OT-I T-Zellen. Supplement 500 ml DMEM mit 5% fötalem Kälberserum (FCS), 10 mM HEPES, 2 mM L-Glutamin, 50 uM 2-Mercaptoethanol, 1% nicht-essentielle Aminosäuren und 25 & mgr; g / ml Gentamicin. Lagern Sie das Medium bei 4 ° C bis zur Verwendung.
  3. Entfernen Sie die Milz von OT-I transgenen Mäusen nach Referenz 16. Übertragen Sie sie in die vorbereitete Medium.
  4. Generieren Einzelzellsuspension durch Maischen Milzen durch ein 70 um-Sieb und Zentrifugen Suspension bei 300 xg für 5 min, 4 ° C.
  5. Inkubieren Zellsuspension mit 5 ml Ammoniumchlorid-Kalium (ACK) Puffer (150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3, 0,1 mM EDTA, pH 7,3) für 5 min, um rote Blutkörperchen zu lysieren.
  6. Stoppen incubatiauf 10 ml Medium und zentrifugiert erneut wie oben beschrieben.
  7. Verdünnte Zellsuspension in mittleren und berechnen Zahlen. Platten Zellen in einer Dichte von 3 x 10 7 Zellen / Vertiefung in eine Platte mit 12 Vertiefungen und prime sie durch Inkubation mit OVA 257-264 (SIINFEKL; 1 nM) und Interleukin 2 (IL-2) (500 IU / ml) 5 Tage.
  8. Nach 4 Tagen hinzuzufügen IL-2 in einer Konzentration von 500 IU / ml wieder.
  9. Nach Stimulation reinigen OT-I-T-Zellen aus der Zellsuspension durch die Verwendung eines negativen Selektion basierend Maus CD8 + T-Zellisolations-Kit den Anleitungen des Herstellers. Die Reinigung wird auf die Verringerung von allen nicht-CD8 + -Zellen mit einem Cocktail von Antikörpern gegen CD4, CD11b, CD11c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, MHC Klasse II, Ter-119 und TCRγ basierend / δ welche dann durch Verwendung von Magnetspalten zur Elution der gereinigten CD8 + T-Zellen verworfen werden.
    HINWEIS: Kritische Schritte in diesem procedure werden von den Herstellern angegeben: Es ist wichtig, daß die Reaktion beinhaltet nur einzelne Zellen, weil die Anwesenheit von Klumpen könnten die Spalte während des Elutionsschritts zu blockieren; Zählen der Zellen vor der Zugabe des Byotin Cocktail ist wichtig für den Grad der Reinheit der Probe, und die Prozedur sollte auf Eis durchgeführt, um unspezifische Antikörperbindungen minimieren.

3. Vorbereitung der akuten Hirnschnitten und Co-Kultur mit OT-I T-Zellen

  1. Vor der Herstellung des akuten Hirnschnitten 19, bereiten placedine eiskalter physiologischer Kochsalzlösung mit 200 mM Saccharose, 20 mM PIPES, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 10 mM MgSO 4, 0,5 CaCl 2 und 10 mM Dextrose und künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) durch Verwendung von 125 mM NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 24 mM NaHCO 3, 2 mM MgSO 4, 2 mM CaCl 2, 10 mM Dextrose. Der pH-Wert jeder Lösung auf 7,35 durch using NaOH. Vor Einstellung des pH der ACSF müssen Lösung mit einer Mischung aus 95% O 2 und 5% CO 2 gesprudelt werden.
  2. Vorkühlung des Lösungen.
  3. Anesthetize 8 - 10 Wochen alten Mäusen (zB C57Bl / 6 als Kontrolle oder transgenen ODC-OVA Mäusen 17 mit der Inhalation mit 5,0% Isofluran, 5,0% Halothan oder injizieren 100 mg / kg Ketamin und 10 mg / kg Körpergewicht Xylazin über ip Wait für Anästhesie und verwenden eine Zehe Prise, um das Niveau der Anästhesie zu bewerten und zu enthaupten sie sofort. Euthanize die Mäuse nach institutionellen Tierpflege und verwenden Ausschuss Kriterien für Euthanasie.
  4. Setzen Maus in Bauchlage. Desinfizieren und schneiden Kopfhaut sagittal. Öffnen Sie die Schädelknochen sagittal, entfernen Sie das Gehirn schnell mit Hilfe einer Schaufel und befestigen Sie es auf der Platte eines Vibratom mit Hilfe von Leim.
  5. Füllen Sie den Teller mit der vorbereiteten placedine eiskalter physiologischer Kochsalzlösung.
  6. Cut 300 um koronalen Scheiben mit dem Vibratom.
    Hinweis: Diese Vorgehensweise ist weißn, um lebensfähige intakte Gewebeproben für die funktionelle zelluläre Studien innerhalb eines Zeitintervalls von mindestens 8 h 19 bis 21 entsprechende ergeben. In der Tat, nach dieser Zeit, schon nach 6 Stunden ab der Zubereitung hat ergeben, verminderter Qualität, nämlich Veränderungen in einfachen und funktionalen Eigenschaften wie Aktionspotential Erzeugung und Ausbreitung.
  7. Nach dem Schneiden, übertragen eine Scheibe sofort in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte mit ACSF gefüllt.
  8. Fügen Sie sorgfältig 5 × 10 5 OT-I T-Zellen pro Scheibe.
  9. Scheiben Inkubieren für bis zu 8 h in einem Brutschrank (37 ° C, 5% CO 2).
  10. Nach der Inkubationszeit, Ernte Scheiben schneiden und mit Hilfe OCT-Verbindung Tissue-Tek betten sie und frieren sie in flüssigem Stickstoff. Im Kühlschrank bei -20 ° C für die weitere histologische Untersuchungen zu Beispiel auszuwerten neuronale Struktur (zB unter Verwendung von Anti-MAPII oder Anti-Synaptophysin-Antikörper) oder Apoptose (zB mit Anti-Caspase-3-Antikörpern und Anti-Anti NeuNStellen) nach Standardverfahren.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Nach einer Inkubation von Gehirnschnitten mit Oligodendrozyten gerichtete CD8 + T-Zellen, Oligodendrozyten und Neuronen Apoptose (2A bzw. 1C). Histologische Anzeichen von Apoptose (zB Caspase-3, Tunel) kann frühestens nach 3 h Inkubation nachgewiesen werden. Inkubationszeit sollte, um eine gute Qualität der Vorbereitung und reproduzierbare Ergebnisse garantieren nicht länger als 8 Stunden sein. Apoptotischen Zellen kann auf der ganzen Scheibe mit Übergewicht in markh...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Verschiedene Tiermodelle haben in den letzten Jahrzehnten, die pathologischen Merkmale der entzündlichen demyelinisierenden Erkrankungen wie MS-Adresse beschrieben. In-vivo-Maus- und Rattenmodelle sind weit verbreitet, um pathophysiologische Merkmale der Krankheit nachahmen, nämlich Analyse der Folgen der Demyelinisierung und Remyelinisierung Prozesse und der vermischten Episoden von Entzündungen und Neurodegeneration. Trotzdem nur eine ex vivo Ansatz erlaubt es, die genauen zugrunde liegenden Mechanis...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Interdisziplinäre Zentrum für Klinische Forschung (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB), die Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB TR128, TP B6 bis S.G.M. ME3283/2-1 bis S.G.M.) und durch Innovative Medizinische Forschung, Münster (I-BI111316, SB und SGM).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
12-Well-PlatteCorning3513
2-MercaptoethanolGibco31350-010
2-MethylbutanRoth3927.1
70 µ m SiebFalcon352350
CaCl2Merck1.02382.0500Calciumchlorid
CD8+-IsolationskitMiltenyi Biotech130-090-859
D(+)-GlukoseMerck1.08337.1000
DMEMGibco31966-021warm in 37 > C Wasserbad vor Gebrauch
EDTASigmaE5134
FCSPAA LaboratoriesA15-151fötales Kälberserum
GentamicinGibco15750-060
HEPES 1 MGibco15630-050
IL-2Peprotech212-12
IsofluranAbbott05260-05
KClMerck1.04933.0500Kaliumchlorid
KHCO3SigmaP9144Kaliumhydrogencarbonat
L-GlutaminGibco35050-038
MgSO4Merck1.05886.0500Magnesiumsulfat
NaClSigma31434Natriumchlorid
NaH2PO4 * H2OMerck1.06346.0500Natriumhydrogenphosphat
NaHCO3Merck1.06329.0500Natriumhydrogencarbonat
NaOHMerck1.09137.1000Natriumhydroxid
NH4ClSigma213330Ammoniumchlorid
Nicht-essentielle AminosäureGibco11140-050
OVA (257-264)GenscriptRP10611Ovalbumin
PIPESSigmaP6757
SaccharoseMerck1.07687.1000
Tissue-Tek OCTSakura4583

Referenzen

  1. Moll, N. M., et al. Cortical demyelination in PML and MS: Similarities and differences. Neurology. 70 (5), 336-343 (2008).
  2. Peterson, J. W., Bo, L., Mork, S., Chang, A., Trapp, B. D. Transected neurites, apoptotic neurons, and reduced inflammation in cortical multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 50 (3), 389-400 (2001).
  3. Bo, L., Vedeler, C. A., Nyland, H. I., Trapp, B. D., Mork, S. J. Subpial demyelination in the cerebral cortex of multiple sclerosis patients. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (7), 723-732 (2003).
  4. Babbe, H., et al. Clonal expansions of CD8(+) T cells dominate the T cell infiltrate in active multiple sclerosis lesions as shown by micromanipulation and single cell polymerase chain reaction. J Exp Med. 192 (3), 393-404 (2000).
  5. Junker, A., et al. Multiple sclerosis: T-cell receptor expression in distinct brain regions. Brain. 130 (11), 2789-2799 (2007).
  6. Skulina, C., et al. Multiple sclerosis: brain-infiltrating CD8+ T cells persist as clonal expansions in the cerebrospinal fluid and blood. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (8), 2428-2433 (2004).
  7. Friese, M. A., Fugger, L. Autoreactive CD8+ T cells in multiple sclerosis: a new target for therapy. Brain. 128 (8), 1747-1763 (2005).
  8. Melzer, N., Meuth, S. G., Wiendl, H. CD8+ T cells and neuronal damage: direct and collateral mechanisms of cytotoxicity and impaired electrical excitability). FASEB J. 23 (11), 3659-3673 (2009).
  9. Booss, J., Esiri, M. M., Tourtellotte, W. W., Mason, D. Y. Immunohistological analysis of T lymphocyte subsets in the central nervous system in chronic progressive multiple sclerosis. J Neurol Sci. 62 (1-3), 219-232 (1983).
  10. Hauser, S. L., et al. Immunohistochemical analysis of the cellular infiltrate in multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 19 (6), 578-587 (1986).
  11. Hoftberger, R., et al. Expression of major histocompatibility complex class I molecules on the different cell types in multiple sclerosis lesions. Brain Pathol. 14 (1), 43-50 (2004).
  12. Göbel, K., et al. Collateral neuronal apoptosis in CNS gray matter during an oligodendrocyte-directed CD8(+) T cell attack. Glia. 58, 469-480 (2010).
  13. Melzer, N., et al. Excitotoxic neuronal cell death during an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack in the CNS gray matter. J Neuroinflammation. 10, 121(2013).
  14. Huseby, E. S., et al. A pathogenic role for myelin-specific CD8(+) T cells in a model for multiple sclerosis. J Exp Med. 194 (5), 669-676 (2001).
  15. McPherson, S. W., Heuss, N. D., Roehrich, H., Gregerson, D. S. Bystander killing of neurons by cytotoxic T cells specific for a glial antigen. Glia. 53 (5), 457-466 (2006).
  16. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76 (1), 17-27 (1994).
  17. Cao, Y., et al. Induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in transgenic mice expressing ovalbumin in oligodendrocytes. Eur J Immunol. 36 (1), 207-215 (2006).
  18. Göbel, K., et al. CD4(+) CD25(+) FoxP3(+) regulatory T cells suppress cytotoxicity of CD8(+) effector T cells: implications for their capacity to limit inflammatory central nervous system damage at the parenchymal level. J Neuroinflammation. 9, 41(2012).
  19. Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
  20. Meuth, S. G., et al. Contribution of TWIK-related acid-sensitive K+ channel 1 (TASK1) and TASK3 channels to the control of activity modes in thalamocortical neurons. J Neurosci. 23 (16), 6460-6469 (2003).
  21. Misgeld, U., Frotscher, M. Dependence of the viability of neurons in hippocampal slices on oxygen supply. Brain Res Bull. 8 (1), 95-100 (1982).
  22. Ling, C., Verbny, Y. I., Banks, M. I., Sandor, M., Fabry, Z. In situ activation of antigen-specific CD8+ T cells in the presence of antigen in organotypic brain slices. J Immunol. 180, 8393-8399 (2008).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

Isolierung von CD8 T ZellenVorbereitung von HirnschnittenImmunfluoreszenzmikroskopieApoptose von Oligodendrozytenneuronale ApoptoseT Zell Kokulturhistologische Analyse
Ein Ex-vivo- Modell eines Oligodendrozyten-gerichtete T-Cell Attack in akuten Hirnschnitten
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.