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Neuroscience

FIM Imagerie et FIMtrack: Deux nouveaux outils permettant à haut débit et de l'analyse coûts de locomotion efficace

Published: December 24, 2014 doi: 10.3791/52207
* These authors contributed equally

Summary

FIM est un nouveau système, l'imagerie rentable conçu pour suivre des objets en mouvement petits comme C. elegans, planaria ou larves de drosophile. Le programme de FIMTrack accompagnement est conçu pour fournir une analyse de données rapide et efficace. Ensemble, ces outils permettent une analyse à haut débit de traits comportementaux.

Abstract

L'analyse de la fonction de réseau neuronal nécessite une mesure fiable de traits comportementaux. Etant donné que le comportement des animaux qui se déplacent librement est variable dans une certaine mesure, de nombreux animaux doivent être analysés afin d'obtenir des données statistiquement significatives. Cela nécessite un ordinateur assistée quantification automatique des modes de locomotion. Pour obtenir des images de contraste élevé d'objets en mouvement presque translucides et petites, une nouvelle technique d'imagerie basée sur la réflexion interne totale frustrée appelé FIM a été développé. Dans cette configuration, les animaux ne sont éclairés par la lumière infrarouge à la position très spécifique de contact avec la surface de ramper sous-jacent. Cette méthodologie en résulte des images à contraste très élevé. Par la suite, ces images à contraste élevé sont traitées en utilisant des algorithmes de suivi de contour établies. Sur cette base, nous avons développé le logiciel de FIMTrack, qui sert à extraire un certain nombre de caractéristiques nécessaires pour décrire quantitativement une grande variété de locomotioncaractéristiques. Lors du développement de ce logiciel, nous avons concentré nos efforts sur une architecture open source permettant d'ajouter facilement d'autres modules. Le programme fonctionne indépendant de la plateforme et se accompagne d'une interface graphique intuitive guidant l'utilisateur dans l'analyse des données. Toutes les valeurs de paramètres de locomotion sont données sous forme de fichiers CSV pour leur permettre d'autres analyses des données. En outre, une visionneuse des résultats intégré dans le logiciel de suivi offre la possibilité d'examiner et de régler la sortie, que pourraient être nécessaires lors de l'intégration de relance interactive. La puissance de la FIM et FIMTrack est démontrée par l'étude de la locomotion des larves de drosophile.

Introduction

La plupart des animaux ont la capacité de se déplacer d'une manière très sophistiquée et contrôlée. Pour déchiffrer la base contrôle de la locomotion sous-jacente génétique, il est obligatoire d'évaluer quantitativement différents comportements. A cet égard, la drosophile peut servir comme un modèle idéal. Suivi de voler librement drosophile est alléchant 1-4 mais ramper des larves de drosophile se produit en deux dimensions à une vitesse relativement faible et peut ainsi être contrôlé facilement. Configurations à base de caméras combinés avec un éclairage approprié sont utilisés pour acquérir des images 5. Tant incident ou la lumière transmise est utilisé dans les expériences comportementales 6,7. Cependant, dû à l'organisme semi-translucide de larves et d'éventuelles réflexions de la lumière de la surface ramper enregistrement fidèle des mouvements larvaires peut être difficile. Pour surmonter ces problèmes, certaines méthodes complexes ont été mis au point. Récemment, l'illumination de champ sombre a été introduit pour améliorer l'avant-plan / arrière-plan suiteRast 8. Comme une alternative à l'enregistrement par caméra, l'imagerie optique lentille de moins en image sans capteur sur puce techniques d'acquisition ont été introduites 9-11.

Plusieurs programmes de suivi ont été mis en place récemment, y compris les logiciels disponibles dans le commerce et 12 personnalisés solutions. Exemples de programmes de suivi à haut débit sont les Worm Tracker Multi (MWT) 13 et Multianimal démarche et Track (MAGAT) 8. Tous deux ont en commun, que plusieurs animaux peuvent être suivis en une seule arène en plein champ afin que les animaux entrant en collision conduisent à de nouvelles identités multiples animales. Pour surmonter cette limitation, une configuration multi-puits a été introduit séparant 12 animaux dans des puits individuels 14. La quantification précise de la locomotion des personnes seules peut être réalisé en utilisant une phase mobile de suivi en combinaison avec un microscope 15. Cependant, toutes ces approches sont soit inefficaces coût, le manque re suffisantesolution ou trop de temps pour la haute phénotypage de débit.

FIM Pour surmonter les limitations mentionnées ci-dessus, nous avons développé (méthode d'imagerie basée-FTIR) basée sur Frustré réflexion interne totale (FTIR) 16 (Figure 1). Cette nouvelle approche d'imagerie fournit un contraste élevé sans précédent et permet même l'enregistrement multi-couleur des animaux rampants 16. Le principe de cette méthode pratique et efficace est facile. Une plaque de verre acrylique est inondé de lumière (par exemple, 875 nm infrarouge). En raison de différents indices de réfraction du verre acrylique et de l'air, la lumière est totalement réfléchie à la frontière verre / air. Pas de chauffage du verre acrylique est à noter 16. Seulement si les objets avec un indice de réfraction plus élevé touchent la table inondé de lumière, la lumière peut entrer ces objets. Si les animaux en contact avec la surface, la lumière est réfléchie et peut être saisie par le dessous (figure 1). En conséquence, seul le contactzone des animaux apparaît comme une tache lumineuse, qui permet l'imagerie détaillée avec un fond noir globale. Ainsi, FIM-imagerie permet d'enregistrer des films parfaits pour les algorithmes de vision par ordinateur. L'utilisation simple et robuste de la FIM apporte maintenant une analyse détaillée à haut débit du comportement animal complexe en portée et peut être utilisé pour l'étude de traitement de l'information: par exemple, l'olfaction 8, 16; vision 17 ou 18 thermosensation.

Figure 1
Figure 1. configuration FIM intégration chaleur stimulus et principes physiques sous-jacents. (A) La configuration de la FIM. l'intensité d'éclairage peut être réglée sur le panneau avant. (B) Pour offrir un stimulus de chaleur, un noir peint plaque d'aluminium, perfusé avec de l'eau chaude et froide des deux côtés, est placé 2 mm au-dessus de la surface de la gélose quise est 2 mm d'épaisseur. Le gradient est établie sur la plaque de rayonnement de chaleur et de la gélose par les différences de température (C) Le principe physique de la réflexion interne totale frustrée. Une plaque de verre acrylique est éclairé par une lumière infrarouge. θ 1, θ 2 et θ 3 indiquent les angles de réflexion de la lumière. n A, n 1, n 2 et n 3 représentent les indices de réfraction de l'air, de verre acrylique, de l'agar et la chenille, respectivement, et n satisfait à l'inégalité A <n 1 <n 2 <n 3. En raison de la réfraction, l'angle de réflexion change pendant la transition. Si l'angle est inférieur à l'angle critique, la lumière ne se reflète pas plus, peut passer à travers les couches et peut être capturé par le bas. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Le spectrum des processus qui peuvent être analysés par la FIM est large. Sans d'autres ajustements, l'imagerie FIM peut être utilisé pour surveiller tous les stades larvaires de la drosophile (figure 5B) ou peut être utilisé pour suivre les empreintes de la drosophile adulte 19. De même, les trajectoires de C. elegans ou la circulation des vers plats planaires peuvent être facilement enregistrés (figure 5C). Même l'analyse de la croissance des hyphes ou les cheveux de la racine fongique semble réalisable 19. Dans notre configuration actuelle FIM, 4 x 16 diodes électroluminescentes infrarouges (IR LED) sont intégrés dans un cm 2 plaque 32 x 32 en verre acrylique, appelé le tableau de suivi (Figure 1). L'intensité de la DEL IR est ajustée en fonction du poids des objets sur la table de suivi, ce qui peut être fait facilement par un microcontrôleur relié au circuit par l'intermédiaire de modulation de largeur d'impulsion (PWM). FIM donne des images à contraste très élevé sur une large gamme d'intensités d'éclairage. Surtout, elle gennère excellents résultats à déjà faible irridation infrarouge globale.

Un appareil photo avec un filtre infrarouge est placé sous le tableau de suivi, qui permet l'intégration de stimuli supplémentaires dans la configuration. stimuli thermiques peuvent être facilement appliqués par une plaque de rayonnement de chaleur et des stimuli lumineux sont appliqués par un projecteur LCD. Odorants peuvent également être contenus dans des gradients par des couvercles simples 8. Pour les expériences de gradient de chaleur, la plaque de radiateur de chaleur est perfusé avec de l'eau chaude et froide respectivement sur ​​les deux côtés et placé au-dessus de 2 mm, les larves (figure 1B).

La génération de contraste élevé, des films de haute qualité ouvre la possibilité pour base informatique sophistiqué d'analyse d'image, donc nous avons implémenté le logiciel FIMTrack pour extraire un grand nombre de caractéristiques à partir d'images (Figure 2). Six premières principales caractéristiques ont été définies à partir du contour de l'animal (figure 3A). Ces caractéristiques fournissent la valeur de référencePour de plus amples calcul des six caractéristiques secondaires qui décrivent la forme des animaux et sa position à certains stimuli à un point de temps donné (figure 3B). Actuellement, neuf caractéristiques tertiaires sont calculés qui intègrent les aspects temporels et ainsi caractériser la locomotion de l'animal ainsi que les caractéristiques primaires et secondaires (figure 3C).

Figure 2
Figure 2. aperçu FIMTrack, workflow algorithmique et de la représentation des larves. (A) Comment utiliser FIMTrack. Les images sont chargées. Seuil de valeur de gris et de seuils de taille définissant larves larves unique doivent être réglés. La zone des larves doit être en [min-size, max-size]. Tracking est démarré par le bouton en surbrillance. (B) Suivi workflow. Après le bouton de démarrage est cliqué, l'image de fond est calculated (intensités minimales dans le temps). Tant que il ya des cadres de gauche, les larves sont segmentés en fonction du seuil de gris et la minière et le seuil max-size. Pour tous les segments les représentations larvaires sont calculés (à comparer à (C)). Chaque nouveau modèle est associé à une trajectoire donnée si une piste valide est disponible. Si la dernière image est atteinte, la finalisation de post-traitement est effectué suivie par la génération de sortie. (C) la représentation des larves. L'animal se compose d'une tête et un point de queue (h et t). Entre ces points un nombre impair arbitraire de points de la colonne vertébrale s i peut être réglé avec un rayon r i. En outre, le centre de masse m et le corps principal de pliage d'angle γ est calculé. Plusieurs paramètres de mouvement liées sont esquissés par les lignes pourpres. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


Figure 3. Caractéristiques calculées par FIMTrack. (A) des caractéristiques primaires basé sur le contour des animaux. (B) des caractéristiques secondaires, sur la base de caractéristiques primaires. (C) Les caractéristiques tertiaires, sur la base de caractéristiques primaires de trames consécutives et entrées supplémentaires Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Protocol

REMARQUE: Ici, l'utilisation de la FIM est présenté pour l'analyse pratique à haut débit de locomotion pour le dépistage des larves dans des conditions de libre-mobiles et sous l'influence d'un stimulus de chaleur. D'autres applications telles que l'analyse des stimuli olfactifs de locomotion à charge ou imagerie à haute résolution des comportements de roulement ou d'autres pourraient avoir besoin des changements subtils au protocole, qui sont disponibles sur demande.

1. Mise en place d'expériences

  1. Utilisez environ 100 larves par génotype au total (temps de 1 h requis) pour obtenir des valeurs statistiquement significatives. NOTE: Dans le cas où plusieurs génotypes doivent être comparés et enregistrés à des jours différents, enregistrer le même nombre de larves par génotype par jour.
  2. Pour la plupart des applications, fiche à 10 Hz pour l'analyse des paramètres. Pour des applications d'imagerie à haute résolution, varier la vitesse de formation d'image si nécessaire.
  3. Pour le suivi des larves de troisième stade, mener des expériences environ 120 heures après la ponte. Assurez sure que les cultures donnent assez de larves dans la période expérimentale (voir 4.3).
  4. Pour les applications non-relance, préparer une surface ramper contenant agar translucide (voir section 2). Pour contenir les larves dans la gamme de relance pour l'application de gradient thermique, entourer le champ de vision d'une barrière de gélose sel aversif (voir section 3).
    NOTE: D'autres applications peuvent nécessiter différentes surfaces.
  5. Veillez à utiliser une chambre avec des conditions constantes de l'environnement (température, lumière, débit d'air, humidité de l'air, etc.).

2. Crawling Préparation de la surface (translucide Agar)

NOTE: Dans la configuration FIM une surface agar est ajouté pour fournir une surface de ramper humide. En outre, il améliore également les propriétés d'éclairage.

  1. Faire bouillir l'agar 0,8% de qualité alimentaire dans l'eau ultra-pure déminéralisée. Pour l'application de dépistage de préparer 400 ml.
  2. Verser la gélose à 50 ° C (à chaud à la main) sur une séparée 33 cm x 33 cm acrylic plaque de verre. La tension de surface de la gélose et donc la température définira l'épaisseur de la plaque de gélose. A 50 ° C, des plaques d'agar 2 mm d'épaisseur sont obtenues. Ne pas agiter après ébullition et versez constamment pour éviter les bulles. Préparer dalles agar frais pour chaque période d'imagerie d'environ 4 heures.
  3. Remplir plats 6 cm de Pétri standard et la solution restante de la gélose à 0,8% pour trier, propre et habituer les larves avant l'expérience (1 plat par génotype).
  4. En cas une barrière agar aversif est nécessaire pour l'application, passez à la section 3.
  5. Coupez environ 2 cm du périmètre de la dalle agar pour obtenir une surface carrée de plan pour l'enregistrement. Retirer l'excès agar.
    NOTE: La taille dépend de l'application.
  6. Transférer la dalle agar à la configuration FIM directement après refroidissement en poussant doucement la gélose de glisse sur le bord de la plaque de verre acrylique.

3. Facultatif: Ajout d'un aversif Agar barrière à l'Crawling Surface (Sel Agar)

  1. Faire bouillir la gélose à 2,5% de qualité alimentaire avec 3 M de NaCl dans de l'eau désionisée ultrapure. Pour le criblage dans un gradient thermique préparer 200 ml.
    NOTE: Le volume dépend de l'application.
  2. Coupez un 2 cm de large encoche dans la surface précédemment versé ramper entourant le champ de vision (22 x 22 cm).
    REMARQUE: les formes et les champs de vision barrière différents peuvent être nécessaires en fonction de l'application.
  3. Remplir l'encoche avec l'agar de sel 0,1-0,3 cm plus haut que la surface de suivi de piste.

4. Fly Manipulation

  1. Arrière va à 25 ° C incubateur avec de la lumière de 12 h cycle jour / nuit ajusté au temps de l'expérience sur la nourriture à la mouche standard à 65% d'humidité de l'air.
  2. Pour croix, anesthésier 30 mouches femelles vierges et huit hommes avec le CO 2 et les croiser dans 130 flacons de culture ml avec 35 ml alimentaire.
    REMARQUE: Un 130 ml flacon de culture avec 35 ml alimentaire donnera environ 20-30 lmangé troisième stade larvaire au sein de la durée de l'imagerie de 4 heures. Imagerie et de suivi des travaux pour toutes les étapes de stade larvaire.
  3. Déposer un peu d'eau dans des flacons de culture de conduire troisième stade larvaire mouvement fin et de recueillir le plus grand larves des murs flacon à l'aide d'un petit pinceau.
  4. 2-5 min avant l'enregistrement, les larves de transfert pour une vidéo à une boîte de Petri contenant de la gélose 0,8% de qualité alimentaire dans l'eau ultra pure déminéralisée se habituer et les nettoyer.

5. Réglage de la configuration FIM Imaging pour Recordings (non stimulation Conditions)

  1. Réglez l'appareil photo point de l'objectif et l'ouverture si nécessaire. Réglez le temps d'exposition pour la caméra correspondante.
    REMARQUE: Ces paramètres ne ont pas besoin d'être changé pendant une expérience.
  2. Réglez l'intensité d'éclairage pour obtenir un bon contraste en imagerie une larve.
  3. Gardez les conditions environnementales dans la constante de chambre pendant les enregistrements. Assombrir la pièce pour ne pas perturber les larves avec une lumière directionnelle.

6. Facultatif: Réglage de la configuration FIM Imaging pour Recordings (progressive de la température de stimulation Conditions)

REMARQUE: Le dispositif de gradient thermique est un 3 cm plaque d'aluminium 42 x 42 x 0,2 avec une peinture noir mat et matériau isolant sur ​​le site top. La plaque est perfusé avec de l'eau à partir de deux circuits différents connectés à préparateurs / refroidisseurs et les pompes à deux extrémités (voir la figure 1B). Les températures peuvent être régulées de -5 à 50 ° C.

  1. Allumer le gradient thermique dispositif 1 h avant les expériences et les placer au-dessus de l'installation pour permettre l'établissement du profil de température souhaité et les composants se équilibrer.
  2. Transférer la gélose de surface rampant avec une barrière de sel à la configuration.
  3. Placer la plaque de radiateur sur la gélose et ajuster l'espacement entre la plaque et la surface à crémaillère à 2 mm (~ 1 mm au-dessus larves).
  4. Établir un gradient linéaire deau moins 0,8 ° C / cm à partir de 34 ° C (env. 2 cm de l'obstacle dans le champ de vision) à 18 ° C (env. 2 cm de la barrière opposé à l'emplacement dans le champ de vision) en ajustant la température des circuits d'eau à 1 ° C et 45 ° C.
    REMARQUE: Les différentes propriétés de gradient de la plaque de métal exigent des températures différentes qui doivent être déterminée de manière empirique. Ces paramètres ne ont pas besoin d'être changé au cours des expériences.
  5. Réglez les paramètres comme décrit dans l'article 5.
  6. Laisser la surface rampant se équilibrer dans le gradient avant les expériences pendant 20 min. Tester le gradient de température avec un pyromètre.
  7. Procéder à l'article 8.

7. Imaging FIM (non stimulation Conditions)

  1. Utilisez un petit pinceau humide pour recueillir délicatement 15 larves des boîtes de Pétri d'accoutumance et de les transférer au centre de la surface de suivi. Ne pas transférer alimentaire reste ou tropeau (voir 7.8).
  2. Enregistrez 1-50 larves sur un x 22 cm zone de suivi de 22 cm. Utilisez 15 animaux par vidéo pour la plupart des applications de dépistage (pour des raisons statistiques utilisent au moins 100 personnes par génotype).
  3. Séparez délicatement les larves et attendre environ 10-20 secondes jusqu'à ce que toutes les larves ont commencé à passer directement avant l'enregistrement.
  4. Enregistrez la locomotion des larves pendant 2 min à 10 images par seconde pour des conditions de relance non. Utiliser des images non compressées tif que le format de sortie.
  5. Pendant l'enregistrement, recueillir des larves pour la prochaine vidéo à partir de flacons pour les habituer critique:. Ne pas déranger larves enregistré avec la lumière.
  6. Après l'enregistrement, retirer les larves avec un pinceau large et jetez-les conformément aux règles de sécurité et la législation locale.
  7. Après avoir retiré les larves, utiliser le pinceau pour nettoyer et hydrater la surface de ramper avec de l'eau déminéralisée ultra pur.
  8. Critique: Garder la surface humide en tout temps, mais éviter mo excessiveisture, qui peut être considéré comme des halos ou des gouttes larves dans les enregistrements environnantes et de perturber le suivi.

8. Facultatif: Imagerie FIM (progressive Température relance Conditions)

  1. Après le gradient de température est établie (voir la section 6), préparer le logiciel d'enregistrement pour enregistrement instantané dans les 20 secondes après la mise larves sur la surface de ramper (voir 8.2), par exemple, définir le nombre d'images par vidéo et définir le chemin d'enregistrement.
  2. Soulevez la plaque du radiateur légèrement et placez les larves à 33 ° C à 2 cm de la barrière de sel. Reportez-vous à 6. et 7. Pour de plus amples instructions générales. Abaissez la plaque de radiateur encore et commencer l'enregistrement 3-4 min immédiatement après larves commencé à se déplacer tout droit.
  3. Après l'enregistrement, retirer les larves directement, propre et hydrater la surface. Ne touchez pas la gélose de sel pour éviter la propagation de NaCl.
  4. Critique: Garder la surface humide en tout temps mais il faut éviterhumidité excessive, qui peut être considéré comme des halos ou des gouttes larves dans les enregistrements environnantes et de perturber le suivi.
  5. Laisser la surface de la gélose se équilibrer à nouveau après l'hydratation pendant 1-2 min, tout en économisant images et de recueillir de nouveaux animaux avant de préparer pour la vidéo suivante. Contrôler le gradient de température à l'aide d'un pyromètre tous les cinq vidéos et ajuster dispositif de température si nécessaire (température de l'eau, la hauteur et l'orientation xy par rapport à la surface de suivi).

9. Suivi des larves Locomotion

NOTE: Pour plus de détails, consultez le manuel ci-joint pour FIMTrack (supplément). Pour un diagramme de flux de programme, voir la figure 2.

  1. Réglez les paramètres de suivi pour les expériences respectives en utilisant l'option de prévisualisation.
    1. Ajuster pixel par cm selon la caméra et champ de vision.
    2. Réglez images par seconde en fonction des réglages de l'appareil.
    3. Ajuster les seuils de luminosité de sorte que eà tous les animaux sont détectés correctement (rétroaction est donnée dans l'aperçu).
    4. Ajustez la zone seuils larvaires de taille. Remarque l'option de retour dans l'aperçu: animaux simples sont surlignés en jaune, se heurtant larves sont mis en évidence en rouge et la zone de chaque animal est donnée en bleu.
  2. Commencer le suivi en utilisant le bouton en bas à droite.
    NOTE: Après un suivi avec succès, une image avec pistes larvaires et un fichier CSV contenant la locomotion et de la posture caractéristiques calculées sont stockées dans le répertoire des images.
  3. Utiliser les résultats de la FIM module de visualisation (Modifier> Résultats Viewer ...) d'examiner et de régler manuellement les résultats de suivi. Si nécessaire, définir des régions de relance pour évaluer les données en ce qui concerne le régime de relance par exemple, ramper orientation en ce qui concerne le gradient de chaleur ou de la distance à une source odorante. Pour une description plus détaillée se il vous plaît utiliser le manuel (supplément).

10. Évaluation des données

  1. Importer le fichier CSV dans Excel, Matlab ou tout autre programme pour plus d'analyse statistique.

Representative Results

Pour imager plusieurs caméras différentes avec des propriétés différentes de résolution ont été testés (Figure 4). Toutes les caméras où équipés d'un filtre IR appropriée. Selon la faible résolution de la caméra au prix le plus bas dans ce test, le champ de vision est limité à 10 cm x 10 cm. Les meilleurs résultats ont été obtenus en utilisant un appareil photo de 4 mégapixels (MP). Cela conduit à une résolution de 100 pixels par longueur des larves au troisième stade larvaire et on le laisse reconnaître facilement structures internes. En outre, le péristaltisme de l'animal peut être facilement extraite (figure 4A). Cependant, on peut encore obtenir des films à fort contraste en utilisant des caméras moins chers, qui peuvent également être analysés par FIMTrack. L'utilisation d'un appareil photo 1,4 MP avec une profondeur de 8 bits et une résolution de 1392 x 1040 pixels est d'environ la moitié du prix et permet une résolution de 45 pixels par troisième stade larvaire longueur dans le champ de vision. La tête, mais pas d'autres structures internes peuvent être reconnus (figure 4B). Le suivi et la détection de péristaltisme est possible mais la précision est réduite (figure 4B).

Avec un appareil photo 0,8 MP encore moins cher avec une résolution spatiale comparable à la caméra de 1,4 MP, la tête des larves ne peut être reconnu plus fidèlement (figure 4C). Suivi et analyse de péristaltisme est possible, mais dont plus gigue basée sur le bruit augmenté. Étonnamment, même une webcam basse résolution USB fournit des films de qualité suffisantes pour calculer les trajectoires larvaires (0,3 MP appareil photo, ci-dessous 20 €, figure 4D). Le péristaltisme peut être calculée à partir de la région, mais les mesures sont très bruyant.

Dans notre configuration, nous utilisons systématiquement la caméra 4 MP. Pour le dépistage, cette caméra permet la surveillance d'un 22 cm x 22 cm arène, qui fournit évidemment l'occasion d'analyser un grand nombre d'animaux simultanément de sorte que l'analyse à haut débit est possible. Avec ce paramètre, la longueur des larves is représenté par 40 pixels qui permet toujours l'enregistrement et l'analyse du péristaltisme. Une image exemplaire de 15 trajectoires larvaires dans un gradient thermique est donnée sur la figure 5A. En outre, l'utilisation d'un objectif macro permettant de larves d'image à très haute résolution où de nombreux organes internes deviennent visibles et la reconnaissance de la tête est encore améliorée (figure 5B). De plus ceux-ci peuvent être utilisés en outre pour l'analyse plus détaillée des comportements d'un large éventail 20. La même configuration peut être facilement utilisé à l'image ramper C. vers elegans (Figure 5c).

Figure 4
Figure 4. imagerie et de suivi des résultats de la FIM pour différentes caméras. (A) Gauche: imagerie FIM de trois larves rampant sur ​​une étape de suivi de 10 cm x 10 cm capturées à l'aide d'une caméra 4 MP avec 10 fps. Mi:Clipping et le centre de la trajectoire de masse d'une seule larve. La zone de l'animal est indiquée. Droit: Espace de la larve tracée plus de 100 cadres. La flèche rouge indique le point de l'image coupée de temps. (B) l'équivalent de (A), mais capturée à l'aide d'un appareil photo 1,4 MP. (C) l'équivalent de (A), mais capturée à l'aide d'un appareil photo de 0,8 MP. (D) équivalent à ( A), mais capturée à l'aide d'un appareil photo 0,3 MP. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. relance de chaleur, et de haute résolution applications. (A) l'application de relance de chaleur (comparer à la figure 1). Trajectoires calculées par FIMtrack. (B) de l'image d'application à haute résolution d'une troisième, deuxième et premier stade larvaire à l'aide d'un objectif macro. La longueur des larves de troisième stade est représenté par 400 pixels dans un champ de vision de 2,5 x 2,5 cm. (C) A C capturé elegans ver utilisant l'imagerie FIM. Barres d'échelle sont indiquées. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

En neurosciences comportementales, il est obligatoire de déchiffrer quantitativement traits comportementaux complexes. Procédures Ainsi, un grand nombre de personnes doivent être observées à haute résolution et automatisés sont nécessaires pour l'analyse statistique. Ici, l'imagerie FIM est décrit, un roman, une configuration simple et robuste imagerie, qui fournit les moyens de contrôler la locomotion d'un large éventail d'animaux. L'efficacité de l'installation d'imagerie FIM a été testé en utilisant la drosophile larves, des vers plats planaires et C. vers elegans. La technologie FIM fournit intrinsèquement un contraste élevé pour détecter même des structures internes des animaux, tels que le cerveau, la trachée, l'intestin ou le proventricule. Fait important, ces structures internes sont solidement identifiés de telle sorte qu'ils peuvent servir à identifier automatiquement l'orientation de l'animal 19.

La qualité des films peut être influencée par quantité excessive d'eau sur la surface de ramper. Ainsi, il est essentiel decontrôler l'humidité de l'agar. Agar ou l'eau trop trop vieux à la surface peut provoquer des artefacts. De même, veiller à ce que les bulles d'air sont inclus dans la surface de ramper. En général, une surface agar bien préparé permet l'enregistrement de films pendant 4 heures.

En raison des principes physiques sous-jacents imagerie FIM génère près de bruit enregistrements d'images libres, résultant dans une superbe qualité d'image. Cela facilite à son tour subséquent analyse d'image assistée par ordinateur et permet un débit élevé. Toutefois, la méthode est limitée à l'analyse des animaux qui entrent en contact directement la surface de la gélose. Le logiciel de suivi est contestée par les animaux formant une forme de beignet. Bien qu'un indicateur binaire reconnaît la forme de beignet, une mauvaise colonne vertébrale peut être calculée.

Grâce à la construction modulaire de la table de suivi double et triple imagerie couleur est à portée de main. En outre, des stimuli additionnels (lumière, odorisants, les stimuli électriques ou mécaniques) peuvent être facilement delivered de dessus. Le programme FIMTrack conçu pour correspondre à la puissance de l'imagerie FIM peut être facilement adopté pour suivre la drosophile larves, C. elegans ou planaires. Ainsi et en raison de sa construction simple et pas cher (voir http://FIM.uni-muenster.de), imagerie FIM est possible pour un large éventail d'applications biomédicales et permet en particulier urgent études à haut débit.

Disclosures

Les auteurs ne ont rien à divulguer

Acknowledgments

Nous sommes reconnaissants à S. Thomas, qui a initié ce projet, J. Hermann et U. Burgbacher de l'aide dans la construction de l'installation de la FIM. Ce travail a été financé par la DFG (SFB 629 B6).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FIM setup Custom  details for construction or purchase of setups is available upon request
Acrylic glass plate Custom  Additional for agar pouring
Heat radiator plate Custom  Aluminum plate (paintet in matt black) perfusable on opposing sites with adjustable mounting
Water calorifier/cooling pumps and hoses Custom  based on GE healthcare MultiTempIII (No.: 18-1102-78) and Dr Bruno Lange GmBH (Typ: LTG013)
Standard Camera (4 MP) Basler acA2040-25gm Camera defaultly used for the FIM setup
Test Camera (1.4 MP) QImaging  1394 firewire (01- QIC-F-M-12 MONO) Camera used for comparison
Test Camera (0.8 MP) Point Grey Dragonfly 2 (DR2-13S2M/C-CS) Camera used for comparison
Test Camera (0.3 MP) Sony PS Eye USB2.0 camera Camera used for comparison
Computer Custom  equipped with at least i5 Intel processor or better, 16 GB RAM and sufficient HDD storage space [>1TB]
Standard Fly food Custom 
Standard Fly vials 135 ml Sarstedt AG&Co, Nümbrecht, Germany 78,895
Petri dishes 9 cm Sarstedt AG&Co, Nümbrecht, Germany 821,473
Ultrapure deionized water Merck Millipore, Darmstadt, Germany Synergy 
NaCl Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany 3957.2
Food grade agar AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany A0917,5000
Paintbrush (small and large) Milan Aquarell 310 Size 0 and 2
Pyrometer Trotec BP20

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Neuroscience Numéro 94 la drosophile, L'analyse de la locomotion méthode d'imagerie basé FTIR logiciel de suivi le comportement animal à haut débit Frustré réflexion interne totale (FTIR) (FIM) Neuroscience
FIM Imagerie et FIMtrack: Deux nouveaux outils permettant à haut débit et de l&#39;analyse coûts de locomotion efficace
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Risse, B., Otto, N., Berh, D., Jiang, X., Klämbt, C. FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis. J. Vis. Exp. (94), e52207, doi:10.3791/52207 (2014).

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