FIM er en roman, kostnadseffektiv bildesystem utviklet for å spore små objekter som beveger seg som C. elegans, planaria eller Drosophila larver. Den medfølgende FIMTrack Programmet er utviklet for å gi rask og effektiv dataanalyse. Sammen utgjør disse verktøyene lar high-throughput analyse av atferdsmessige trekk.
Analysen av nevronale nettverk funksjonen krever en pålitelig måling av atferdsmessige trekk. Siden virkemåten til fritt bevegelige dyr er variabel i en viss grad, mange dyr har til å bli analysert, for å oppnå statistisk signifikante data. Dette igjen krever en datamaskin assistert automatisert kvantifisering av locomotion mønstre. For å få bilder av nesten gjennomsiktige og små objekter som beveger seg med høy kontrast, ble en ny avbildningsteknikk basert på frustrert total intern refleksjon kalt FIM utviklet. I dette oppsettet er dyr bare opplyst med infrarødt lys på helt spesifikke posisjon av kontakt med den underliggende kryp overflaten. Denne metodikken gir bilder med svært høy kontrast. Deretter er disse bilder med høy kontrast behandlet ved hjelp av etablerte kontur sporing algoritmer. Basert på dette har vi utviklet FIMTrack programvare, som tjener til å trekke ut en rekke funksjoner som trengs for å kvantitativt beskrive et stort utvalg av bevegelsekjennetegn. Under utviklingen av denne programvarepakken, fokuserte vi vår innsats på en åpen kildekode arkitektur slik at den lett tillegg av ytterligere moduler. Programmet opererer plattformuavhengig og er ledsaget av et intuitivt GUI guiding brukeren gjennom dataanalyse. Alle locomotion parameterverdier er gitt i form av csv-filer slik at ytterligere dataanalyser. I tillegg er en Resultater Viewer integrert i sporing programvare gir mulighet til å interaktivt gjennomgå og justere produksjonen, som kan være nødvendig i løpet av stimulus integrering. Kraften til FIM og FIMTrack er demonstrert ved å studere bevegelse av Drosophila larver.
De fleste dyr har mulighet til å bevege seg i en svært sofistikerte og kontrollert måte. Å tyde den genetiske basis liggende locomotion kontroll er det obligatorisk å kvantitativt vurdere ulike atferdsmønstre. I dette henseende, kan Drosophila tjene som en ideell modell. Sporing av fritt flygende Drosophila er frist 1-4, men gjennomsøking av Drosophila larver skjer i to dimensjoner ved relativt lav hastighet, og kan således lett overvåkes. Kamerabaserte oppsett kombinert med riktig belysning brukes til å hente bilder 5. Både hendelsen eller overføres lys er ansatt i atferdseksperimenter 6,7. Imidlertid, på grunn av den delvis gjennomsiktige legeme av larvene og mulige lysrefleksjoner av kryp overflaten trofast opptak av larve bevegelser kan være utfordrende. For å overvinne slike problemer, har noen kompliserte metoder blitt utviklet. Nylig ble mørkt felt belysning innført for å styrke forgrunn / bakgrunn contrast 8. Som et alternativ til kamerabasert opptak, linse mindre optisk avbildning og bildesensoren-mindre on-chip oppkjøps teknikker har blitt introdusert 9-11.
Flere sporing programmer har blitt introdusert nylig, inkludert kommersielt tilgjengelige programvare 12 og tilpassede løsninger. Eksempler på high-throughput sporing programmer er Multi Worm Tracker (MWT) 13 og Multianimal ganglag og Track (Magat) 8. Begge har til felles, at flere dyr kan spores i en enkelt åpen-feltet arenaen slik at kolliderende dyr føre til flere nye dyre identiteter. For å overvinne denne begrensningen, ble en fler godt oppsett introdusert skille 12 dyr i individuelle brønner 14. Nøyaktig kvantifisering av bevegelse av enkeltpersoner kan oppnås ved hjelp av en bevegelig sporingstrinn i kombinasjon med et mikroskop 15. Men alle disse tilnærmingene er enten kostnads ineffektiv, mangel tilstrekkelig reoppløsning eller for tidkrevende for høy gjennomstrømning fenotyping.
For å overvinne de ovennevnte begrensninger, har vi utviklet FIM (FTIR Basert avbildningsmetode) basert på frustrert total indre refleksjon (FTIR) 16 (figur 1). Denne nye bilde tilnærmingen gir en enestående høy kontrast og selv tillater multi-farge opptak av krypende dyr 16. Den underliggende prinsippet om denne hendige og effektive metoden er enkel. En akryl glass plate er oversvømmet med lys (f.eks 875 nm infrarød). På grunn av forskjellige brytningsindekser for akryl glass og luft, blir lyset helt reflekteres i glass / luft grensen. Ingen oppvarming av akrylglass er angitt 16. Bare hvis objekter med en høyere brytningsindeks berører bordet flombelyste, kan lyse inn disse stedene. Hvis dyrene berøre overflaten, reflekteres lyset og kan fanges nedenfra (figur 1). Som følge herav kun kontaktOmrådet av dyrene vises som et lyspunkt, som tillater detaljert avbildning med en samlet sort bakgrunn. Dermed kan FIM-imaging å registrere perfekte filmer for computer vision algoritmer. Den enkle og robuste bruk av FIM bringer nå detaljert høy gjennomstrømning analyse av komplekse dyrs atferd i rekkevidde og kan brukes til å studere informasjonsbehandling: for eksempel, luktesans 8, 16; visjon 17 eller thermosensation 18.
Figur 1. FIM oppsett med varme stimulans integrering og underliggende fysiske prinsipper. (A) FIM oppsett. Belysningsintensiteten kan reguleres på frontpanelet. (B) for å levere en varme stimulus, en svart malt aluminiumplate, perfusert med varmt og kaldt vann på begge sider, er plassert 2 mm over agaroverflaten hvilkei seg selv er 2 mm tykt. Gradienten er etablert på varmestråleren platen og agar ved temperaturforskjellene (C) Den fysiske prinsipp forstyrret total innvendig refleksjon. En akrylglassplate belyses med infrarødt lys. θ 1, θ 2, og θ 3 angir de lette refleksjonsvinkler. n A, n 1, n 2 og n tre betegne brytningsindeksene for luft, akrylglass, agar og larven henholdsvis og oppfylle ulikheten n A <n 1 <n 2 <n tre. På grunn av refraksjon, endrer refleksjonsvinkel under overgangen. Hvis vinkelen er under den kritiske vinkelen, er lys ikke reflekteres lenger, kan passere gjennom lagene og kan fanges nedenfra. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Spectrum av prosesser som kan bli analysert ved FIM er bred. Uten ytterligere justeringer, kan FIM bildebehandling brukes til å overvåke alle larvestadier av Drosophila (Figur 5B) eller kan brukes til å følge foten-utskrifter av voksen Drosophila 19. Likeledes er de baner av C. elegans eller bevegelsen av planarian Flatormer kan lett registreres (figur 5C). Selv analyse av sopp hypha eller rot hårvekst vises bart 19. I vår nåværende FIM oppsett, er 4 x 16 infrarøde lysdioder (IR- LED) integrert i en 32 x 32 cm 2 akrylglass plate, kalt sporings tabellen (figur 1). Intensiteten av IR-lysdiodene justeres avhengig av vekten av de gjenstander på relativ bordet, noe som lett kan utføres av en mikrokontroller som er koblet til kretsen via pulsbreddemodulasjon (PWM). FIM gir bilder med svært høy kontrast over et bredt spekter av belysning intensiteter. Viktigst, det generates gode resultater på allerede lave generelle infrarød irridation.
Et kamera med infrarødt filter er plassert under sporings bordet, som gjør integrering av ytterligere stimuli inn i oppsettet. Varme stimuli enkelt kan brukes av en varme radiator plate og lys stimuli er brukt av en LCD-projektor. Også odoranter kan ligge i gradienter ved enkle lokk 8. For varme gradient eksperimenter er varmeradiatorplaten perfusert med varmt og kaldt vann på begge sider henholdsvis 2 mm og plassert ovenfor larvene (figur 1B).
Generering av høy kontrast, høy kvalitet filmer åpner muligheten for avansert databasert bildeanalyse, og dermed vi implementert FIMTrack programvare for å trekke et stort sett med funksjoner fra bilder (figur 2). Første seks primære funksjoner ble definert fra konturen av dyr (figur 3A). Disse funksjonene gir grunnlinjenfor ytterligere beregning av seks sekundære funksjoner som beskriver dyrene form og sin posisjon på visse stimuli ved et gitt tidspunkt (figur 3B). For tiden er ni tertiære funksjoner beregnet som integrerer tidsmessige aspekter og derved karakterisere bevegelse av dyret sammen med den primære og sekundære funksjoner (figur 3C).
Figur 2. FIMTrack oversikt, algoritmisk arbeidsflyt og larve representasjon. (A) Hvordan bruke FIMTrack. Bildene er lastet. Grå verdi terskel og larve størrelse terskler definerer enkelt larver må innstilles. Larve området må være i [min-størrelse, maks-størrelse]. Sporing er startet av den merkede knappen. Arbeidsflyt (B) Tracking. Etter starten knappen klikkes, er bakgrunnsbildet calculated (minimal intensitet over tid). Så lenge det er rammer til venstre, blir larvene segmentert basert på det grå terskelen og min- og max-størrelse terskel. For alle segmentations larve representasjoner beregnes (sammenlignet med (C)). Hver nye modellen som er knyttet til en gitt bane om en gyldig spor er tilgjengelig. Hvis den siste rammen er nådd, er å sluttføre etterbehandling ferdig etterfulgt av utgangs generasjon. (C) Larve representasjon. Dyret består av et hode og en hale punkt (h og t). Mellom disse punktene et vilkårlig ulikt antall ryggraden poeng s jeg kan stilles inn med en radius r i. I tillegg er midten av masse m og hovedlegemet bøying vinkel γ beregnet. Flere bevegelsesrelaterte parametere er skissert av lilla linjer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
I atferdsnevrovitenskap er det obligatorisk å kvantitativt tyde komplekse atferdsmessige trekk. Således må et stort antall individer observeres ved høy oppløsning og automatiserte prosedyrer er nødvendig for statistisk analyse. Her blir FIM avbildning beskrevet en ny, enkel og robust bildeoppsettet, noe som gir mulighet for å overvåke bevegelse av et bredt spekter av dyr. Effekten av FIM bildeoppsettet ble testet ved hjelp av Drosophila larver, planarian flatormer og C. elegans ormer. FIM teknologien gir iboende høy kontrast for å påvise selv interne strukturer av dyrene, slik som hjerne, luftrøret, tarmene, eller proventriculus. Viktigere er disse interne strukturer identifisert robust, slik at de kan tjene til automatisk å identifisere retningen av dyret 19.
Kvaliteten på filmene kan bli påvirket av overdreven bruk av vann på gjennomgangen overflaten. Således, er det avgjørende åstyre fuktigheten i agar. For gammel agar eller for mye vann på overflaten kan føre gjenstander. Likeledes, sikre at ingen luftbobler er inkludert i gjennomgangen overflaten. Generelt, gjør at en godt forberedt agaroverflaten opptak av filmer i 4 timer.
På grunn av de underliggende fysiske prinsipper FIM bildebehandling genererer nesten støy gratis billedopptak, noe som resulterer i en overlegen bildekvalitet. Dette i sin tur letter etterfølgende datamaskin-basert bildeanalyse og muliggjør høy gjennomstrømning. Imidlertid er den metoden som er begrenset til å analysere dyr som har direkte kontakt med agaroverflaten. Sporingsprogramvare utfordres av dyr som danner en smultring form. Selv om en binær indikator gjenkjenner smultring form, kanskje en feil ryggrad beregnes.
På grunn av den modulære konstruksjonen av sporings tabellen dobbel og trippel farge imaging er i nå. Videre kan flere stimuli (lys, dufter, elektrisk eller mekanisk stimuli) lett bli delivered ovenfra. Den FIMTrack program utviklet for å matche kraften i FIM bildebehandling kan lett vedtatt å spore Drosophila larver, C. elegans eller planarians. Derfor og på grunn av sin enkle og billige konstruksjon (se http://FIM.uni-muenster.de), er FIM avbildning mulig for et bredt spekter av biomedisinske anvendelser, og spesielt gjør det mulig sterkt behov for store gjennomgangs studier.
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige for S. Thomas som har tatt initiativ til dette prosjektet, J. Hermann og U. Burgbacher for hjelp i byggingen av FIM oppsett. Dette arbeidet ble finansiert av DFG (SFB 629 B6).
Name of the Material/Equipment | Source | Catalog Number | Comments |
FIM setup | Custom | details for construction or purchase of setups is available upon request | |
Acrylic glass plate | Custom | Additional for agar pouring | |
Heat radiator plate | Custom | Aluminum plate (paintet in matt black) perfusable on opposing sites with adjustable mounting | |
Water calorifier/cooling pumps and hoses | Custom | based on GE healthcare MultiTempIII (No.: 18-1102-78) and Dr Bruno Lange GmBH (Typ: LTG013) | |
Standard Camera (4 MP) | Basler | acA2040-25gm | Camera defaultly used for the FIM setup |
Test Camera (1.4 MP) | QImaging | 1394 firewire (01- QIC-F-M-12 MONO) | Camera used for comparison |
Test Camera (0.8 MP) | Point Grey | Dragonfly 2 (DR2-13S2M/C-CS) | Camera used for comparison |
Test Camera (0.3 MP) | Sony | PS Eye USB2.0 camera | Camera used for comparison |
Computer | Custom | equipped with at least i5 Intel processor or better, 16 GB RAM and sufficient HDD storage space [>1TB] | |
Standard Fly food | Custom | ||
Standard Fly vials 135 ml | Sarstedt AG&Co, Nümbrecht, Germany | 78,895 | |
Petri dishes 9cm | Sarstedt AG&Co, Nümbrecht, Germany | 821,473 | |
Ultrapure deionized water | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | Synergy | |
NaCl | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 3957.2 | |
Food grade agar | AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany | A0917,5000 | |
Paintbrush (small and large) | Milan | Aquarell 310 Size 0 and 2 | |
Pyrometer | Trotec | BP20 |