Dieses Video beschreibt das Sezieren, die Gewebeverarbeitung, das Schneiden und die fluoreszenzbasierte TUNEL-Markierung von Maus-Skelettmuskeln. Es wird auch ein Verfahren zur halbautomatischen Analyse der TUNEL-Markierung beschrieben.
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Methodenartikel
Erkennung und Analyse von DNA-Schädigungen in Maus-Skelettmuskel In-situ- Verwenden der TUNEL-Methode
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Endständige Desoxynukleotidyltransferase (TdT) Desoxyuridintriphosphat (dUTP) Nick-End-Markierung (TUNEL) ist die Methode, das TdT-Enzym zu verwenden, um eine markierte Form von dUTP kovalent an 3'-Enden von doppel- und einzelsträngigen DNA-Brüchen in Zellen zu binden. Es ist eine zuverlässige und nützliche Methode, um DNA-Schäden und Zelltod in situ nachzuweisen. Dieses Video beschreibt die Dissektion, Gewebeverarbeitung, Schnittbestimmung und fluoreszenzbasierte TUNEL-Markierung von Maus-Skelettmuskeln. Es wird auch eine Methode zur halbautomatischen Quantifizierung von TUNEL-Signalen beschrieben. Inhärente normale Gewebemerkmale und Gewebeverarbeitungsbedingungen beeinflussen die Fähigkeit des TdT-Enzyms, DNA effizient zu markieren. Bei der Gewebeverarbeitung kann es auch zu unerwünschter Autofluoreszenz kommen, die die TUNEL-Signalerkennung beeinträchtigt. Daher ist es wichtig, die Gewebeverarbeitungs- und TUNEL-Markierungsmethoden empirisch zu bestimmen, die das optimale Signal-Rausch-Verhältnis für die anschließende Quantifizierung liefern. Der hier beschriebene fluoreszenzbasierte Assay bietet eine Möglichkeit, das Autofluoreszenzsignal durch digitale Kanalsubtraktion auszuschließen. Der TUNEL-Assay, der mit geeigneten Gewebeverarbeitungstechniken und -kontrollen verwendet wird, ist eine relativ schnelle, reproduzierbare, quantitative Methode zum Nachweis von Apoptose im Gewebe. Es kann verwendet werden, um DNA-Schäden und Apoptose als pathologische Mechanismen zu bestätigen, betroffene Zelltypen zu identifizieren und die Wirksamkeit therapeutischer Behandlungen in vivo zu beurteilen.
Einleitung
Desoxyribonukleotidyltransferase (TdT) dUTP nick end labeling (TUNEL) ist der Prozess, mit dem TdT-Enzym zu dUTP bis 3 befestigen-Enden von Doppel- und Einzelstrang-DNA bricht 12,23. Die TUNEL-Methode zur Detektion von Apoptose und DNA-Schädigung wurde zuerst vor mehr als 20 Jahren von Gavrieli et al. 1,12,24 gemeldet. Es ist seit bewertet worden und in verschiedenen Gewebepräparaten 7,23,27,40 optimiert. TUNEL verwendet wurde, um Ischämie-induziertem Zelltod von Neuronen 6,14,29 und Kardiomyozyten 43,44, exzitotoxischen neuronalen Zelltod 30,31 studieren und als Biomarker in Arthritisbehandlu....
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Protokoll
HINWEIS: Alle in diesem Protokoll beschriebenen Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen in der Bedienungsanleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health 26 durchgeführt. Das Protokoll (MO13M391) wurde von der Johns Hopkins University Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.
1. neonatale Maus Opfer, Dissection, und Fixierung
- Opfere eine neonatale Maus durch CO 2 Inhalation.
- Unmittelbar vor der Hinterlauf oberhalb des Knies geschnitten. Bis etwa postnatalen Tag 7, sind die Beinknochen weich genug über mit großen L....
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Ergebnisse
Mit erfolgreichen Färbung sollte TUNEL-positiven Signal hell genug, um von Autofluoreszenz, indem Intensitätsschwellen zu isolieren. TUNEL-positive Objekte bei geringer Vergrößerung als helle unregelmäßige Fragmente im Skelettmuskel (1A) angezeigt. Jedoch bei höherer Vergrößerung einige TUNEL-positive Objekte mit dem klassischen apoptotische Morphologie zu beachten, wenn der Zelltod-Typ beteiligt ist, Apoptose (Figur 1B). Die positive Kontrolle (DNase zugegeben) sollte reichlich TUNEL-p.......
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Diskussion
Verfahren zum Nachweis und zur quantitativen Analyse von DNA-Schäden assoziierten Apoptose in Skelettmuskel der Maus beschrieben. Das Verfahren beinhaltet Gewebeernte, TUNEL-Färbung, digitale Bildaufnahme und Bildanalyse. Gemeinsame histologische Lieferungen und Werkzeuge benötigt werden, und eine spezielle Handels TUNEL-Kit erforderlich. Die wesentlichen große Ausrüstungsteile nötig sind, einen Kryostat, Epifluoreszenz-Mikroskop mit digitaler Bildfähigkeit und ein Computersystem zur Bildanalyse.
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch den NIH-NINDS-Zuschuss RO1-NS065895 und den NIH-NINDS-Zuschuss 5-F31-NS076250-02 unterstützt.
Wir danken der JHU SOM Microscope Facility für die Verwendung des Kryostaten.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 4 % Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung | Elektronenmikroskopie | Wissenschaften 19202 | Für die hier beschriebenen Verfahren wurde eine 4%ige Lösung frisch aus Pulver hergestellt. Paraformaldehyd von jedem Lieferanten kann verwendet werden. Die vorbereitete Formaldehydlösung sollte bei 4 μg gelagert werden; C und sollte nach dem Verfallsdatum (bis zu mehreren Monaten) nicht mehr verwendet werden. Paraformaldehyd ist ein Karzinogen und ein Toxin durch Einatmen und Hautkontakt. Bitte befolgen Sie beim Umgang mit Paraformaldehyd die im Sicherheitsdatenblatt angegebenen Vorsichtsmaßnahmen. |
| Saccharose | Sigma | S0389 | Wird zum Kryoschutz von Gewebe vor dem Einfrieren verwendet. Saccharose von jedem Lieferanten kann verwendet werden. |
| O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | Einbettmedium für Kryosektionen. |
| Kryostat | Leica | CM 3050S | Für die hier beschriebenen Präparationen wurde ein Leica CM3050S Kryostat verwendet. Jeder Kryostat, der in der Lage ist, 10 μm zu schneiden. Es können m-Sektionen verwendet werden. |
| Objektträger, 25 x 75 x 1 mm | Fisher | 12-552-3 | Objektträger können von jedem Anbieter verwendet werden. |
| Gelatine | Sigma | G-9391 | Gelatine wird verwendet, um die Haftung von Gewebeschnitten auf Objektträgern zu fördern. Um Objektträger mit Gelatine zu beschichten, lösen Sie 2,75 g Gelatine und 0,275 g Chromalaun in 500 ml destilliertem Wasser auf, erwärmen Sie es auf 60 °; C, die Objektträger einige Sekunden lang eintauchen und trocknen lassen. Es kann Gelatine von jedem Lieferanten verwendet werden. Alternativ können gelatinevorbeschichtete Objektträger erworben werden. |
| Chrom(III)-Kaliumsulfat-Dodecahydrat (Chromalaun) | Sigma | 243361 | Chromalaun wird der Gelatinelösung zugesetzt, um die Gewebehaftung auf Objektträgern zu fördern. Es ist ein mögliches Karzinogen und ein Toxin durch Einatmen und Hautkontakt. Bitte befolgen Sie die im Sicherheitsdatenblatt angegebenen Vorsichtsmaßnahmen beim Umgang mit Chromalaun. |
| Vectabond Gewebehaftungsreagenz | Vector Labs | SP-1800 | Optionales Substrat für eine bessere Gewebehaftung auf Objektträgern; stattdessen können gelatinebeschichtete Objektträger verwendet werden. |
| Tween20 | Sigma | P9416 | Ein Reinigungsmittel zur Permeabilisierung von Gewebe. Tween20 von jedem Anbieter kann verwendet werden. |
| Triton X100 | Sigma | T8787 | Ein Waschmittel zur Permeabilisierung von Gewebe. Triton X100 von jedem Hersteller kann verwendet werden. |
| TACS 2 TdT Fluorescein in situ Apoptose-Detektionskit | Trevigen | 4812-30-K | Kommerzielles Kit für die fluoreszenzbasierte TUNEL-Markierung. |
| DNase/Nuklease | Trevigen | 4812-30-K | (im Kit enthalten) |
| DNase/Nuklease-Puffer | Trevigen | 4812-30-K | (im Kit enthalten) |
| 10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4 | Amresco | 780 | Make 1x PBS für Waschungen und Verdünnungen. PBS von jedem Lieferanten kann verwendet werden. |
| DNasefreies Wasser | Qualität Biologicals | 351-029-131 | Es kann Wasser von jedem Lieferanten verwendet werden. |
| Hoechst 33258 | Sigma | 94403 | Kernfarbstoff. Es kann jeder blau fluoreszierende Kernfarbstoff verwendet werden. Als DNA-bindender Farbstoff steht Hoechst im Verdacht, krebserregend zu sein, und sollte mit Schutzausrüstung angefasst werden, um den Hautkontakt zu minimieren. |
| Parafilm M | mehrfach | 807 | Jede andere hydrophobe Folie oder Deckfolie kann verwendet werden. Erhältlich von mehreren Lieferanten. |
| Fluoreszenzmikroskop mit Digitalkamera | - | - - | Fluoreszenzmikroskop, das in der Lage ist, rote, grüne und blaue Fluoreszenz in getrennten Kanälen digital zu erfassen, kann verwendet werden. |
| Vectashield Antifade-Medien | Vector Labs | H-1000 | Antifade-Medien von jedem Anbieter können verwendet werden. |
| Glas-Deckgläser, Nr.1 Stärke | Brain Research Labs | 2222-1 | Deckgläser aller Anbieter können verwendet werden. Die kleinste Größe von 22 x 22 mm ist ausreichend für die Beinabschnitte von Neugeborenenmäusen. |
| Nagellack | Ted Pella | 114-8 | Wird zum Versiegeln von Deckgläsern verwendet. Nagellack von jedem Anbieter (auch von regulären Einzelhändlern) kann verwendet werden. Vermeiden Sie die Verwendung von Nagellack mit Farbe oder Zusätzen, die während der Fluoreszenzbildgebung Licht reflektieren können. |
Referenzen
- Ansari, B., Coates, P. J., Greenstein, B. D., Hall, P. A. In situ end-labelling detects DNA strand breaks in apoptosis and other physiological and pathological states. 170 (1), 1-8 (1993).
- Ben-Izhak, O., Laster, Z., Akrish, S., Cohen, G., Nagler, R. M. TUNEL as a tumor marker of tongue c....
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Nachdrucke und Genehmigungen
