Erkennung und Analyse von DNA-Schädigungen in Maus-Skelettmuskel In-situ- Verwenden der TUNEL-Methode

Zusammenfassung

Dieses Video beschreibt das Sezieren, die Gewebeverarbeitung, das Schneiden und die fluoreszenzbasierte TUNEL-Markierung von Maus-Skelettmuskeln. Es wird auch ein Verfahren zur halbautomatischen Analyse der TUNEL-Markierung beschrieben.

Zusammenfassung

Endständige Desoxynukleotidyltransferase (TdT) Desoxyuridintriphosphat (dUTP) Nick-End-Markierung (TUNEL) ist die Methode, das TdT-Enzym zu verwenden, um eine markierte Form von dUTP kovalent an 3'-Enden von doppel- und einzelsträngigen DNA-Brüchen in Zellen zu binden. Es ist eine zuverlässige und nützliche Methode, um DNA-Schäden und Zelltod in situ nachzuweisen. Dieses Video beschreibt die Dissektion, Gewebeverarbeitung, Schnittbestimmung und fluoreszenzbasierte TUNEL-Markierung von Maus-Skelettmuskeln. Es wird auch eine Methode zur halbautomatischen Quantifizierung von TUNEL-Signalen beschrieben. Inhärente normale Gewebemerkmale und Gewebeverarbeitungsbedingungen beeinflussen die Fähigkeit des TdT-Enzyms, DNA effizient zu markieren. Bei der Gewebeverarbeitung kann es auch zu unerwünschter Autofluoreszenz kommen, die die TUNEL-Signalerkennung beeinträchtigt. Daher ist es wichtig, die Gewebeverarbeitungs- und TUNEL-Markierungsmethoden empirisch zu bestimmen, die das optimale Signal-Rausch-Verhältnis für die anschließende Quantifizierung liefern. Der hier beschriebene fluoreszenzbasierte Assay bietet eine Möglichkeit, das Autofluoreszenzsignal durch digitale Kanalsubtraktion auszuschließen. Der TUNEL-Assay, der mit geeigneten Gewebeverarbeitungstechniken und -kontrollen verwendet wird, ist eine relativ schnelle, reproduzierbare, quantitative Methode zum Nachweis von Apoptose im Gewebe. Es kann verwendet werden, um DNA-Schäden und Apoptose als pathologische Mechanismen zu bestätigen, betroffene Zelltypen zu identifizieren und die Wirksamkeit therapeutischer Behandlungen in vivo zu beurteilen.

Einleitung

Desoxyribonukleotidyltransferase (TdT) dUTP nick end labeling (TUNEL) ist der Prozess, mit dem TdT-Enzym zu dUTP bis 3 befestigen-Enden von Doppel- und Einzelstrang-DNA bricht ^12,23. Die TUNEL-Methode zur Detektion von Apoptose und DNA-Schädigung wurde zuerst vor mehr als 20 Jahren von Gavrieli et al. ^1,12,24 gemeldet. Es ist seit bewertet worden und in verschiedenen Gewebepräparaten ^7,23,27,40 optimiert. TUNEL verwendet wurde, um Ischämie-induziertem Zelltod von Neuronen ^6,14,29 und Kardiomyozyten ^43,44, exzitotoxischen neuronalen Zelltod ^30,31 studieren und als Biomarker in Arthritisbehandlung ^39. Es hat sich auch als prognostischer Faktor und Tumorzellmarker in verschiedenen menschlichen Krebsarten ^{2,3,15,32,37,38,42} verwendet.

Alternative Methoden gibt es für DNA-Schädigung und Zelltod-Erkennung, aber sie technische Herausforderungen und Einschränkungen haben. Southern-Blotting verwendet werden, um quantif werdeny DNA-Schäden in ganz Gewebelysaten ^7,9-11, aber diese Methode bietet keine Zellebene Auflösung und ist schwer zu quantifizieren. Der Comet-Assay ist eine Alternative zellbasierte Verfahren, die Extraktion erhaltenen Kerne von Zellen ^4,20,28,36 erfordert. Obwohl der Comet-Assay eignet sich gut an kultivierten isolierten Zellen, ist es viel schwieriger, intakten Zellkernen von Skelettmuskelgewebe ^8,21 vorzubereiten. Wie bei Southern-Blot, wird der Comet-Assay keine Zelltyp-spezifische Informationen aus einer ganzen Muskel Gewebehomogenat. Eine weitere Alternative der TUNEL-Methode ist die Immunhistochemie unter Verwendung von Antikörpern gegen einzelsträngige DNA ^25,33,41 oder gegen Proteine, die in die DNA-Reparatur und Zelltod Wege beteiligt (zB p53, H2AX und Caspasen) ^13,17,22,40. Solche Antikörper-basierten Verfahren benötigen sorgfältige Charakterisierung von Antikörpern und ausgezeichnete Antikörperspezifität, ein hohes Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis zu erhalten. Auch wenn specific Antikörper vorhanden sind, sie die Denaturierung des Zielproteins durch Antigengewinnungsverfahren ^34,35 erfordern. Wie wir hier diskutieren, Antigen-Retrieval im Muskelgewebe führt zu inakzeptabel hohen Autofluoreszenz. Im Gegensatz zu den alternativen Methoden, TUNEL erreicht DNA Schadenserkennung mit einem hohen Signal und niedrige Hintergrund, ausgezeichnete Spezifität, die mit einfachen Positiv- und Negativkontrollen, gute Gewebepenetration, die keine Antigen-Retrieval nicht verlangen, und zellulären Ebene Auflösung getestet werden können. Darüber hinaus nimmt der TUNEL-Methode ca. 4 Stunden in Anspruch, während alternative Methoden erfordern in der Regel über Nacht Inkubationen.

Wir untersuchen die Skelettmuskulatur Zelltod in einem Mausmodell der spinalen Muskelatrophie (SMA) ^10, die von Hsieh-Li und seine Kollegen ¹⁶ generiert wurde. Apoptotische Zellen quantifizieren im Muskel, haben wir ein Verfahren zur Gewebevorbereitung, Anfärbung und Quantifizierung, das robust gegenüber verschiedenen skele arbeitet entwickeltental Muskelgruppen in verschiedenen Entwicklungszeitpunkten bei Mäusen. Wir verwenden ein handelsübliches TUNEL-Markierungs-Kits und handelsüblichen Bildanalyse-Software. Wir haben erfolgreich die TUNEL-Assay in Kombination mit Immunfluoreszenzfärbung in der Wirbelsäule ¹⁰ eingesetzt.

Die hier beschriebenen Methoden sind nützlich für Ermittler, die zu Gewebepathologie, Mechanismen der Krankheits, Mechanismen des Alterns und Entwicklungs (prä- und postnatalen) Zelltod in der Skelettmuskulatur bewerten möchten. Die TUNEL-Technik ist besonders nützlich für die Untersuchung der DNA-Schädigung und Reparatur und Zelltod in Modellsystemen, wo nur eine Untergruppe von Zellen notwendig betroffenen und zellulärer Ebene Auflösung.

Dieses Video beschreibt Dissektion Gewebeverarbeitung, Schneide- und Fluoreszenz basierenden TUNEL Kennzeichnung Maus Skelettmuskel. Sie beschreibt auch ein Verfahren zur halbautomatischen TUNEL Signal Quantifizierung.

Protokoll

HINWEIS: Alle in diesem Protokoll beschriebenen Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen in der Bedienungsanleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health ²⁶ durchgeführt. Das Protokoll (MO13M391) wurde von der Johns Hopkins University Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.

1. neonatale Maus Opfer, Dissection, und Fixierung

1. Opfere eine neonatale Maus durch CO ₂ Inhalation.
2. Unmittelbar vor der Hinterlauf oberhalb des Knies geschnitten. Bis etwa postnatalen Tag 7, sind die Beinknochen weich genug über mit großen Labor Schere oder scharfe Klinge zu schneiden und anschließend Abschnitt eines Kryostaten.
3. Platzieren Sie den Hinterlauf in 10 ml eiskaltem 4% Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) in einem 15 ml Röhrchen.
4. Eint fixieren den Hinterlauf in Paraformaldehyd für 4-24 h bei 4 ° C. Embryonalem Gewebe erfordert nur wenige Stundens der Fixierung.
   1. Fixierung Vermeiden von mehr als 24 Stunden, da dies TUNEL-Assay Effizienz reduzieren.
5. Cryoprotect den Hinterlauf durch in einer Zuckerlösung eingetaucht wird.
   1. Ändern Paraformaldehyd und 10% Saccharose in PBS auf die gleiche 15-ml-Röhrchen, Inkubieren über Nacht bei 4 ° C.
   2. Änderung bis 30% Saccharose in PBS, inkubiert über Nacht bei 4 ° C oder, bis der Hinterlauf sinkt auf den Boden des Röhrchens. Gewebe kann in 30% Sucrose für eine längere Zeit verwendet werden, vorausgesetzt, daß die Saccharose wurde sterilfiltriert.

2. Gewebeeinbettung

1. Füllen Sie eine markierte Einbettform Hälfte mit Einbettmedium.
2. Platzieren hindlimb auf der Oberseite des Einbettungsmediums, mit der Schnittfläche möglichst nahe an einer Wand der Form. Markieren die Ausrichtung der Hinterlauf an der Außenseite der Form.
   1. Betten Sie mehrere Hinterbeine und im selben Block geschnitten. Jedoch ist es wichtig, sicherzustellen, dass alle Hindlimbs im Block sind parallel zueinander ausgerichtet sind, um Abschnitte fristenkon- Ebenen längs der Achse des Gliedes zu erhalten.
3. Bedecken Hinterbeine mit Einbettmedium. Wenn Hinterbeine verschieben beim Schütten von Medium, neu orientieren sie mit stumpfen Pinzette oder einem Zahnstocher.
4. Zulassen Einbettmedium, um das Gewebe bei Raumtemperatur für mindestens 15 min zu infiltrieren.
5. Platz Formen direkt auf Trockeneis oder in Isopentan auf Trockeneis zu frieren Einbettmedium. Achten Sie auf die Formen Niveau halten zu allen Zeiten und Verschiebung der eingebetteten Gewebe vermeiden.
6. Halten gefrorenen Formen bei -80 ° C bis bereit zu schneiden, bis zu mehreren Monaten.

3. Kryoschneiden Embedded Gliedmaßen

1. Stellen Kryostatkammer Temperatur bis -20 ° C, Objekttemperatur bis -18 ° C; einstellen Objekttemperatur abkühlen.
2. Äquilibrieren der Gewebeblock in der Kryostatkammer für mindestens 30 min. Correct Block Tempratur ist entscheidend für Schnittqualität.
3. Geschnitten Querschnitte mit einer Dicke von 10 um oder weniger. Dickere Abschnitte nicht vollständig durch TUNEL Reagenzien durchdrungen werden. Verwenden Sie den Treckerplatte, Klingen und Klingenwinkel (in der Regel 5 °) empfohlen für den Kryostaten.
4. Sammeln Schnitte auf gelatin- oder vectabond beschichteten Glasobjektträger bei Raumtemperatur. Platzieren Sie sofort in eine Schiebefenster auf Trockeneis. Halten Sie den Schiebefenster in einem separaten Behälter mit Trockeneis in der Nähe des Kryostaten in Reichweite platziert.
   1. Schneiden Querschnittserien durch die lange Achse des Gliedes, das Überspringen von 100 bis 200 & mgr; m. Sammeln Sie mindestens 3 benachbarte Abschnitte an jedem Serienniveau.

4. TUNEL Assay am Hinterlauf Abschnitte mit einem handelsüblichen Kit (alle Schritte bei Raumtemperatur wenn nicht anders vermerkt)

1. Tauen Sie Dias mit Abschnitten auf Raumtemperatur und trocken über Nacht oder über das Wochenende.
2. Rehydrieren Abschnitte von immersing Dias in PBS für 2 x 10 min in einem Coplin-Gefäß. Dry mit einem Labor zu wischen, zu entfernen so viel Flüssigkeit um den Abschnitt wie möglich.
3. Permeabilisieren Abschnitte
   1. Verwenden Sie entweder eine nicht-proteolytischen, Saponin-basierten kommerziellen Reagenz oder 0,5% Tween 20 und 0,05% Triton X100 in PBS.
   2. Den Objektträger in eine feuchte Kammer überführen. Eine einfache Feuchtigkeitskammer ist eine leere Pipettenspitzenkasten mit einem dichten Deckel, mit gerade genug Wasser zugesetzt, um die Unterseite der Box ab.
   3. Pipette genügend Reagenz auf den Objektträger, um den Abschnitt zu decken (50 ul reicht für neonatale Maus Gliedmaßen). Direkt pipettieren Sie nicht auf den Abschnitt, als wiederholte Rühren kann den Abschnitt zu veranlassen, heben Sie die Folie.
   4. Mit stumpfen Pinzette, legen Sie ein kleines Rechteck von Parafilm auf der Oberseite des Abschnitts, um sich auszubreiten die Tropfen des Reagens und den Abschnitt vollständig zu bedecken. Sollten Blasen unter der Parafilm, heben Sie sie vorsichtig ab, trocknen und erneut anwenden.
   5. Folien mit permeabili inkubierensierung Reagenz für 1 Stunde in einem abgedeckten feuchten Kammer. Sofern Teile beginnen, aus dem Schlitten abheben kann Permeabilisierung Zeit auf 30 Minuten reduziert werden.
   6. Waschen Sie Dias in PBS in einer Coplin-Gefäß 2 x 5 min. Die Parafilm Rechtecke sollte nach oben schweben und kann dann entfernt und entsorgt werden.
   7. Mit einem Labortuch trocknen so viel Flüssigkeit um die Abschnitte wie möglich.
4. TdT-vermittelte DNA-Pause Kennzeichnung
   1. Folgen Sie den Anweisungen, um Kit 1x TdT Markierungspuffer pipettieren genug Markierungspuffer auf den Objektträger auf den Gewebeschnitt zu decken (50 ul reicht für neonatale Maus Gliedmaßen). Inkubieren in der Feuchtigkeitskammer für 5 min. Alternativ tauchen Sie die Folie in TdT Markierungspuffer in einer Coplin-Gefäß.
   2. Folgen Kit Anweisungen TdT Kennzeichnung Mix zu machen. Das Kit umfasst Kobalt, Magnesium und Mangan-Kationen; das Mangankation funktioniert gut auf einer Vielzahl von Geweben, einschließlich Skelettmuskel, dem Nervensystem tissues, Leber, Haut und Knochen.
   3. Für eine positive Kontrolle, fügen DNase (mit "Nuklease" im Satz) an die TdT Markierungsmischung. Alternativ vorzubehandeln eine positive Steuerabschnitt mit DNase in Nuklease-Puffer für 1 h bei 37 ° C, je nach Montageanweisungen. Halten DNase-Lösung und DNase behandelten Abschnitte entfernt von anderen experimentellen Abschnitten um eine Kreuzkontamination zu vermeiden.
   4. Für eine negative Kontrolle, wegzulassen TdT-Enzym von der Markierungsmischung.
   5. Verwenden Sie eine Laborwischtuch, um so viel TdT Markierungspuffer von dem Objektträger wie möglich zu entfernen. Pipette TdT Markierungsmischung auf den Objektträger (50 ul pro Abschnitt), Deckel mit einem neuen Rechteck von Parafilm, und Inkubation in der Feuchtigkeitskammer bei 37 ° C für 1 Stunde.
   6. Folgen Sie den Anweisungen, um Kit 1x Anschlagpuffer zu machen. Verwenden Sie ein Labor wischen TdT Markierungsmischung von der Folie zu entfernen, und fügen Sie 200-300 ul Stop-Puffer, um den Gewebeschnitt zu bedecken, und Inkubation in der Feuchtigkeitskammer für 5 min. Al nativ, tauchen Sie die Folie in Anschlagpuffer in einer Coplin-Gefäß.
   7. Die Folie 2 x 2 min in PBS waschen. Verwenden Sie eine Laborwischtuch, um so viel PBS zu entfernen von der Folie wie möglich.
5. Fluoreszenzmarkierung
   1. Folgen Kit Anweisungen an Fluorescein Etikettierungslösung vorbereiten, dNTPs auf DNA-Brüche kennzeichnen. Pipette Lösung auf den Objektträger (50 ul pro Abschnitt), Deckel mit einem neuen Rechteck von Parafilm, und Inkubation in der feuchten Kammer für 20 min.
   2. Wash Rutsche für 2 min in PBS in einer Coplin-Gefäß. Verwenden Sie eine Laborwischtuch, um so viel PBS von der Folie zu entfernen, wie möglich.
   3. Verdünne Hoechst 33258 Kernfärbung bis 1 ug / ml in PBS und Pipette auf den Schlitten (100-200 & mgr; l ist ausreichend, um Teilabdeckung). Inkubieren in der Feuchtigkeitskammer für 5 min.
   4. Für 5 min in PBS waschen 3x.
   5. Deckglas mit Antifade Fluoreszenz Eindeckmittel und Dichtung Kanten mit Nagellack.

jove_title "> 5. Digitale Bildaufnahme

1. Erwerben von Bildern mit einem konventionellen Fluoreszenzmikroskop mit DAPI, FITC und Texas Red-Filter (oder äquivalent). Verwenden Sie eine höhere Vergrößerung Ziel (20X oder 40X), um zu überprüfen, dass die Kennzeichnung war erfolgreich und Kerne (intakt oder fragmentiert) markiert waren. A 10X-Objektiv ist ausreichend für die Quantifizierung der TUNEL-positiven puncta.
2. Bilder der Hoechst-Färbung, TUNEL-Färbung und Autofluoreszenzsignals Sammeln Sie so drei separate Falschfarbenkanäle in einem Bild kombiniert. Wenn der TUNEL Fluorophormarkierung ist grün, Bild Autofluoreszenzsignals im Rotfilter, und umgekehrt.
   1. Bewahren Sie alle Bildeinstellungen Äquivalent zwischen den Folien für die anschließende Schwellen und Quantifizierung. Für jeden Filter, Presets und Plattenbelichtungszeiten, Verstärkung und Binning (kein Binning ist am besten); Verwenden Sie keine automatische Belichtungs oder Verstärkungseinstellungen.
   2. Verwenden Sie Trial-and-error, um Belichtung und Gain-Einstellungen, die am besten erfassen wird die Palette der inten findenschulen in allen gefärbten Schnitten. Stellen Sie sicher, dass es keine gesättigten Pixel in den erfassten Bildern, da dies die Bias-Quantifizierung.
3. Nehmen Sie Bilder des gesamten Muskelgruppe von Interesse. Dies kann erfordern, mehrere Bilder zu "genäht" werden zusammen.

6. Bildanalyse

1. Verwenden Sie handelsübliche Bildanalyse-Programme, um digitale Bilder von TUNEL-Färbung analysiert. Analyse mittels kommerzieller Software wird hier gezeigt. Alternativ kann die freie Software ImageJ von NIH zur TUNEL-Färbung analysiert werden.
2. Fleck einen Abschnitt neben dem TUNEL-gefärbten Abschnitt mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) und einen Vollschnitt digitalen Bildes mit einem konventionellen Hellfeldmikroskop. Verwenden Sie dieses Bild H & E in Kombination mit einem Anatomieatlas ^5,18,19, um die anatomischen Strukturen zu quantifizieren verfolgen.
3. Bei ausgeschaltetem TUNEL Kanal manuell die Kontur der Fläche zu verfolgen, um zu quantifizieren, mitHoechst und Autofluoreszenz-Kanäle für die Führung. Die zurückBereich in eine Maske konvertieren (eine Reihe von ausgewählten Pixelkoordinaten zu analysieren).
4. Schalten Sie den TUNEL-Kanal. Mit der Intensität Schwellenwertfunktion in der Bildanalyse-Programm, stellen Sie die untere Schwelle, um alle Autofluoreszenzsignal aus.
5. Übernehmen Sie die gleiche Schwellenwerteinstellungen für alle Bilder in der Studie Set. Konvertieren einer Schwellenwertauswahl in Masken.
6. Für jedes Bild, kombinieren die Muskelfläche Maske und die TUNEL-Maske. Die neue Kombination Maske TUNEL Signal innerhalb nur der zurückMuskelBereich darstellen.
7. Führen Maske Quantifizierung auf die Kombination Maske Anzahl von Objekten zu bestimmen, und Objektbereich des TUNEL-Signal innerhalb des Muskelbereichs zurückzuführen. Führen Sie diese mit Hilfe der Particle Analyzer-Funktion in ImageJ.

Ergebnisse

Mit erfolgreichen Färbung sollte TUNEL-positiven Signal hell genug, um von Autofluoreszenz, indem Intensitätsschwellen zu isolieren. TUNEL-positive Objekte bei geringer Vergrößerung als helle unregelmäßige Fragmente im Skelettmuskel (1A) angezeigt. Jedoch bei höherer Vergrößerung einige TUNEL-positive Objekte mit dem klassischen apoptotische Morphologie zu beachten, wenn der Zelltod-Typ beteiligt ist, Apoptose (Figur 1B). Die positive Kontrolle (DNase zugegeben) sollte reichlich TUNEL-p...

Diskussion

Verfahren zum Nachweis und zur quantitativen Analyse von DNA-Schäden assoziierten Apoptose in Skelettmuskel der Maus beschrieben. Das Verfahren beinhaltet Gewebeernte, TUNEL-Färbung, digitale Bildaufnahme und Bildanalyse. Gemeinsame histologische Lieferungen und Werkzeuge benötigt werden, und eine spezielle Handels TUNEL-Kit erforderlich. Die wesentlichen große Ausrüstungsteile nötig sind, einen Kryostat, Epifluoreszenz-Mikroskop mit digitaler Bildfähigkeit und ein Computersystem zur Bildanalyse.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
4 % Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung	Elektronenmikroskopie	Wissenschaften 19202	Für die hier beschriebenen Verfahren wurde eine 4%ige Lösung frisch aus Pulver hergestellt. Paraformaldehyd von jedem Lieferanten kann verwendet werden. Die vorbereitete Formaldehydlösung sollte bei 4 μg gelagert werden; C und sollte nach dem Verfallsdatum (bis zu mehreren Monaten) nicht mehr verwendet werden. Paraformaldehyd ist ein Karzinogen und ein Toxin durch Einatmen und Hautkontakt. Bitte befolgen Sie beim Umgang mit Paraformaldehyd die im Sicherheitsdatenblatt angegebenen Vorsichtsmaßnahmen.
Saccharose	Sigma	S0389	Wird zum Kryoschutz von Gewebe vor dem Einfrieren verwendet. Saccharose von jedem Lieferanten kann verwendet werden.
O.C.T. Compound	Tissue-Tek	4583	Einbettmedium für Kryosektionen.
Kryostat	Leica	CM 3050S	Für die hier beschriebenen Präparationen wurde ein Leica CM3050S Kryostat verwendet. Jeder Kryostat, der in der Lage ist, 10 μm zu schneiden. Es können m-Sektionen verwendet werden.
Objektträger, 25 x 75 x 1 mm	Fisher	12-552-3	Objektträger können von jedem Anbieter verwendet werden.
Gelatine	Sigma	G-9391	Gelatine wird verwendet, um die Haftung von Gewebeschnitten auf Objektträgern zu fördern. Um Objektträger mit Gelatine zu beschichten, lösen Sie 2,75 g Gelatine und 0,275 g Chromalaun in 500 ml destilliertem Wasser auf, erwärmen Sie es auf 60 °; C, die Objektträger einige Sekunden lang eintauchen und trocknen lassen. Es kann Gelatine von jedem Lieferanten verwendet werden. Alternativ können gelatinevorbeschichtete Objektträger erworben werden.
Chrom(III)-Kaliumsulfat-Dodecahydrat (Chromalaun)	Sigma	243361	Chromalaun wird der Gelatinelösung zugesetzt, um die Gewebehaftung auf Objektträgern zu fördern. Es ist ein mögliches Karzinogen und ein Toxin durch Einatmen und Hautkontakt. Bitte befolgen Sie die im Sicherheitsdatenblatt angegebenen Vorsichtsmaßnahmen beim Umgang mit Chromalaun.
Vectabond Gewebehaftungsreagenz	Vector Labs	SP-1800	Optionales Substrat für eine bessere Gewebehaftung auf Objektträgern; stattdessen können gelatinebeschichtete Objektträger verwendet werden.
Tween20	Sigma	P9416	Ein Reinigungsmittel zur Permeabilisierung von Gewebe. Tween20 von jedem Anbieter kann verwendet werden.
Triton X100	Sigma	T8787	Ein Waschmittel zur Permeabilisierung von Gewebe. Triton X100 von jedem Hersteller kann verwendet werden.
TACS 2 TdT Fluorescein in situ Apoptose-Detektionskit	Trevigen	4812-30-K	Kommerzielles Kit für die fluoreszenzbasierte TUNEL-Markierung.
DNase/Nuklease	Trevigen	4812-30-K	(im Kit enthalten)
DNase/Nuklease-Puffer	Trevigen	4812-30-K	(im Kit enthalten)
10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4	Amresco	780	Make 1x PBS für Waschungen und Verdünnungen. PBS von jedem Lieferanten kann verwendet werden.
DNasefreies Wasser	Qualität Biologicals	351-029-131	Es kann Wasser von jedem Lieferanten verwendet werden.
Hoechst 33258	Sigma	94403	Kernfarbstoff. Es kann jeder blau fluoreszierende Kernfarbstoff verwendet werden. Als DNA-bindender Farbstoff steht Hoechst im Verdacht, krebserregend zu sein, und sollte mit Schutzausrüstung angefasst werden, um den Hautkontakt zu minimieren.
Parafilm M	mehrfach	807	Jede andere hydrophobe Folie oder Deckfolie kann verwendet werden. Erhältlich von mehreren Lieferanten.
Fluoreszenzmikroskop mit Digitalkamera	-	- -	Fluoreszenzmikroskop, das in der Lage ist, rote, grüne und blaue Fluoreszenz in getrennten Kanälen digital zu erfassen, kann verwendet werden.
Vectashield Antifade-Medien	Vector Labs	H-1000	Antifade-Medien von jedem Anbieter können verwendet werden.
Glas-Deckgläser, Nr.1 Stärke	Brain Research Labs	2222-1	Deckgläser aller Anbieter können verwendet werden. Die kleinste Größe von 22 x 22 mm ist ausreichend für die Beinabschnitte von Neugeborenenmäusen.
Nagellack	Ted Pella	114-8	Wird zum Versiegeln von Deckgläsern verwendet. Nagellack von jedem Anbieter (auch von regulären Einzelhändlern) kann verwendet werden. Vermeiden Sie die Verwendung von Nagellack mit Farbe oder Zusätzen, die während der Fluoreszenzbildgebung Licht reflektieren können.

-Jedes