Beurteilung der Lebensfähigkeit der Menschen Fat Injektion in Nacktmäusen mit Micro-Computertomographie

Zusammenfassung

Die Fetttransplantation ist eine wesentliche Technik zur Rekonstruktion von Weichteildefiziten. Es bleibt jedoch ein unvorhersehbares Verfahren, das durch ein variables Transplantatüberleben gekennzeichnet ist. Unser Ziel war es, ein Mausmodell zu entwickeln, das eine neuartige bildgebende Methode verwendet, um die Volumenretention zwischen verschiedenen Techniken der Fetttransplantatvorbereitung und -abgabe zu vergleichen.

Zusammenfassung

Fetttransfer ist ein wichtiges Instrument in der Chirurg Rüstzeug für die Behandlung von Weichgewebedefizite im ganzen Körper. Fett ist der ideale Weichgewebe Füllstoff, wie es ist leicht verfügbar, leicht zu erhalten, kostengünstig und von Natur aus biokompatibel. ¹ Doch trotz seiner wachsenden Popularität, wird Fetttransplantation von unvorhersehbaren Ergebnissen und variable Transplantatüberleben behindert, mit veröffentlichten Abscheideraten im Bereich irgendwo von 10 -80%. ^1-3

Um Untersuchungen an Fetttransplantation zu erleichtern, haben wir deshalb entwickelte ein Tiermodell, das für Echtzeitanalyse des eingespritzten Fett Volumenretention ermöglicht. Kurz gesagt, wird ein kleiner Schnitt in der Kopfhaut eines CD-1-Nacktmaus vorgenommen und 200-400 ul verarbeitet lipoaspirate über dem Schädel plaziert. Die Kopfhaut wird als Empfängerstelle wegen seiner Abwesenheit Mutterunterhautfett gewählt und wegen der ausgezeichneten Hintergrund Kontrast von der Schädeldach vorgesehen, die hilftder Analyseprozess. Mikrocomputertomographie (Mikro-CT) verwendet wird, um das Transplantat an der Grundlinie und danach alle zwei Wochen zu scannen. Die CT-Bilder rekonstruiert und eine Imaging-Software wird verwendet, um Transplantatmengen zu quantifizieren.

Traditionell Techniken, um Fetttransplantat Volumen beurteilen haben erforderte euthanizing die Studie Tier nur eine einzige Bewertung des Transplantats Gewicht und Volumen von physikalischen Mess ex vivo liefern. Biochemische und histologische Vergleiche sind ebenfalls erforderlich, die Studie Tier eingeschläfert werden. Diese beschriebenen Abbildungstechnik bietet den Vorteil der Visualisierung und objektiv zu quantifizieren Volumen zu mehreren Zeitpunkten nach der ersten Transplantation, ohne die Studie Tier zu opfern. Die Technik wird durch die Größe des Transplantats in der Lage, wie größere Transplantate Risiko Haut und Fettnekrose injiziert werden begrenzt. Diese Methode hat einen Nutzen für alle Studien, die Fetttransplantat Lebensfähigkeit und Volumenretention. Es ist besonders gut geeignet, um die OEMng eine visuelle Darstellung der Fett-Transplantate und nach Volumenänderungen im Laufe der Zeit.

Einleitung

Weichteildefekte entstehen aus einer Vielzahl von Ursachen, einschließlich Trauma, Tumorresektion, Alterung und angeborenen Anomalien. Sie können für Patienten lähmend sein und stellen eines der häufigsten, aber auch herausforderndsten Probleme für rekonstruktive Chirurgen dar. Es gibt viele Methoden, um Weichteilmängel zu beheben, wie z. B. lokale und freie Lappen, Kollageninjektionen und synthetische Füllstoffe. ^4-8 Seit seiner ersten dokumentierten Anwendung durch Neuber im Jahr 1893¹ ist der autologe Fetttransfer jedoch nach wie vor der Goldstandard für die Reparatur von Weichteildefiziten, da er sofort verfügbar, einfach und sicher zu entnehmen und von Natur aus verträglich ist. ^1,2

kg

Trotz dieser Vorteile leiden autologe Fetttransplantate unter einem unvorhersehbaren und variablen Überleben, wobei die Retentionsraten im Laufe der Zeit zwischen 10 und 80% liegen. ^1-3,9 Um diesen erwarteten Volumen- und Symmetrieverlust zu berücksichtigen, müssen Chirurgen beim Füllen von Weichteildefekten häufig Überkorrekturen vornehmen oder mehrere Nachsorgeeingriffe durchführen.

Schlecht vaskularisierte Transplantatbetten sind teilweise schuld an dieser Geweberesorption. Darüber hinaus kann das Fehlen einer Benchmark-Analysemethode zum Vergleich des Überlebens von Transplantaten ebenfalls zu der Inkonsistenz der berichteten Ergebnisse beitragen. Eine präzise Methode zur Messung des Transplantatvolumens würde Messfehler bei der Bewertung der Retentionsraten reduzieren. Dies wiederum würde den Forschern helfen, die ursächlichen Faktoren, die das Überleben des Transplantats beeinflussen, genauer zu identifizieren. Obwohl viele Labortiermodelle sowohl die quantitative als auch die qualitative Beurteilung des Überlebens von menschlichen Fetttransplantaten erleichtert haben, basieren die meisten auf histologischen und biochemischen Mitteln und erfordern die Opferung des Versuchstieres, um eine einzige Messung zu erhalten. ^3,10-12 Über den Einsatz bildgebender Verfahren zur Aufzählung der Volumenretention von Fetttransplantaten in vivo wurde wenig berichtet.

Eine Handvoll klinischer Studien haben effektivere Messtechniken mit Hilfe von Bildgebung gezeigt. Die Magnetresonanztomographie (MRT) wurde von Hörl et al. eingesetzt. zur Messung des Überlebens von Fetttransplantaten¹³, und die CT wurde von Har-Shai et al. verwendet. und Fontdevila et al. in ihren Analysen des Volumenerhalts nach der Transplantation bei Patienten, die an HIV litten. ^14,15 Einsatz von dreidimensionaler (3D) Bildgebungssoftware, Meier et al. Messung des Volumenerhalts beim Menschen nach autologen Fetttransplantationen durch Vergleich von Bildern aus der präoperativen und postoperativen Phase. ¹⁶

Dennoch fehlt in der Grundlagenforschung eine standardisierte Methode, die bildgebende Verfahren zur Messung des Überlebens von Fetttransplantaten einsetzt. Ein hochauflösender bildgebender Ansatz zur Beurteilung des Volumens von Fetttransplantaten würde nicht nur genaue und reproduzierbare Volumenmessungen ermöglichen, sondern auch wiederholte Messungen, die eine Visualisierung der Entwicklung des Überlebens von Fetttransplantaten in Echtzeit ermöglichen.

Protokoll

HINWEIS: Experimentelle Protokolle und Patientenaufklärung zur Gewinnung von Fett wurden überprüft und von der Stanford University Institutional Review Board (Protokoll # 2188) zugelassen. Alle tierischen Verfahren wurden von der Stanford Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC) unter Protocol # 9999 genehmigt. Alle Experimente wurden bei strikter Einhaltung Tier Sicherheit und humane Pflege Leitlinien.

1. Fett Harvesting

1. Mit dem Coleman Verfahren ^17-19, erhalten menschlichen Fettgewebe von den Bauch, Flanken und / oder Oberschenkel Regionen gesunden weiblichen Patienten nach elektiven Fettabsaugung.
2. Um die lipoaspirate für die Transplantation zu bearbeiten, zu beginnen, indem sie das Fett für 30 Minuten absetzen.
3. Lipoaspirate absetzt typischerweise in drei Schichten, mit Öl an der Spitze, Fett in der Mitte, und das Blut am unteren Ende. Absaugen und entsorgen Sie den oberen Ölschicht und die untere Blutschicht.
4. Um die restliche tumesc weiter zu entfernenent Flüssigkeit oder Zelltrümmer, zentrifugieren Sie das Fett für 5 Minuten bei 350 xg und 4 ° C, und saugen Sie den Boden wässrige Schicht.
5. Berechnen Sie die Menge an Fett für die Transplantation benötigt, so dass für 20% Lieferfehler und legen das gewünschte Volumen an Fett zu 50 ml konische (n). Multiplizieren 400 durch die Anzahl der Mäuse in der Studie, um Mikroliter von Fett zur Pfropfung erforderlich erhalten.
6. An diesem Punkt, wenn die Durchführung Zell unterstütztem Fetttransfer ^20,21, Platz Volumen von Fett zum Pfropfen auf Eis. Dann ernten Fettgewebe gewonnene Stromazellen (ASC) aus dem verbleibenden Fett mit dem durch Zuk et al ²² beschriebenen Standardverfahren.

2. Fetttransplantation

1. Erhalten weiblich, homozygot CD-1-Nacktmäusen für die experimentelle Untersuchung. Wählen Sie Mäusen zwischen 8-12 Wochen alt sind.
2. Anästhesie, statt der Maus in eine Zuschlags Box mit 2,5% Isofluran / Sauerstoff-Gemisch für etwa 10 min zu induzieren bei 2 l / min. Bitte beachten Sie, dass die empfohlenen isoflurane Dosis variiert mit Mausstamm.
3. Wenn die Atemfrequenz der Maus hat sich verlangsamt, bestätigen ausreichende Sedierung mit einer Zehe Prise. Anwenden Veterinärschmier ophthalmischen Salbe in beide Augen der Maus.
4. Wenn Maus nicht als Reaktion auf Zehe Prise zurückschrecken, dies bestätigt eine ausreichende Ebene der Anästhesie. Platzieren Sie die Maus die Nase in ein Nasenkonus liefert 2,5% Isofluran / Sauerstoff-Gemisch bei 1-2 l / min. Wenn der Maus fährt von der Zehe Prise, um Zuschlags Box und Retest zurück nach 5 min.
5. Richten Sie sterilen Bereich unter der Maus und dann sterilisieren Kopfhaut mit 2,5% PVP-Jod, gefolgt von 70% Ethanol-Lösung. Diesen Vorgang zweimal wiederholen.
6. Zeigen OP-Abdeckungen über die Maus und achten Sie darauf, sterilen Bereich zu halten. Sterilinstrumenten, Handschuhen und PPE zu allen Zeiten verwendet werden.
7. Wenn Fett Volumen zu pfropfende wurde zuvor auf Eis gestellt, um Fett zu ermöglichen erste RT anzupassen vor der Auslieferung.
8. Hinauszuzögern eine 1 ml Luer-Verschluss-Spritze mit 1 mlFett.
9. Schließen Sie eine 14 G, 8 cm lang Fett Pfropfen Kanüle bis zum Ende der Spritze.
10. Anfangssystem durch Niederdrücken des Spritzenkolbens bis zwischen 200 und 400 & mgr; l von Fett bleibt in der Spritze. Während Niederdrücken des Spritzenkolbens zu bestätigen, dass die Kanüle vollständig mit Fett durch Beobachtung Fett aus dem distalen Kanülenloch gefüllt.
11. Mit einer feinen Pinzette, heben Sie die Rückenhaut in der Mittellinie über der Schwanz-Aspekt des Schädels. Machen Sie ein 1,5 mm in die Haut mit einer feinen Schere geschnitten.
12. Legen Sie eine einzelne 6-0 Nylonnaht durch Mitte der Schnitt, die später verwendet werden, um bringen die Wundränder zusammen nach der Transplantation durchgeführt werden. Binden Sie die Naht.
13. Erstellung einer subkutanen Tasche über den Schädel durch Einführen der Kanüle durch die Inzision und Passieren der Kanüle hin und her in einem fächerförmigen Muster über dem Schädel keine Bindegewebe Anhänge an der darüberliegenden Haut freizugeben.
14. Sobald die Tasche erstellt wurde, positionieren Sie den cAnnula in der Mittellinie der Maus direkt über den Schädel, bis die Spitze liegt am rostralen weitesten Aspekt der Tasche, die sich direkt hinter einer Linie zwischen den Augen gezeichnet werden sollte. (1A)
15. Spritzen Sie das Fett in einer retrograd, voran den Kolben und ziehen Sie die Kanüle zurück. Mit einer Pinzette, bringen die Wundränder zusammen und heben sie bis kein Fett austritt aus der Tasche zu halten.
16. Binden Sie die Naht, die zuvor gesetzt wurde, um sicherzustellen, dass der erste Knoten liegt leicht auf der Haut. Binden Sie drei quadratischen Knoten und schneiden Sie die Naht mit einem 3 mm Schwanz. (1B)
17. Bestätigen Sie mit der Visualisierung und manuelle Palpation, dass die Tasche nicht überfüllt und die Haut über der Tasche ist nicht angespannt. Wenn die Tasche überfüllt wurde, schneiden Sie den Faden und entfernen Sie alle Fett aus der Tasche. Wasche die Tasche mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,4 und erneut injizieren ein kleineres Volumen von Fett.
18. Entfernen Sie von der Maus einnesthesia und auf dem Rücken oder der Seite in einem sauberen Käfig von selbst aus. Überwachen Sie das Tier für regelmäßige Atmung, normale Bewegungen, das Fehlen von Blutungen und Anzeichen von Schmerzen oder Leiden. Verwalten Buprenorphin 0,1 mg / kg subkutan alle 6 Stunden bis zu 48 Stunden, wenn das Tier vor Schmerz.
19. Stellen Sie sicher, dass das Tier sich ausreichend auf Brustlage bevor Sie es unbeaufsichtigt halten geweckt. Stellen Sie keine Tier in einen Käfig mit anderen Tieren, bis er sich vollständig erholt hat.
20. Nach 4 Stunden, zu gewährleisten, dass das Tier in der Lage, essen und trinken, bewegen und normal atmen und dass es keine Blutungen aus der Operationsstelle. Sendet sie der Tierstation.

3. Mikro-CT

1. Scan-Mäuse für Basisvolumen von postoperativen Tag 3 und wiederholen Sie Scans mit postoperativen Wochen 2, 4, 6 und 8.
2. Bei der Abbildung der Mäuse zu jedem Zeitpunkt, zu folgen vor und nach dem Verfahrens Sedierung und Tierpflege-Richtlinien wie zuvor in S skizziertTEPs 2,2-2,4 und von 2,17 bis 2,19.
3. Führen Scans an einem Mikro-CT-Scanners mit einem Rekonstruktions Voxel Größe von 100 um oder besser.
4. Mit einer Spitzenröntgenkilovoltspannung von 80 kVp und einem Anodenstrom von 450 uA, zu verwalten eine Ration Dosis von etwa 5 centiGy während einer 9 min Scan an jede Maus. Bitte beachten Sie diese Werte in Abhängigkeit von der Scan-Protokoll variieren.
5. Vor der Durchführung des ersten Zyklus zu kalibrieren Mikro-CT mit einem bildgebenden Phantom, das zwischen Luft, Wasser und Knochenstärke auszeichnet.
6. Zeigen vier Mäuse in Scanner in der Bauchlage mit zwei Mäusen auf der Oberseite und zwei auf der Unterseite. Ein Scanbett kann leicht unter Verwendung von 60 ml Spritzen, um die Maus Körper und 10 ml Spritzen als Bugspitzen halten gebaut werden. ²³
7. Pflegen Mäuse unter Anästhesie mit 2,5% Isofluran / Sauerstoff-Gemisch bei 1-2 l pro min.
8. Bild Scout mit sicher, dass der gesamte Schädel der Maus, von der Nase zum ersten Halswirbel und von der Oberseite des Schädels auf Basis skull, abgebildet wird.

4. Mikro-CT-Analyse

1. Öffnen Sie die rekonstruierten Bilder mit einem Mikro-CT-Bildanalyse-Software, die die Erstellung von Regions of Interest erlaubt (ROI) durch Auswahl Voxel mit Schwellenwerten für Pixelintensität. Software ermöglicht auch Erstellung von 3D-Oberflächen durch die Interpolation der ausgewählten Voxel und für Volumenanalyse.
2. Beginnen Sie mit dem Laden der rekonstruierten CT-Bilder in zweidimensionalen (2D) koronalen, axiale und sagittale Ansichten. (2A)
3. Mit der axialen Schicht als Leitfaden, navigieren Sie zum Sagittalscheibe, die auf der äußersten linken Aspekt der Fetttransplantat entspricht. Wählen Sie eine obere und untere Schwelle für Pixel-Intensität, die alle Voxel, die der Fetttransplantat erfasst, sondern dass das umliegende Gewebe und Knochen ausschließt. (2B)
4. Definieren Sie eine ROI in der sagittalen Ansicht, die zur Fetttransplantat mit zuvor definierten Pixelintensitätsschwellen entspricht. REPEAT diesen Vorgang bei jedem fünften Sagittalscheibe, navigieren, bis die am weitesten rechts Aspekt des Transplantats erreicht ist. (2C)
5. Interpolieren ausgewählten Voxel aus allen 2D-ROIs in einem einzigen, kombinierten 3D-ROI. (2D)
6. Record ROI Volumens durch die Software berechnet.
7. Rendern Sie die 3D-Isofläche um den endgültigen Fetttransplantat Volumen zu visualisieren. (2E)
8. In weiteren Analysen, lesen Sie die Pixelintensität maximale und minimale Grenzwerte dieselbe wie die für die Analyse der Ausgangssituation verwendet zu halten.

5. Fett Ernte

1. Nach Mäusen haben für die Woche 8 ^24,25 Zeitpunkt gescannt wurden, betäuben die Mäuse wie bereits oben in den Schritten von 2,2 bis 2,4 und 2,17 bis 2,19 beschrieben.
2. Nach APLAC Richtlinien, einschläfern die Mäuse durch ihre Wirbelsäule trennt.
3. Zeigen Maus im operativen Bereich. Mit Tenotomie Schere, öffnen Sie vorsichtig die Tasche und sezieren ter darüber liegende Haut und Bindegewebe Anhänge aus der Fetttransplantat.
4. An diesem Punkt kann es helfen, einen Patch der darüber liegenden Rückenhaut herausschneiden, um bei der Extraktion des Transplantats zu erleichtern. (3A)
5. Leicht zu halten Traktion auf das Transplantat mit einer Zange und drehen Transplantat von Seite zu Seite, um aufeinanderfolgende Punkte der Spannung, die mit einer Schere gelöst werden müssen visualisieren.
6. Bleiben, da in der Nähe des Transplantats wie möglich, wenn das Ausschneiden, das Bindegewebe mit dem Transplantat entnommen minimieren. (Figur 3B)
7. Nach dem Herausschneiden Transplantat, messen Masse auf eine austarierte Waage, die genau auf mindestens 0,01 Gramm ist.
8. Berechne das Volumen des Fettes Transplantat unter Verwendung der gemessenen Massenwertes und der durchschnittlichen Dichte von menschlichem Fett (0,9 g / ml) als Umwandlungsrate.
9. Vergleichen berechnete Volumen von Fetttransplantat an, dass mit Mikro-CT erhalten.
10. Fett-Transplantate können für die Histologie oder weiteren Analyse bei Bedarf bearbeitet werden.

Ergebnisse

Fat Transplantate schrittweise verringert Volumen im Laufe der Studie, was 62,2% durchschnittliche Überlebenszeit von Woche 8 (4A) ²⁴ Bei der Vollendung der Woche 8 Scan wurde jede Fetttransplantat in einem Stück extrahiert. Ein Wilcoxan Rangsummentest wurde verwendet, um den Unterschied zwischen Volumenmessungen von beiden Mikro-CT-bezogen oder von physischen Massen berechnet Fetttransplantate zu vergleichen. Kein signifikanter Unterschied zwischen diesen beiden Methoden (beidseitiger p<...

Diskussion

Bis zu diesem Zeitpunkt haben die meisten Forscher auf nicht-bildgebenden Verfahren geltend gemacht, um die langfristige Überleben von Fett Transplantate zu quantifizieren, aber diese Methoden das Opfer der Studie Tier-und ergeben nur eine einzelne Messung. ^3,10-12 Unsere Studie stellt eine verbesserte Analyseverfahren, die objektiv, Echtzeitquantifizierungs Fett Transplantatüberlebens in einem Maus-Modell ermöglicht.

Kritisch bei diesem Verfahren sicherzustellen, dass ausreichend...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
SAL Lipoaspirat-Zentrifuge
	Beckman Coulter, Inc., Pasadena, CA
50 ml konische Röhrchen	BD Biosciences, San Jose, CA
CD-1 Nacktmäuse (Crl:CD1-Foxn1nu)	Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA
Isofluran	Henry Schein, Dublin, OH
2,5 % Betadin	Purdue Pharma, L.P., Stamford, CT
70 % Ethanollösung	Gold Shield, Hayward, CA
1cc Luer-Lock-Spritze	BD Biosciences, San Jose, CA
14-Gauge-Kanüle	Shippert Medical, Centennial, CO
Pinzette	Fine Science Tools, Heidelberg, Deutschland
Tenotomieschere	Fine Science Tools, Heidelberg, Deutschland
6-0 Nylon-Naht	Ethicon, Blue Ash, OH
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Gibco, Carlsbad, CA
Mikro-CT-Scanner	Siemens Healthcare, Pleasanton, Kalifornien
Phantom	TriFoil Imaging, Northridge, CA
Bildgebende Analysesoftware	IRW, Siemens Healthcare, Pleasanton, CA
Scale	Mettler-Toledo International, Inc., Columbus, OH