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Methodenartikel

Nährstoff Verordnung durch kontinuierliche Zufuhr für eine groß angelegte Expansion von Mammalian Cells in Sphäroiden

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DOI:

10.3791/52224

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25. September 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Radiology, University of Minnesota, 2Medicine, University of Minnesota, 3School of Public Health, University of Minnesota, 4Surgery, University of Arizona

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Nährstoffregulierung durch kontinuierliche, wachstumsangepasste Fütterung verbessert die Wachstumsraten von Säugetierzell-Sphäroiden im Vergleich zur intermittierenden Chargenfütterung für Kulturen in gerührten Suspensionsbioreaktoren. Diese Studie zeigt die Methoden, die für die Etablierung einfacher Kulturen mit angepasstem Zinssatz erforderlich sind.

Zusammenfassung

In dieser Demonstration wurden Sphäroide, die aus der β-TC6-Insulinom-Zelllinie gebildet wurden, als Modell für die Herstellung eines Säugetier-Inselzellprodukts kultiviert, um zu demonstrieren, wie die Regulierung des Nährstoffgehalts die Zellausbeute verbessern kann. In früheren Studien ermöglichten Bioreaktoren ein erhöhtes Kulturvolumen im Vergleich zu statischen Kulturen, aber es wurde keine Steigerung der Zellausbeute beobachtet. Einschränkungen bei wichtigen Nährstoffen wie Glukose, die zwischen den Chargenfütterungen konsumiert wurden, können zu Einschränkungen bei der Zellexpansion führen. Trotz des Anstiegs der Glukosekonzentrationen in den Medien wurden große Schwankungen der Glukosespiegel beobachtet. Die Verwendung von kontinuierlichen Fütterungssystemen eliminierte Schwankungen des Glukosespiegels und verbesserte die Zellwachstumsraten im Vergleich zu chargengefütterten statischen und SSB-Kulturmethoden. Zusätzliche Steigerungen der Wachstumsraten wurden beobachtet, indem die Fütterungsrate auf der Grundlage des berechneten Nährstoffverbrauchs angepasst wurde, was die Aufrechterhaltung der physiologischen Glukose über drei Wochen in Kultur ermöglichte. Diese Methode kann auch für andere Zelltypen adaptiert werden.

Einleitung

Um eine große Zahl von lebensfähigen und funktionellen humanen Zellen für eine Transplantation zu erzeugen, die Regulierung der Kulturbedingungen ist zwingend notwendig. Depletion von Nährstoffen sowie Anhäufung von Stoffwechselschlacken sind die Hauptursachen von Seneszenz und metabolischen Veränderungen, die die Qualität des Zellprodukt 1 reduzieren - 3. Dieses Verfahren veranschaulicht ein Verfahren zur Kultur von Säugerzellen in Sphäroide einen gerührten Bioreaktor mit einer eingestellten Rate Perfusion Zuführsystem Glukose zu regulieren in einem physiologischen Bereich 4 während der gesamten Dauer der Kultur kombiniert werden. Für den Zweck dieser Studien wurde die physiologischen Bereich zwischen 100 und 200 mg / dl definiert. Die gleichen Verfahren können verwendet werden, um andere Nährstoffe und Stoffwechselschlacken regulieren wie Lactat.

Statische Kulturen in kleinen Mengen (1 bis 30 ml) werden typischerweise in der Laborumgebung verwendet zu erhalten und Zelllinien für Experime differenzierenntal Zwecke. Zell Passagierung wird mit vollständigem Medium Änderungen durchgeführt, wie in regelmäßigen Abständen erforderlich. Die meisten "konventionellen" Kulturmedium hat eine hohe Glukosekonzentration (450 mg / dl für DMEM in diesen Studien verwendet) für weniger häufigen Medienwechsel, ohne das Risiko von Nährstoffbegrenzungen zu ermöglichen. Allerdings ist diese batch-Einspeisung Verfahren erfordert noch häufige Manipulation führt Variabilität in der Zellumgebung und erhöht das Risiko einer Kontamination von 5 bis 9. Gerührte Suspension Bioreaktoren (SSB) eine bessere Durchmischung sorgen und verringerte 3,10 Handhabung - 20, aber wie statische Kulturen, erfordern eine manuelle Medium Änderungen, die potenziell schädlichen Schwankungen Nährstoff- und Abfallprodukt Niveaus beitragen. Perfusions-Fütterung von SSB Kulturen reduziert diese Probleme durch eine kontinuierliche Infusion und Entfernung von Medium, aber große Veränderungen in der Nährstoffgehalt aufgrund des Zellwachstums bleiben ein Problem. Die Verwendung einer angepassten Fütterung rate aus Berechnungen der Nährstoffnutzung auf Basis der geschätzten Zell Anforderungen können die stabilen Zellumgebung bieten erforderlich die Lebensfähigkeit der Zellen zu optimieren und Funktion 21-24.

Es gibt eine große Menge an Literatur beschreibt Methoden für skalierbare SSB Kulturen von Säugetierzellen spezifisch für Kultur und Expansion von pluripotenten Zellen 25 - 32, mit anderen auf Insel konzentriert (beta) Zellen 17,33,34, oder die Produktion von biologischen Produkten 24, 35-38. Viele dieser untersuchten Zelltypen können in Sphäroid-Kulturen und spezifische Verfahren für den Zelltyp sollte die Implementierung einer kontinuierlichen Zuführungssystem vor optimiert werden verwendet wird gezüchtet werden. In dieser Demonstration wurde eine Perfusion Fütterungsmethode verwendet , um eine Beta - Zelllinie als Sphäroiden in einem gerührten Bioreaktor 39 gewachsen zu erweitern - 43. Das hier beschriebene Verfahren stellt eineinfache Implementierung Kursanpassungen der Fütterung auf Basis von Messungen off-line Glucose gezielte Kulturbedingungen zu erreichen. Einstellen der Vorschubgeschwindigkeit mit dieser Methode eine physiologische Zuckerspiegel aufrecht zu erhalten ist zu einem Anstieg Zellausbeuten gezeigt. Säugerzellen sind abhängig von einem Schlüsselnährstoff, Glukose, für die Energieproduktion, so dass die Verwendung dieser Zelllinie stellt ein Modell für viele kultivierten Säugetierzellen 44. Darüber hinaus beispielhaft für diese Linie die weitere Komplexität der Beta - Zellen, die Glukose zu chronisch hohen Niveaus von 45 empfindlich sind. Für diese Studie wurden β-TC6 Zellen erlaubt Sphäroide in der Kultur zu bilden , die durchschnittliche Größe der Langerhans'schen Inseln in vivo zu approximieren. Die Perfusionsbioreaktorsystem System 17 - 19,21,46 mit einer Vorschubgeschwindigkeit eingestellt Verbrauch zu Glukose, führte zu physiologischen Bedingungen zu erhalten und höhere Zellausbeuten ohne Veränderungen der Lebensfähigkeit.

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Protokoll

1. Zelllinie und Wartung

  1. Erhalten β-TC6-Zellen (oder eine andere gewünschte adhärenten Säugerzelllinie). In Vorbereitung auf die Studie, Kultur, Passage und kryokonserviert werden die Zellen nach Anbieter Anweisungen.

2. Setzen Sie die kontinuierliche Fütterungssystem

HINWEIS: Die kontinuierliche Zuführung Systemdesign in der folgenden Methode wurde basierend auf ähnlichen Systemen in der Literatur beschrieben 17 - 19,21,47 - 49. Montage des Systems hier verwendet , ist im Detail in einer früheren Veröffentlichung 3 beschrieben.

  1. Sammeln Sie die Komponenten für das Fütterungssystem benötigt, das aus fünf Hauptkomponenten besteht: ein Mittelreservoir, peristaltische Pumpe, gerührten Bioreaktor, Abfallbehälter und kundenspezifische Schläuche / Probenentnahmeset.
    1. Stellen Sie den Medienspeicher ein 1 l Glasflasche mit, die Abfallbehälter einen 2 l Glasflasche mit, und die stirred Bioreaktor mit einem Volumen von 250 ml-Glasreaktor (aus dem Regal-Version) verwenden.
    2. Verwenden Sie eine digitale peristaltische Pumpe oder eine ähnliche Pumpe ist mit einem 8-Kanal Pumpenkopf Trägeraustausch zu steuern.
    3. Herstellung des Reservoirs und modifizierte Bioreaktor Deckel aus harten und autoklavierbaren Kunststoff mit Edelstahlrohr-Pass-Through-Ports Belüftung durch sterile Filter zur Verfügung zu stellen, und ermöglichen es für den Mitteltransfer zwischen Behälter und Bioreaktoren. Alternativ kaufen spezielle Deckel mit Flussöffnungen von verschiedenen Anbietern.
      HINWEIS: Der Bioreaktor Deckel zusätzliche Durchgangs Ports für optionale Mess- und Überwachungssonden (zB Sauerstoffmonitor) enthalten.
    4. Befestigen eines Abflußrohr (OT), hergestellt aus porösem Glas Belüftungsrohre mit einer mittleren Porengröße im Bereich von 40 um bis 60 um und einer Porendichte von 40% auf dem modifizierten SSB Deckel. Alternativ wählen Sie einen anderen Abfluss Rohr auf die spezifischen Anforderungen der Kultur basiert.
      HINWEIS: Wählen Sie dieOT Porengröße nur Medium und Zelltrümmer, so dass Zellaggregate in der Kultur zu entfernen (wie 3 für weitere Details in Abschnitt 6 und Veröffentlichung beschrieben).
  2. Montieren Sie autoklavierbar Infusionsschlauch-Sets aus Polyvinylidenfluorid (PVDF) Schlauchverbinder und dauerhafte Schlauchpumpen. Die Länge des Abschnitts ist abhängig von dem Abstand zwischen den verschiedenen Komponenten.
    HINWEIS: Seien Sie besonders vorsichtig, wenn Sie Schlauch Vielfalt der Auswahl Haltbarkeit und Zuverlässigkeit für die Langzeitversuche zu gewährleisten.
  3. Montieren Sie den Schlauchsatz aus drei Teilen: eine Zuleitung, eine Abwasserleitung, und eine Probenleitung.
    1. Montieren Sie die Zuleitung mit zwei Schlauchdurchmesser (L / S 14 und L / S 13). Verwenden Sie die L / S 14 für den primären Schlauch, der den Abstand aus dem Bioreaktor zu dem Medienspeicher erstrecken wird, und legen Sie eine kurze Länge von L / S 13 in der Mitte der Rohrlänge für den Pumpenteil die entsprechenden PVDF Adapter verwenden.
    2. Verwenden Sie Standard-PVDF Schlauch-Widerhaken tubing Adapter zwei Stücke von L / S 14 Schläuche auf beiden Seiten der kürzeren Pumpenabschnitt (L / S 13) Schläuche zu verbinden.
      HINWEIS: Alternativ dazu könnte die gesamte Rohrlänge sein kleinerem Durchmesser L / S 13 Schläuche, und die gesamte Schlauchlänge ersetzt werden könnte, wenn die Pumpe Schnitt Integrität in Frage.
  4. Montieren Sie den zweiten Rohrabschnitt für die Abfallentsorgung mit größerem Durchmesser (L / S 16) Schläuche und legen Sie einen kurzen Abschnitt der L / S 14 Schlauch in der Mitte für den Pumpabschnitt. Dies wird in der gleichen Weise wie die Zuleitung Montage PVDF Schlauch-Stachel-Adapter verwenden oder alternativ eine kontinuierliche Länge des gewünschten Pumpenschlauchgröße verwendet und ersetzen, wie gebraucht.
    HINWEIS: Wenn die gleiche Pumpe und Pumpenkopf für die Speiseschaltung und dem Abfallkreislauf, der Pumpenabschnitt der Abfallbeseitigung Rohrleitungen verwendet werden, müssen einen größeren Durchmesser als der Pumpenabschnitt der Zufuhrleitung sein. Dies stellt sicher, daß die Entfernung Pumprate schneller ist als die Vorschubgeschwindigkeit, und wird die potent vermeidenial für große Änderungen in der Kulturvolumen und verringert das Risiko von Überlauf.
  5. Bauen Sie die letzte Komponente des Schlauchsets: eine Probe Sammelanordnung.
    1. Dieses Verfahren beschreibt eine benutzerdefinierte Portsystem montiert Abtasten; alternativ kann eine sterile Probenahmeport von verschiedenen Anbietern erworben werden.
    2. Konstruieren Sie den Satz von drei kurzen (~ 6 cm) L / S 14 Schlauchlängen verbunden zusammen mit einem T-Typ PVDF-Anschluss und zwei kleine Schlauchschellen an zwei der Schlauchlängen.
    3. Befestigen eines sterilen Gasfilter für Gasentlüftungs einem der geklemmten Längen und die andere zur Verbindung mit einem sterilen Probenspritze verwendet wird (sterile Gasfilter müssen in einem bio-Sicherheitsschrank nach der Sterilisation so viele Sterilfilter hinzugefügt werden, sind nicht autoklavierbar).
    4. Verbinden die dritte Ende mit einem Edelstahl-Probenanschluss auf dem Deckel des Bioreaktors befestigt.
    5. Autoclave die Sampling-Baugruppe, während vor dem Beginn mit dem Bioreaktor verbundenDas Experiment (siehe 3 unten zu Schritt).
    6. Verwenden Sie diese Montage sterile Proben aus dem Bioreaktor zu sammeln, wie, ohne die kontinuierliche Zufuhr Prozess benötigt.

3. Autoklav Alle Materialien

  1. Bereiten Sie alle Bioreaktor Komponenten für die Dampfsterilisation.
  2. Sammeln Sie einzelne Komponenten für die Sterilisation. Medium und Abfallreservoirs (zusammengesetzt aus Schritt 2.1.1), 250 ml Spinnerflasche (ab 2.1.1 montiert), notwendig modifizierte Deckel (zusammengesetzt aus 2.1.3), Abflussrohr (beschrieben in 2.1.4), drei Schlauchsets ( in den Abschnitten 2.2 through2.5), Abflussrohr montiert (wie für kontinuierliche Beschickung erforderlich).
    1. Montieren Sie Spinnerflasche mit allen Komponenten und sicherzustellen, dass das Ablassrohr fest im Rotationskolben angebracht ist (in Abschnitt 2.1.4 beschrieben), und befestigen Sie den benutzerdefinierten montierten Probenanschluss (Abschnitt 2.5) oder eine andere Sampling-Anschluss an die Oberseite des Deckels .
    2. Wickeln Sie das gesamte Rührflasche Montage mit Autoclave Verpackungsmaterial und Autoklaven anzeigendes Band. Achten Sie darauf, dass die Umhüllung luftdicht. HINWEIS: Aluminiumfolie oder ähnlichem Material können die einzelnen Enden jeder Zugangsöffnung in dem Bioreaktor Deckel zur Abdeckung verwendet werden, die Sterilität des Verbinders zu bewahren / endet, wenn Abwickeln und wenn nicht mit den Schlauchsets im Inkubator.
    3. Montieren Sie die modifizierten Deckel des Mediums und Abfallbehälter und dann an die jeweiligen Glasflaschen befestigen. Cover sie Aluminiumfolie und Autoklaven anzeigendes Band.
    4. Individuell wickeln Sie die Schlauchsets (Abschnitt 2,2-2,5) mit Autoklaven wickeln und Band in der Endmontage zu unterstützen. Aluminiumfolie oder ähnlichem Material können die einzelnen Enden jedes Rohr Sterilität des Verbinders zu erhalten gesetzt zu wickeln verwendet werden / endet, wenn auspackt.
    5. Autoclave alle verpackt werden ein Standard - Trocken Autoklavzyklus (zB "Gravity" Einstellung mit ~ 15 psi bei 121 ° C für 30 Minuten oder mehr).
      HINWEIS: Verwenden Sie nicht steril befestigenFilter vor dem Autoklavieren, wenn sie nicht bestätigt werden Autoklav sicher zu sein.

4. Sphäroidformation

ANMERKUNG: Diese Technik , die den in der Literatur beschriebenen ähnlich ist , 17 - 19,21,50 - 52 für andere Säugetier - Zellkulturen. Alle Verfahren nach der Sterilisation sollte in einer Laminarbox durchgeführt werden und unter Verwendung von sterilen Handschuhen sterilen Bedingungen für die Zellkultur aufrecht zu erhalten.

  1. Für alle Bedingungen, die Kultur und erweitern β-TC6 Zellen in Standard-adhärente Kulturen (nach Hersteller beschrieben), bis ausreichende Zellmengen erhalten die gewünschte Anzahl von Bioreaktoren zu impfen.
    1. Bauen Sie die kontinuierliche Zuführung Bioreaktor mit Abflussrohr , wie in Abbildung 1 und beschrieben in Abschnitt 2 gezeigt und Probenanschluss zu Probenahme Deckel verbinden. HINWEIS: Die Abflussrohr und Probenahme-Baugruppe sollte der Bioreact hinzugefügt werdenoder für die kontinuierliche Beschickung vor der Sphäroidbildung, und sollte aus dem Kulturmedium gezogen werden, bis kontinuierliche Zuführung gestartet.
    2. Sterilisieren Sie die modifizierte SSB Montage von Autoklaven (beschrieben in Abschnitt 3).
    3. Bringen Sie sterile Lüftungsöffnungen (0,22 & mgr; m oder kleiner Sterilfilter) an die entsprechenden Stellen auf den Deckeln der Spinnerflasche und Medium und Abfallbehälter.
      ANMERKUNG: Dies ist wichtig , Dampfsperre zu verhindern, und der Gasaustausch zwischen dem Inkubator (5% CO 2) Umwelt und den Bioreaktor zu ermöglichen. Der Gasaustausch notwendig ist, den richtigen pH-Wert zu halten, wenn bikarbonatgestützte Medien.
  2. Sammle die Zellen durch vorsichtiges Trypsinisierung unter Verwendung von 0,25% (w / v) Trypsin - 0,53 mM EDTA - Lösung, bei Raumtemperatur durch mechanisches Rühren Aided für 2 - 3 min und Samen in Bioreaktoren mit einer Dichte von etwa 1,3 x 10 6 Zellen / ml in 200 ml Kulturmedium.
    1. Bewegen Sie bezeichneten Kolben aus dem Inkubator undin ein Bio-Sicherheitsschrank.
      HINWEIS: Alle Zellkultur und Manipulationen sollten in einem Bio-Sicherheitsschrank unter Verwendung geeigneter steriler Technik erfolgen.
    2. Entfernen Kulturmedium aus den Kolben durch Absaugen.
    3. Waschen Zellen durch Pipettieren von 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (ohne Ca ++ oder Mg ++), in den Kolben und über die Zellen auf der Oberfläche gespült und dann auf die PBS anzusaugen.
    4. 3 ml Trypsin-EDTA - Lösung in jeden Kolben , die ( in der Regel etwa 10x 175 cm 2 T-Kolben) gesammelt werden.
    5. Lassen Sie geernteten Zellen für 2 bei Raumtemperatur inkubiert - 3 min in der Bio-Sicherheitsschrank.
    6. Agitieren vorsichtig von Hand Zellen aus Flaschenoberfläche zu lösen, und sammle die Zellen durch Zugabe von 6 ml Kulturmedium (mit Serum) in den Kolben, und übertragen die Zellen in ein 50 ml Röhrchen. Wenn ein 50-ml-Röhrchen voll ist, eine weitere 50-ml-Röhrchen verwenden, bis alle benötigten Zellen gesammelt wurden (etwa ein 50-ml-Tube für jeweils 5 T-175-Kolben benötigt werdengesammelt).
    7. Zentrifuge vorsichtig (ca. 50 x Schwerkraft) die gesammelten Zellsuspensionen, die Zellen zu pelletieren.
    8. Saugen Sie das restliche Medium verlässt das Pellet intakt.
    9. Sammle alle Zellen in einem einzelnen Rohr durch erneutes Suspendieren der Pellets in Kulturmedium (mit Serum) mit einer Pipette, und Transferieren alle Pellets in dem gleichen Röhrchen.
    10. Zählen Sie die Zelldichte einen Standard Hemocytometer mit Trypan - Blau - Färbung , wie in der Literatur 53 beschrieben.
    11. Hinzufügen gewünschte Anzahl von Gesamtzellen SSB für jede Bedingung zu steril (1,3 x 10 6 Zellen / ml war die gezielte Ausgangszelldichten für diese Demonstration).
    12. Hinzufügen Medium (mit der gewünschten Glukosekonzentration, in diesem Fall wir Medium Glucosespiegel im physiologischen Bereich verwendet), um eine Pipetten SSB mit der gewünschten Gesamtkulturvolumen zu erreichen (200 ml Kulturvolumen für diese Studien verwendet wurde).
      HINWEIS: Für diese kontinuierlich gefüttert SSB die cu studiert ltures wurden ausgesät eine modifizierte "low-glucose" Version des Kulturmediums (100 mg / dl) gemessen. Dadurch konnten die Kulturen eher an der gewünschten Zielglucosekonzentration zu beginnen, als mit einem "High-glucose" Medium starten und warten auf den Glukoseverbrauch der Glukosespiegel nach unten in den physiologischen Bereich zu bringen Fütterung zu beginnen. Alle anderen Mittel für die in diesen Studien verwendet Einspeisen den Standard "high-glucose" Medium (500 mg / dl).
    13. Bewegen Sie SSB mit Zellen auf einer Rührplatte in einer Zellkultur-Inkubator.
  3. Kulturzellen in den Bioreaktoren ohne bei 37 ° C für 3 Tage zugeführt wird , mit 5% CO 2, 100% relative Luftfeuchtigkeit und einer Rührgeschwindigkeit von 70 Upm Sphäroide zu ermöglichen zu bilden.
    HINWEIS: Keine signifikante Proliferation sollte während der dreitägigen Sphäroidformation Zeitraum beobachtet werden.
  4. Nach Sphäroidformation, teilen Sphäroiden unter Bioreaktoren mit den gewünschten Kulturbedingungen.
le "> 5. kontinuierliche Zufuhr Kultur und eingestellte Vorschubgeschwindigkeit

  1. unter Verwendung von sterilen Techniken (- 4 Schritte 2) Autoklaven oder in Gas alle Komponenten zu sterilisieren, und in einem biologischen Sicherheitsschrank montieren.
  2. Nach Sphäroidbildung, das SSB aus dem Inkubator entfernen und die Komponenten für die kontinuierliche Zuführungssystem in einem biologischen Sicherheitsschrank montieren.
    1. Zuerst füllen Sie das frische Mittelreservoir mit dem gewünschten Kulturmedium, und dann auf eine Seite der Zuleitung zu verbinden. Achten Sie auch darauf, dass das frische Medium Reservoir ordnungsgemäß mit einem Sterilfilter entlüftet wird.
    2. Verbinden der einen Seite der Zuleitung zu der Zufuhreinlassöffnung auf dem Bioreaktor in einer sterilen Weise. Ein Sterilfilter sollte zwischen der Speiseleitung und dem Bioreaktor Einlassöffnung zu filtern, um das Medium installiert werden, bevor es in den Bioreaktor eintritt.
    3. Schließen Sie die Abwasserleitung in den Bioreaktor Abflussrohr und dem Medium Abfallbehälter, und sicherzustellen, dass die Abfallbehälter ordnungsgemäß mit einem steril entlüftetE-Filter.
  3. Bewegen Sie die Baugruppe aus dem biologischen Sicherheitsschrank (dies wird wahrscheinlich zwei Menschen verlangen, dass alle der Gefäße und Schläuche zu tragen), und setzen Sie alle Komponenten aus für Langzeitkultur.
    1. Setzen Sie die SSB auf der Rührplatte innerhalb des Inkubators die gleichen Kulturparameter für Sphäroidformation mit (37 ° C, 5% CO 2, 100% Luftfeuchtigkeit und 70 Umdrehungen pro Minute). Hinweis: Es kann erforderlich sein, die Schlauchsegmente aus dem Bioreaktor zu trennen, wenn die Leitungen durch Löcher in der Seite des Inkubators ausgeführt werden müssen, anstatt nach außen durch die Dichtung in der Tür. Dies kann durch Umwickeln der Enden der Schlauchsets mit Aluminiumfolie vor dem Autoklavieren (Schritt 3) in einem aseptischen Weise durchgeführt werden und warten, um die Bioreaktorseite der Zu- und Ablaufrohrabschnitte zu befestigen, bis der Bioreaktor im Inkubator ist. Die Rohrleitungen können in Kraft gesetzt werden, und die Aluminiumfolie kann innerhalb des Inkubators und schnell an dem Bioreaktor entfernt werden.
    2. Führen verbleibenden Enden der Schlauchsets (die, die nicht in den Bioreaktor Deckel verbunden) heraus durch den Inkubator Zugangsöffnung (pass-through) oder durch eine Einkerbung in dem Inkubator Türdichtung.
    3. Außerhalb des Inkubators (in einem nahe gelegenen Biosicherheitsschrank wenn möglich), schnell die Zuleitung zum frischen Mittelreservoir zu verbinden, und die Abfallleitung zu dem Medium Abfallbehälter, und sicherzustellen, dass die Abfallbehälter ordnungsgemäß mit einem Sterilfilter entlüftet wird. HINWEIS: Um dies zu tun in einer aseptischen Weise, entfernen Sie die Aluminiumfolie aus dem Schlauch und Behälter-Anschlüsse und eine Verbindung zu den jeweiligen Schiffe so schnell wie möglich (vor allem, wenn diese Verbindung außerhalb des Biosicherheitsschrank getan werden muss).
    4. Setzen Sie frische Mittelreservoir (mit der gewünschten Fördermedium gefüllt) im nahe gelegenen Mini-Kühlschrank. Überprüfen Sie, um sicherzustellen, dass die Zu- und Ablaufleitungen der Lage sind, den Inkubator zu beenden und den Kühlschrank geben, ohne das Schließen an jeder der Türen verhindern. Es ist auch wichtig, dass die Vorschub lines nicht durch die Türen von entweder dem Kühlschrank oder dem Inkubator geschlossen gekniffen.
      HINWEIS: Das Medium für diese Studien verwendet wurde, war die Standard-Hoch Glucose (500 mg / dl) Kulturmedium durch den Anbieter für diesen Zelltyp empfohlen. Alle hohen Glucosemedium könnte auf die spezifischen Bedürfnisse der Zelltyp verwendet werden, die kultiviert wird. Die Glucosekonzentration des Fütterungsmediums sollte vernünftigerweise höher (2x oder mehr) sein, als die gewünschte Konzentration in der Kultur als das Zuführungssystem beruht, um die Vorschubgeschwindigkeit von hohen Glucosemedium auf die Erhöhung ausreichende Glucosespiegel in den Kulturen zu erhalten, während vernünftige Vorschübe Beibehaltung .
    5. Als nächstes kann die Abfallmittelreservoir auf der Tischplatte in einer günstigen Lage außerhalb des Inkubators gestellt werden.
    6. Als nächstes legen Sie die "Pumpenteil" der Zu- und Ablaufleitungen in den Pumpenkopf die richtige Ausrichtung zu gewährleisten, so dass die Zuleitungen Medium aus dem frischen Medium Reservoir in den SSB, und die Abfallleitungen pumpenwird Medium aus dem SSB und dem Abfallmedienspeicher zu pumpen.
  4. Schalten Sie die Pumpe auf den gewünschten Vorschubgeschwindigkeit.
    1. Berechnen Sie die Vorschubgeschwindigkeit Gleichung mit der eingestellten Vorschubgeschwindigkeit in der Literatur beschriebenen 3 und in der vorgesehenen repräsentativen Ergebnissen Abschnitt weiter unten.
    2. Verwenden, um die neuesten Informationen Zellzahl (Verfahren beschrieben in Schritt 5) zusammen mit dem Wachstumsvorhersage, und das Medium Glucose-Messungen, um die Vorschubgeschwindigkeit zu schätzen, um die gewünschte Glukosekonzentration in der Kultur zu erhalten.
      HINWEIS: Die Zellwachstumsraten und Glukoseverbrauch Raten müssen vor erhalten werden, um diese Verfahren zu tun.
    3. Stellen Sie die Pumpendrehzahl auf der Basis der berechneten Vorschubgeschwindigkeit.
  5. Wiederholen Sie die Berechnung der Vorschubgeschwindigkeit und stellen Sie die Pumpendrehzahl für jeden Probenpunkt (alle drei Tage für die beschriebene Methode).

6. Zellzahlen, Viability und Glucosekonzentration Messungen

  1. Die Proben werden von jedem Bioreaktor alle drei Tage, oder nach Wunsch.
  2. Nehmen Kulturproben von kontinuierlich zugeführt SSB Kulturen unter Verwendung der speziellen Probenanschluss oben beschrieben.
    1. Beim Verlassen des kontinuierlich zugeführt SSB innerhalb des Bioreaktors, befestigen Sie eine sterile Spritze (5 ml Volumen Spritze für diese Untersuchungen verwendet wurde), um ungefilterte Verbindung des Probenanschluss.
    2. Bewegen Sie das Probenrohr nach unten in das Kulturmedium.
    3. Ausspannen Rohrabschnitt an der Spritze geht, und ziehen Sie die Gesamtprobenvolumen gewünscht.
    4. Bewegen Sie das Probenrohr nach oben, so dass sie nicht mehr in die Kultur eingetaucht ist, und weiterhin die Spritze zurückzuziehen, bis Luft entfernt wird.
    5. Klemmen Sie den Schlauch, der die Spritze speist, und nehmen Sie die Spritze mit der Probe, und beiseite stellen.
    6. eine zweite frische sterile Spritze mit Luft Vorbelastung und auf den Sterilfilter Seite des Probenanschluss befestigen.
    7. Ausspannen Rohr an der Spritze Filterseite gehen vondie Sampling-Port und dann zu spülen, Probenanschluss, indem Sie vorsichtig die Luft in der Spritze durch den Sterilfilter Austreiben. Dadurch wird sichergestellt, dass die Probenahme-Port eines beliebigen Rest Medium klar sein wird.
    8. Re-Klemme das Rohr auf den Filter gehen, trennen Sie die sterile Spritze und entsorgen.
  3. Nehmen Sie die Spritze, die die Zellprobe aus der Kultur enthält, und vertreiben sie in einen 10-ml-Tube. Teilproben von bekannten Volumina können direkt aus diesem Rohr entnommen werden.
  4. Für Zellzahlen, ein bekanntes Volumen von Zellen zu entfernen und zu einem Mikrozentrifugenröhrchen übertragen und sanft Zentrifuge mit 1 - 2 Minuten (ca. 50 x Schwerkraft).
  5. Den Überstand in ein separates Röhrchen für Glukosemessungen und resuspendiere das Pellet mit dem gleichen Volumen von Trypsin-EDTA-Lösung (0,25% (w / v) Trypsin, 0,53 mM EDTA), und zählt in dreifacher Ausführung mit einem Standard-Hämozytometer mit Trypanblaufärbung in der Literatur beschrieben , wie 53.
    1. In Medium (mit Serum) zudie Probe zur Verdünnung nach Bedarf.
    2. Zählen Sie die Zellen, und berechnen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen durch die Aufnahme von Live (ungefärbten) Zellen, und tot (gefärbt) Zellen unabhängig (Lebensfähigkeit% = lebende Zellen / Gesamtzellen).
  6. Messen mittlere Glucosespiegel in dreifacher Ausfertigung ein Blutzuckermessgerät und den einmaligen Gebrauch Teststreifen verwendet wird.
    1. Nehmen Sie Glukosemessungen, wie durch die Zuckermessgerät Anweisungen Ersetzen des Kulturmediums für Blut beschrieben.
    2. Tauchen Sie den Teststreifen in dem Medium zu prüfen (gesammelt aus Zählung Proben oben), und wiederholen Sie für die gewünschte Anzahl von Wiederholungen (drei Wiederholungen werden empfohlen).
    3. Testen Sie sowohl das frische Medium und Abfallmedium für Glukosekonzentrationen.
      HINWEIS: Bei einigen Metern Messungen niedriger als 20 mg / dl (detektierbaren Schwellwert des Zählers), kann als ein Fehler in dem Zähler-Ausgang beobachtet werden.

7. Sphäroid Sinkgeschwindigkeit Messungen

  1. Um sicherzustellen, dass cell-Cluster sind nicht durch die kontinuierliche Zuführungssystem entfernt wird, messen die Absetzgeschwindigkeit von β-TC6 Sphäroide durch Beobachtung ihrer Sedimentation in einem großen Durchmesser Plastikpipette.
  2. Kultur β-TC6 Zellen in Bioreaktoren SSB Sphäroiden zu bilden, wie oben beschrieben.
  3. Nach 3 Tagen Kultur nehmen 30 ml-Proben der Sphäroid Suspension und in einen 50-ml-Tube.
  4. Pipettieren up sanft und unten einen breiten Durchmesser 25 ml Pipette gleichmäßig in Suspension zu verteilen, stoppen dann Pipettieren mit der Suspension in einem bekannten Niveau in der Pipette (zB 20 - ml - Markierung) und dann die Zeit für alle von den Sphäroiden aufnehmen zu 5 cm begleichen.
  5. Wiederholen Sie diesen Vorgang oft genug statistische Sicherheit zu erreichen (in der Regel n> 3).
    HINWEIS: Für biologische Studien, einem p-Wert von weniger als 0,05 wird als statistisch signifikant zu sein, wenn Messungen verglichen werden. Der Standardfehler des Mittelwerts wurde für die Berichterstattung Fehler verwendet, und die zwei nicht-paarigen Student-t-Test tailedwurde verwendet, um Bedingungen für die dargestellten Daten zu vergleichen.

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Ergebnisse

Medium Zuckerwerte und Schwankungen einschränken Zellexpansion in Standard - SSB Kulturen

Die Glucosespiegel schwanken in statischen Kulturen und SSB Kulturen auf der ganzen Kulturdauer 3. Diese Schwankungen intensivieren mit zunehmender Zellzahl während der 21-tägigen Züchtungsperiode und waren fast identisch in sowohl statische als auch SSB Kulturen. Diese Beobachtungen werden in unserer früheren Veröffentlichung 3 dargestellt. Die Gl...

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Diskussion

Erzeugen von Säugerzellprodukten für die Herstellung von biologischen Wirkstoffen und für die Zelltherapie erfordert die Kultur und Überwachung von Säugetierzellen in großem Maßstab 55-58. Außerdem rufen diese Anwendungen für die Kulturbedingungen definiert und validiert. Erhöhung einfach das Volumen der Zellen Forschungstechnologien werden alle diese Anforderungen nicht erfüllen. Manuelle Medium Änderungen Schwankungen an Nährstoffen und Anhäufung von Abfallprodukten reduzieren Zellqual...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren danken Michael Garwood und Sam Stein für ihre hilfreichen Kommentare und Kristen M. Maynard für ihre Unterstützung bei der Vorbereitung des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
β TC-6 ZellenATCC, Manassas, VACRL-11506Maus-Insulinom-Zelllinie (adhärenter Zelltyp)
DPBS Kein Ca, Kein MgInvitrogen, Carlsbad, CA14190-144https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144? ICID=search-14190144
Dulbecco's Modified Eagles MediumInvitrogen, Carlsbad, CAProduktnummern siehe unten 
DMEM mit hohem Glukosegehalt (500 mM)Invitrogen, Carlsbad, CA11965-092http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092
DMEM mit niedrigem Glukosegehalt (100 mM)Invitrogen, Carlsbad, CA11885-084http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (beachten Sie, dass dieses Medium bereits Pyruvat enthält)
L-GlutaminInvitrogen, Carlsbad, CA25030081http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081? ICID=Suche-Produkt
Natriumpyruvat-Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien11360070https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070? ICID=search-product
Hitzeinaktiviertes SchweineserumGibco - Life Technologies10082147http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147
Trypsin-EDTAInvitrogen, Carlsbad, CA25200056https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056? ICID=search-product
T-150 Mit Gewebekulturen behandelte KolbenCorning, Corning, NY430825http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences)
& categoryname=
NuAire Zellkultur-InkubatorPrinceton, MNUS Autoflow. Es kann jeder wasserummantelte CO2-regulierende Zellkultur-Inkubator verwendet werden.
ZentrifugeSorvall RT 7 (Jede ähnliche Tischzentrifuge kann verwendet werden)
KühlschrankJeder Laborkühlschrank kann verwendet werden (für diese Studien wurde eine kleine Tischversion verwendet)
1 L GlasflascheCorning, Corning, NY1395-1LJeder Anbieter kann verwendet werden. http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Biowissenschaften)
& categoryname=
L GlasflascheCorning, Corning, NY1395-2LJeder Anbieter könnte
250 ml gerührte Bioreaktoren verwenden Corning, Corning, NY4500-250http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Biowissenschaften)
& categoryname=
RührplatteFisher Scientific11-496-104AJede inkubatorsichere Rührplatte kann verwendet werden, jeder Anbieter
Gewebekulturschalen 100 mm DurchmesserNunc, Rochester, NY (Fisher Scientific)1256598 Jeder Anbieter kann verwendet werden (bestellt über Fisher Sci)
FALCON 50 ml konische RöhrchenFalcon, San Jose, CA1256598Jeder Anbieter kann verwendet werden
Delran Kunststoff Wird für kundenspezifische Teileverwendet McMaster CarrVerschiedenesJedes Material der Wahl kann verwendet werden, aber Deran wird gewählt, weil es autoklavensicher, nicht reaktiv und leicht zu bearbeiten ist. http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac
Edelstahlrohr für kundenspezifische DeckelMcMaster CarrVerschiedenesJeder Anbieter kann verwendet werden. http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91
Kundenspezifische modifizierte Delran Bioreaktordeckel für die kontinuierliche ErnährungSonderanfertigungenist mir kein Anbieter bekannt, der ein ähnliches Produkt herstellt
Kundenspezifische modifizierte Glasflaschendeckel für die kontinuierliche ErnährungSonderanfertigungenEinige Anbieter (z. B. , Fischer Sci, Corning) stellen ähnliche Produkte in den unten stehenden Links her.
Masterflex Digitale SchlauchpumpeCole Parmer, Vernon Hills, ILEW-77919-25Jede Präzisions-Schlauchpumpe kann verwendet werden. http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_
Cartridge_Pump_System_115_230
_VAC/EW-77919-25
PVDF Schlauchverbinder (diverse)Cole Parmer, Vernon Hills, ILsiehe Link JederAnbieter kann verwendet werden. http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium
_Luer_Fittings/55889
Pharmed BPT Tubing L/S 16Cole Parmer, Vernon Hills, ILWU-06508-16Jeder Anbieter kann verwendet werden. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
_L_S_13_25/WU-06508-16
Pharmed BPT Tubing L/S 14Cole Parmer, Vernon Hills, ILWU-06508-14Anbieter kann verwendet werden. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
_L_S_13_25/WU-06508-14
Pharmed BPT Tubing L/S 13Cole Parmer, Vernon Hills, ILWU-06508-13Jeder Anbieter kann verwendet werden. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
_L_S_13_25/ WU-06508-13
Millipore Millex GP PES-Membran 0,22 µ l Steriler Spritzenvorsatzfilter (zur Entlüftung und Mediumfiltration)Fisher ScientificSLGP033RSJeder Anbieter kann verwendet werden
25 ml GraduiertpipetteFisher Scientific13-678-11Anbieter kann verwendet werden, und es können verschiedene Größen verwendet werden
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HämozytometerFisher Scientific02-671-6Jedes Produkt eines Herstellers oder eines ähnlichen Produkts kann verwendet werden
Trypan BlueGibco - Life Technologies15250-061kann ein beliebiges Produkt eines Herstellers oder eines ähnlichen Produkts verwendet werden. https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061
InverslichtmikroskopLeicaJedes Produkt eines Herstellers oder eines ähnlichen Produkts kann verwendet werden
One Touch Ultra BlutzuckermessgerätFisher Scientific22-029-293Jedes Produkt kann verwendet werden (z. B. , Bayer)
One Touch Ultra-StripsFisher Scientific22-029-292 Es kann ein beliebiger Anbieter oder ein ähnliches Produkt verwendet werden (<>z.B. , Bayer)
2 Es Jeder Jeder Es

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