Die Steady-State-Level spezifischer mRNAs wird durch die Geschwindigkeit der Synthese und der Zerfall der mRNA bestimmt. Genomweite mRNA Abbauraten oder die Zerfallsraten spezifischer mRNAs kann durch Bestimmung mRNA Halbwertszeiten gemessen werden. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Messung der mRNA-Zerfallsraten in Saccharomyces cerevisiae.
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Methodenartikel
Die Messung der mRNA-Abbau Preise in
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
mRNA stationären Ebenen je nach Umgebungsbedingungen abhängig. Regulierung der stationären Aufstau einer mRNA stellt sicher, dass die korrekte Menge an Protein für die Zelle spezifische Wachstumsbedingungen synthetisiert. Ein Ansatz zum Messen der mRNA Zerfallsraten ist die Hemmung der Transkription und in der Folge der Überwachung des Verschwindens des bereits vorhandenen mRNA. Die Rate der mRNA-Zerfall kann dann quantifiziert werden, und eine genaue Halbwertszeit bestimmt werden kann unter Verwendung verschiedener Techniken. In S. cerevisiae, Protokolle, die mRNA Halbwertszeiten wurden entwickelt, messen und zählen Hemmung der Transkription der mRNA unter Verwendung von Stämmen, die ein temperaturempfindliches Allel von RNA-Polymerase II, rpb1-1 Hafen. Andere Techniken zum Messen mRNA-Halbwertszeiten umfassen Hemmung der Transkription mit Transkriptionsinhibitoren wie thiolutin oder 1,10-Phenanthrolin, oder alternativ durch Verwendung von mRNAs, die unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotorswie die Galactose induzierbaren Promotor und dem TET-off-System. Hier haben wir Messung S. beschreiben cerevisiae mRNA Zerfallsraten mit Hilfe der temperaturempfindliche Allel von RNA-Polymerase II. Diese Technik kann verwendet werden, um mRNA-Zerfallsraten einzelner mRNAs oder genomweiten messen.
Einleitung
Die Transkription und Zerfall von spezifischen mRNA sind entscheidende Parameter der Genexpression. Die Rate der Synthese und Zerfall von spezifischen mRNAs bestimmt die Steady-State-Ebene des jeweiligen mRNA. Die stationären Mengen an mRNAs regeln die Fülle von mRNAs und bestimmen, wie viel von jeder mRNA zur Proteinsynthese zur Verfügung steht. Messungen der mRNA Halbwertszeiten werden in großem Umfang verwendet, um die Zerfallsrate von mRNAs zu bestimmen. Spezifische mRNAs Zerfall mit unterschiedlichen Raten, die sich auf Merkmale der mRNA, die die Funktion des Proteins von der mRNA und den Umgebungsbedingungen codiert verwandt sind. Abhängig vom verwendeten mRNA ....
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Protokoll
1. Wachstum von Hefezellen
- Wählen Sie die entsprechenden Hefestämme für die mRNA-Zerfall Leistungsmessungen genutzt werden. Um die Transkription zu hemmen mit dem temperaturempfindlichen Allel der RNA-Polymerase II, verwenden Hefe Stämmen, die das rpb1-1 Mutation 1. Erhalten dieses Hefestammes aus einem Labor, das bereits eine oder erzeugt es im Labor unter Verwendung von Standardverfahren, wenn eine spezifische genetische Hintergrund benötigt 9.
- Unter Einhaltung steriler Techniken vorzubereiten Hefe Medien Verwendung von Standardverfahren 10. Wenn keine Auswahl erforderlich ist, bereiten Sie Rich-Media w....
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Ergebnisse
Die Fähigkeit dieses Protokoll, um mRNA Zerfallsraten exakt zu messen, hängt von Hemmung der Transkription, die Ernte von Hefezellen zu den entsprechenden Zeitpunkten, und die Nutzung von RNase freien Techniken beim Extrahieren von RNA und Northern-Blotting. Probing für zwei Steuer mRNAs bekannt instabil und stabil zu sein, bzw. bietet Sicherheit, dass das Experiment funktioniert. Beispielsweise kann dies durch Sondieren mit einer Sonde, die sowohl das CYH2-prä-mRNA und mRNA erkennt erfolgen. 2B
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Diskussion
Hemmung der mRNA-Synthese und mRNA Überwachung Umsatz in der Abwesenheit von neuen Synthese ist ein Verfahren, das häufig verwendet wird, um die mRNA-Abbauraten zu messen. In S. cerevisiae, ist die Messung der mRNA Zerfallsraten durch Hemmung der Transkription unter Verwendung der temperaturempfindliche Allel von RNA-Polymerase II eine der am häufigsten verwendeten Methoden. Dieses Verfahren hemmt spezifisch die RNA-Polymerase II. Die wichtigsten Schritte zur Bestimmung von mRNA-Abbauraten mit dieser Technik si.......
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Offenlegungen
Die Verfasser erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Die Forschung im Labor des Autors wird vom Norman Hackerman Advanced Research Program des Texas Higher Education Coordinating Board und Start-up-Mitteln der Baylor University unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Hochgeschwindigkeitszentrifuge | Eppendorf | 22628169 | |
| Mini-Zentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Genescreen Plus Membran | PerkinElmer | 50-905-0169 | |
| Hybridisierungsofen | Fisher Scientific | 95-0030-01 | |
| Nanotropfen-Spektralphotometer | Thermo Scientific | ND-8000 | |
| Phosphorsieb | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-78 | |
| Typhoon Phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | 29004080 | |
| UV-Vernetzer | GE Healthcare Life Sciences | 80-6222-31 | Alternativ kann die Membran in einem auf 80° eingestellten Ofen für 1 Stunde gebrannt werden |
| NorthernMax Vorhybridisierungs-/Hybridisierungspuffer | Life Technologies | AM8677 | |
| Hefestämme mit der rpb1-1-Mutation | Hefestämme können aus einem Labor gewonnen oder mit einem bestimmten Hintergrund |
Referenzen
- Nonet, M., Scafe, C., Sexton, J., Young, R. Eukaryotic RNA polymerase conditional mutant that rapidly ceases mRNA synthesis. Mol. Cell. Biol. 7, 1602-1616 (1987).
- Santiago, T. C., Purvis, I. J., Bethany, A. J., Brown, A. J. The relationship between mRN....
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Nachdrucke und Genehmigungen
