Whole-Cell-Assay mit Bioreporter Burkholderia sartisoli RP037-MCHe wurde entwickelt, um Bruchteile einer organischen Verunreinigung (dh fluoren) nach den aktiven Transport von Myzelien Überbrückungsluftgefüllten Poren in einer wasser ungesättigten Modellsystem für bakteriellen Abbau verfügbar zu detektieren.
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Methodenartikel
Eine ganze Zelle Bioreporter Ansatz für Transport und Bioverfügbarkeit von organischen Schadstoffen in Wasser Ungesättigte Systeme Bewerten
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Bioverfügbarkeit von Schadstoffen ist eine Voraussetzung für ihren effektiven biologischen Abbau im Boden. Die durchschnittliche Massenkonzentration eines Kontaminanten ist jedoch kein geeignetes Maß für seine Verfügbarkeit; Die Bioverfügbarkeit hängt vielmehr von dem dynamischen Zusammenspiel des potentiellen Stofftransports (Flusses) einer Verbindung zu einer mikrobiellen Zelle und der Fähigkeit dieser ab, die Verbindung abzubauen, ab. In wasserungesättigten Teilen des Bodens haben Myzelien gezeigt, dass sie Einschränkungen der Bioverfügbarkeit überwinden, indem sie organische Verbindungen aktiv über einen Zentimeterbereich transportieren und mobilisieren. Während das Ausmaß des Myzel-basierten Transports mit chemischen Mitteln leicht quantifiziert werden kann, erfordert der Nachweis der Schadstoff-Bioverfügbarkeit für Bakterienzellen eine biologische Methode. Um diese Einschränkung zu beheben, wählten wir das PAK-Fluoren (FLU) als Modellverbindung und entwickelten einen wasserungesättigten Modellmikrokosmos, der eine räumlich getrennte FLU-Punktquelle und das FLU-abbauende Bioreporter-Bakterium Burkholderia sartisoli RP037-mChe durch ein Myzelnetzwerk von Pythium ultimum verbindet. Da der Bioreporter eGFP als Reaktion des PAK-Flusses auf die Zelle exprimiert, könnte die bakterielle FLU-Exposition und der Abbau direkt im Mikrokosmos mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) überwacht werden. CLSM- und Bildanalysen zeigten einen signifikanten Anstieg der eGFP-Expression in Gegenwart von P. ultimum im Vergleich zu Kontrollen ohne Myzel oder FLU, was auf die Bioverfügbarkeit von FLU für Bakterien nach Myzel-vermitteltem Transport hinweist. Die CLSM-Ergebnisse wurden durch chemische Analysen in identischen Mikrokosmen unterstützt. Der entwickelte Mikrokosmos erwies sich als geeignet, die Bioverfügbarkeit von Kontaminanten zu untersuchen und gleichzeitig die beteiligten Bakterien-Myzel-Wechselwirkungen sichtbar zu machen.
Einleitung
Boden ist dicht mit einer Vielzahl von Mikroorganismen, wie Bakterien 1,2 besiedelt. Jedoch Bedingungen in diesem Lebensraum sind anspruchsvoll, vor allem in Bezug auf die Verfügbarkeit von Wasser 3. Bakterien dauerhaft müssen für optimale Bedingungen in heterogenen Umgebungen 4 suchen, aber das Fehlen von kontinuierlichen Wasser Filmen führt zu eingeschränkter Mobilität 5 behindern sie frei verteilen. Auch sind Diffusionsraten von gelösten Stoffen (zB Nährstoffe) unter ungesättigten Bedingungen 6 gesenkt. So werden Bakterien und Nährstoffe oft physisch getrennt und Nährstoff Zugänglichkeit begrenzt ist ....
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Protokoll
1. Vorbereitung der Gerichte, Slides und Inkubationskammern
- Bereiten Sie das folgende Material für jeden Mikrokosmos: eine große Kunststoff-Petrischale unten (d = 10 cm), ein modifiziertes (siehe Schritt 1.2) kleine Kunststoff-Petrischale unten (d = 5 cm) mit Deckel und einer Zählkammer Rutsche mit drei Hohlräumen.
- Nehmen Sie die gewünschte Anzahl von Petrischale Unterteile (d = 5 cm). Entfernen Sie Teil der Rand mit einer Säge passgenau einen Schieber (26 mm Kantenlänge). Um das System zu sterilisieren, genießen Petrischale Böden und Deckel in 70% Ethanol O / N und trocknen Sie sie für mindestens 2 Stunden in einem Strom Schrank unter UV-Licht. ....
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Ergebnisse
Die hier vorgestellten Ergebnisse wurden bereits früher 15 veröffentlicht. Bitte auf den Artikel für detaillierte mechanistische und Umweltdiskussion verweisen.
Nach Bildaufzeichnung über CLSM kann ein Maximum Intensity Projection mit dem entsprechenden Mikroskop-Software oder ImageJ, um einen ersten visuellen Eindruck von der Probe und die Bedienelemente (Abbildung 2) zu gewinnen durchgeführt werden. Später können die Datensätze unterschiedlich, um sinnvolle Funk.......
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Diskussion
Die vorgestellte Mikrokosmos Setup als geeignet, um die Bioverfügbarkeit von räumlich getrennten Chemikalien abbauenden Organismen nach der Aufnahme und den Transport von Myzel zu studieren. Potenzielle Gasphasentransport von teilweise flüchtigen Verbindungen verhindert und bakterielle Bioreporter Zellen können ohne aufwändige Probenvorbereitung mit minimaler Störung des sensiblen System visualisiert und somit werden. Gleichzeitig kann die chemische Analyse der Probe leicht durchgeführt werden was eine gute Kontrolle de.......
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Offenlegungen
Die Verfasser erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Die Förderung durch die Deutsche Stiftung Umwelt (DBU) wird anerkannt. Die Autoren danken Ute Kuhlicke für die technische Hilfe bei der CLSM-Analyse und Birgit Würz, Rita Remer und Jana Reichenbach für die kompetente experimentelle Hilfe. Die Autoren danken insbesondere Prof. Jan Roelof van der Meer und Dr. Robin Tecon für die fruchtbare Diskussion und die Bereitstellung des Bioreporter-Stammes. Es beteiligt sich am Forschungsprogramm "Chemicals in the Environment" (CITE) der Helmholtz-Gemeinschaft.
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Materialien
Minimal Medium:Lösung 1Lösung 2Lösung 3Lösung 2td colspan="4">Lösung 3 (pH 6,0)
td colspan="4"> 100 ml + 25 ml + 5 ml ad. 1.000 ml aqua desttd colspan="4">
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Konfokalmikroskop | Leica | TCS SP5X, LAS AF - Version 2.6.1; oder gleichwertig CLSM | |
| GC HP 7890 Serie GC und Agilent 5975C MSD | Agilent | kann ein gleichwertiger GC/MS verwendet werden | |
| GC Kapillarsäule J& W 121-5522 | Agilent | ||
| Korkbohrer | Fisher Scientific | 12863952 | oder andere |
| Deckgläser | Marienfeld | 107222 | High Performance, No.1.5H |
| GC/MS insterts | WICOM | WIC 47080 | |
| GC/MS Fläschchen 2 ml | WICOM | WIC 41150 | |
| Deckel / Septen für Fläschchen mit Schraubverschluss | DIONEX | 49463 / 049464 | |
| Deckel für GC/MS-Fläschchen | WICOM | WIC 43948/B | |
| Objektträger | Menzel | gewöhnliche | |
| PDMS-beschichtete Glasfasern | Polymicro Technologies, Inc. | V (PDMS) = 13,55 ± 0.02 &Mikro; l m-1 | |
| Petrischalen klein / groß | Greiner | 633-102 / 628-102 | |
| Fläschchen mit Schraubverschluss 40 ml | DIONEX | 48783 | andere Glasfläschchen können verwendet werden |
| Fläschchen mit Schraubverschluss 60 ml | DIONEX | 48784 | andere Glasfläschchen können verwendet werden |
| Acenaphthylen d08 | Dr. Ehrenstorfer | C 20510100 | |
| Aceton | Carl Roth | 9372.2 | |
| Aktivkohle | Sigma-Aldrich | 242276-1kg | |
| Agarose | Carl Roth | 2267.4 | |
| Fluoren | Fluka | 46880 | |
| Kanamycinsulfat | Carl Roth | T832.2 | 50 mg L-1 |
| Methanol | Carl Roth | P7171< | |
| Lösung 1 | |||
| Ammoniumsulfat | Carl Roth | 3746.1 | 5 g L-1 |
| Magnesiumchlorid x 6 H2O | Carl Roth | 2189.1 | 1 g L-1 |
| Calciumnitrat x 4 H2O | Carl Roth | P740.1 | 0,5 g L-1< |
| Dinatriumphosphat | Carl Roth | P030.1 | 55,83 g L-1 |
| Monokaliumphosphat | Carl Roth | 3904.1 | 20 g L-1< |
| Dinatrium-EDTA | MERCK | 1084180250 | 0,8 g L-1 |
| >Eisen(II)-chlorid x 4 H2 | O MERCK | 1038610250 | 0,3 g L-1 |
| Cobalt(II)-chlorid x 6 H2O | Carl Roth | T889.3 | 4 mg L-1 |
| Mangan(II)-chlorid x 1 H2O | Carl Roth | 4320.2 | 10 mg L-1 |
| Kupfer(II)-sulfat | Carl Roth | P023.1 | 1 mg L-1 |
| Natriummolybdat x 2 H2O | Carl Roth | 0274.1 | 3 mg L-1 |
| Zinkchlorid | MERCK | 1088160250 | 2 mg L-1 |
| Lithiumchlorid | Carl Roth | P007.1 | 0,5 mg L-1 |
| Zinn(II)-chlorid x 2 H2O | Carl Roth | 4473.1 | 0,5 mg L-1 |
| Borsäure | Riedel-de-Haen | 11606 | 1 mg L-1 |
| Kaliumbromid | Carl Roth | A137.1 | 2 mg L-1 |
| Kaliumiodid | Carl Roth | 6750.1 | 2 mg L-1 |
| Bariumchlorid | Carl Roth | 4453.1 | 0,5 mg L-1 |
| MMA | Minimales Medium + Agarose 0,2% | ||
| Phenanthren d10 | Dr. Ehrenstorfer | C 20920100 | |
| Kartoffel-Dextrose-Agar: 24 g L-1 Brühe + Bacto-Agar 1,5%; pH 6,8 | |||
| Kartoffel-Dextrose-Brühe | Difco/ Beckton Dickinson | 254920 | |
| Bacto-Agar | Difco/ Beckton Dickinson | 214040 | |
| Natriumacetat x 3 hydr. | Carl Roth | 6779.1 | |
| Natriumsulfat | MERCK | 1066495000 | |
| Toluol | MERCK | 1083252500 | |
| mTY medium: 3 g L-1 Hefeextrakt, 5 g L-1 Bacto Trypton und 50 mM NaCl | |||
| Hefeextrakt | Merck | 1037530500 | |
| Trypton | Serva | 4864702 | |
| Natriumchlorid | Carl Roth | 3957.1 | |
| ImageJ mit logi tool plugin | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html und http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10 | ||
| Pythium ultimum Stamm 67-1 | Gewonnen aus dem Labor von Dr. Christoph Keel; Departement für Fundamentale Mikrobiologie, Universität Lausanne, Schweiz | ||
| Burkholderia sartisoli RP037-mChe | Gewonnen aus dem Labor von Prof. Jan Roelof van der Meer; Institut für fundamentale Mikrobiologie, Universität Lausanne, Schweiz |
Referenzen
- Holden, P. A., Fierer, N. Microbial processes in the vadose zone. Vadose Zone Journal. 4, 1-21 (2005).
- Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The unseen majority. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6578-6583 (1998).
- Kieft, T. L....
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Nachdrucke und Genehmigungen
