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Methodenartikel

Eine ganze Zelle Bioreporter Ansatz für Transport und Bioverfügbarkeit von organischen Schadstoffen in Wasser Ungesättigte Systeme Bewerten

10.1K Aufrufe

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DOI:

10.3791/52334

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24. Dezember 2014

 ,  ,  , 
1Department of Environmental Microbiology, Helmholtz Centre for Environmental Research - UFZ, 2Department of River Ecology, Helmholtz Centre for Environmental Research - UFZ

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Whole-Cell-Assay mit Bioreporter Burkholderia sartisoli RP037-MCHe wurde entwickelt, um Bruchteile einer organischen Verunreinigung (dh fluoren) nach den aktiven Transport von Myzelien Überbrückungsluftgefüllten Poren in einer wasser ungesättigten Modellsystem für bakteriellen Abbau verfügbar zu detektieren.

Zusammenfassung

Die Bioverfügbarkeit von Schadstoffen ist eine Voraussetzung für ihren effektiven biologischen Abbau im Boden. Die durchschnittliche Massenkonzentration eines Kontaminanten ist jedoch kein geeignetes Maß für seine Verfügbarkeit; Die Bioverfügbarkeit hängt vielmehr von dem dynamischen Zusammenspiel des potentiellen Stofftransports (Flusses) einer Verbindung zu einer mikrobiellen Zelle und der Fähigkeit dieser ab, die Verbindung abzubauen, ab. In wasserungesättigten Teilen des Bodens haben Myzelien gezeigt, dass sie Einschränkungen der Bioverfügbarkeit überwinden, indem sie organische Verbindungen aktiv über einen Zentimeterbereich transportieren und mobilisieren. Während das Ausmaß des Myzel-basierten Transports mit chemischen Mitteln leicht quantifiziert werden kann, erfordert der Nachweis der Schadstoff-Bioverfügbarkeit für Bakterienzellen eine biologische Methode. Um diese Einschränkung zu beheben, wählten wir das PAK-Fluoren (FLU) als Modellverbindung und entwickelten einen wasserungesättigten Modellmikrokosmos, der eine räumlich getrennte FLU-Punktquelle und das FLU-abbauende Bioreporter-Bakterium Burkholderia sartisoli RP037-mChe durch ein Myzelnetzwerk von Pythium ultimum verbindet. Da der Bioreporter eGFP als Reaktion des PAK-Flusses auf die Zelle exprimiert, könnte die bakterielle FLU-Exposition und der Abbau direkt im Mikrokosmos mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) überwacht werden. CLSM- und Bildanalysen zeigten einen signifikanten Anstieg der eGFP-Expression in Gegenwart von P. ultimum im Vergleich zu Kontrollen ohne Myzel oder FLU, was auf die Bioverfügbarkeit von FLU für Bakterien nach Myzel-vermitteltem Transport hinweist. Die CLSM-Ergebnisse wurden durch chemische Analysen in identischen Mikrokosmen unterstützt. Der entwickelte Mikrokosmos erwies sich als geeignet, die Bioverfügbarkeit von Kontaminanten zu untersuchen und gleichzeitig die beteiligten Bakterien-Myzel-Wechselwirkungen sichtbar zu machen.

Einleitung

Boden ist dicht mit einer Vielzahl von Mikroorganismen, wie Bakterien 1,2 besiedelt. Jedoch Bedingungen in diesem Lebensraum sind anspruchsvoll, vor allem in Bezug auf die Verfügbarkeit von Wasser 3. Bakterien dauerhaft müssen für optimale Bedingungen in heterogenen Umgebungen 4 suchen, aber das Fehlen von kontinuierlichen Wasser Filmen führt zu eingeschränkter Mobilität 5 behindern sie frei verteilen. Auch sind Diffusionsraten von gelösten Stoffen (zB Nährstoffe) unter ungesättigten Bedingungen 6 gesenkt. So werden Bakterien und Nährstoffe oft physisch getrennt und Nährstoff Zugänglichkeit begrenzt ist 3. Als Folge könnte ein Transportvektor für chemische Verbindungen, die nicht einen kontinuierlichen Wasserphase erfordern, hilft, diese Einschränkungen zu überwinden. In der Tat haben viele Mikroorganismen wie Pilze und Oomyceten ein filamentöses Wachstum bilden damit sie durch luftgefüllten Porenraum wächst dadurch erreichen und mobi entwickeltlizing auch körperliche getrennt Nährstoffe 7 und 8 kohlenstoffhaltigen Substanzen über lange Distanzen. Sie können sogar als biologische Transportvektoren, die Zucker und andere Energiequellen, um Bakterien 9 liefern zu handeln. Aufnahme und dem Transport in Myzel Organismen wurde auch für hydrophobe organische Schadstoffe, wie polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) in Pythium ultimum 10 oder in arbuskulären Mykorrhizapilzen 11 gezeigt. Seit PAH sind allgegenwärtig und schlecht wasserlöslichen Verunreinigungen 12 im Boden könnte Mycel-vermittelten Transport helfen, Verunreinigung Bioverfügbarkeit für potenzielle Bakterien Abbauern erhöhen. Während der Gesamtbetrag der Schadstofftransport direkt durch chemische quantifizieren Mittel 10, die Bioverfügbarkeit von Schadstoffen durch Myzel zu abbauenden Bakterien und anderen Organismen transportiert nicht leicht zu beurteilen.

Das folgende Protokoll stellt eine Methode vor, um die Auswirkungen myce evaluierenlia auf Schadstoff Bioverfügbarkeit um bakterielle Abbauern in direkter Weise; sie ermöglicht das Sammeln von Informationen über die räumlich-zeitliche Auswirkungen von Schadstoffen auf die mikrobielle Ökosysteme. Wir beschreiben, wie Sie eine ausführliche ungesättigten Mikrosystem imitiert Luft-Wasser-Grenzflächen in Böden durch die Verknüpfung von ein physikalisch getrennt PAH Punktquelle mit PAK-abbauenden Bakterien Bioreporter über Myzel Transportvektoren. Weil Luftverkehr ausgeschlossen ist, kann die Wirkung der Myzel-basierten Transport auf PAH Bioverfügbarkeit für Bakterien in einer isolierten Art und Weise untersucht werden. Im Einzelnen wurden drei-Ring PAK Fluoren, das Myzel Organismus Pythium ultimum und die Bioreporter Bakterium Burkholderia sartisoli RP037-MCHe 13 in den beschriebenen Mikrokosmos Setups angewendet. Das Bakterium B. sartisoli RP037-MCHe wurde ursprünglich konstruiert, Phenanthren Flüsse an die Zelle 14 zu untersuchen und exprimiert enhanced green fluorescent protein (eGFP) als ein Ergebnis der PAH Flußmitteldie Zelle, während die rot fluoreszierende mCherry konstitutiv exprimiert wird. Detaillierte Informationen zu dem Reporter Bau von Tecon et al. 13 In Vorversuchen gegeben, zeigte das Bakterium keine Schwimmen und nur sehr langsam Schwarmfähigkeit. Es konnte sich langsam auf Hyphen von Pythium ultimum wandern, wenn als dichte Suspension wurde auf den Hyphen aufgebracht. Da Bakterien wurden in Agarose in dem folgenden Protokoll eingebettet ist, hat Migration auf Hyphen nicht auftritt.

Mit Hilfe der konfokalen Laserrastermikroskopie (CLSM) können die Bioreporter Bakterien direkt in den Mikrokosmen visualisiert werden und die Expression des eGFP kann in Bezug auf die Menge von Zellen (proportional zur mCherry Signal) mit Hilfe der Software ImageJ quantifizieren. Dies ermöglicht den Vergleich der Bioverfügbarkeit qualitativ in verschiedenen Szenarien (dh höher oder niedriger). FLU gefunden bioverfügbar nach Myzel Transport von P. zu sein ultimum (dh eshöher war als bei einer negativen Kontrolle). Außerdem wird das Protokoll beschreibt, wie die Gesamtmenge der Myzelien-vermittelte Transport über chemische Mittel zu quantifizieren und Verunreinigung Bioverfügbarkeit Überprüfung mittels silikonbeschichteten Glasfasern (SPME-Fasern) in identischen Mikrokosmen. Ergebnisse mit diesem Mikrokosmos Setup veröffentlicht wurden und für die Kombination von P. diskutiert ultimum, Fluoren und B. sartisoli RP037-MCHe 15. Hier liegt der Fokus auf einer detaillierten Beschreibung und Methode der Identifizierung von möglichen Gefahren des Protokolls, dieses Wissen für mögliche weitere Anwendungen. Weitere Anwendungen kann es sich um verschiedene Pilz-, Bakterien- Spezies (zB von verunreinigten Standorten), und andere Verunreinigungen (zB Pestizide) oder schadstoffVersorgung (zB, im Alter von Böden).

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Protokoll

1. Vorbereitung der Gerichte, Slides und Inkubationskammern

  1. Bereiten Sie das folgende Material für jeden Mikrokosmos: eine große Kunststoff-Petrischale unten (d = 10 cm), ein modifiziertes (siehe Schritt 1.2) kleine Kunststoff-Petrischale unten (d = 5 cm) mit Deckel und einer Zählkammer Rutsche mit drei Hohlräumen.
  2. Nehmen Sie die gewünschte Anzahl von Petrischale Unterteile (d = 5 cm). Entfernen Sie Teil der Rand mit einer Säge passgenau einen Schieber (26 mm Kantenlänge). Um das System zu sterilisieren, genießen Petrischale Böden und Deckel in 70% Ethanol O / N und trocknen Sie sie für mindestens 2 Stunden in einem Strom Schrank unter UV-Licht. Speichern die Petrischalen in einem dicht verschlossenen Kunststoffbehälter, der auch UV-Licht 2 Stunden ausgesetzt worden waren.
  3. Wischen Sie die gewünschte Anzahl der Folien mit 70% Ethanol und Klima trocknen. Wickeln Sie Folien in Aluminiumfolie und legen Sie sie in einem Muffelofen 5 h bei 450 ° C, um mögliche Verunreinigungen zu entfernen.
  4. Bereiten Glas Inkubationskammern mit Deckel. Reinigen mit 70% Ethanol und freizulegen offenen Kammern mit UV-Licht für mindestens 2 h in einem Strömungsgehäuse.
    HINWEIS: Large Exsikkatoren (Durchmesser etwa 30 cm) mit Deckel kann zu diesem Zweck verwendet werden; jeder Exsikkator kann bis zehn Mikrokosmos Setups Haus auf.

2. Herstellung der Medien und Kultur

  1. So führen 20 parallel Mikrokosmen, erhalten 100 ml geändert Trypton-Hefe-Medium (MTY) 14, etwa 150 ml 21C-Minimalmedium 16 (MM), 5 ml Minimalmedium-Agar (MMA; 0,5% w / v), drei Kartoffel-Dextrose-Agar-Platten (PDA; 1,5%, w / v) für P. ultimum, vier leeren Platten, einer PDA-Platte, die 2 mg L -1 Cycloheximid vier Agaroseplatten (3% w / v), enthaltend 0,3 g ml -1 Aktivkohle und 40 mg FLU in 2 mg-Portionen.
  2. Bereiten mty enthaltend 50 mg L -1 Kanamycin (Kanamycin ist required, um die eGFP Reporterplasmid) und MM mit 10 mM Acetat für bakterielle Anbau erhalten. Verwenden MM ohne Acetat auf 0,5% MMA zur Immobilisierung von Bakterien in den Mikrokosmen vorzubereiten und Platten gießen (jeweils 20 ml) von 1,5% PDA für den Anbau von Pythium ultimum und Mikrokosmos Setups.
  3. Impfen Sie einige Hyphen von P. ultimum auf drei frische PDA-Platten und Inkubation im Dunkeln bei 25 ° C für etwa 72 Stunden. Stellen Sie anschließend sicher, dass die Platten überwuchert vollständig durch frische und flauschige Myzel.
  4. Starten zwei Kulturen von B. sartisoli RP037-MCHe in 50 ml MTY aus einem Glycerin Lager. Inkubation bei 30 ° C mit 230 Umdrehungen pro Minute rotierenden Kolben Bewegung O / N.
  5. Maßnahme Kultur optische Dichte (OD) bei 578 nm und die Zentrifuge bei 1000 × g für 10 min (für B. sartisoli RP037-MCHe ist die erwartete OD 578 etwa 1,0, und die Zellen sind in der exponentiellen Phase). Überstand verwerfen und erneut zu suspendieren, die Zellenin einer angemessenen Menge von MM auf eine OD 578 von 0,4 zu erreichen. Impfen Sie 20 ml MM mit 50 mg L -1 Kanamycin mit 400 ul der resuspendierten Zellen. Inkubation bei 30 ° C mit 230 Umdrehungen pro Minute rotierenden Kolben Bewegung O / N.
  6. Messen OD 578 der Kultur in MM (von B. sartisoli RP037-MCHe ist die erwartete OD 578 etwa 0,2, und die Zellen in der frühen exponentiellen Phase). Zentrifugenkultur bei 2.000 × g für 10 min und erneut die Zellen in einer geeigneten Menge an MM auf eine OD von 0,4 erreicht. Mischen Sie 50 ul der Zellsuspension mit 500 ul warme, flüssige MMA in 2-ml-Röhrchen und lagern bei 50 ° C bis zur Verwendung. Verwenden Sie 150 ul der Zellen in MMA für jedes Mikrokosmos.
  7. Platten gießen Agarosegel Aktivkohle enthält. Schmelzen Agarose (3%, w / v) in doppelt destilliertem Wasser. Gründlich mischen mit Aktivkohle (0,3 g ml -1) und gießen Mischung in Kunststoffpetrischalen(D = 10 cm).

3. Mikrokosmos Montage

. Hinweis: Die komplette Mikrokosmos Setup ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt, finden Sie in allen folgenden Einzelschritte Abbildung 1. Die folgenden Schritte beschreiben die Vorbereitung einer Probe (SAM) mit Myzel Transportvektoren und drei verschiedene Steuerungseinstellungen (CON AIR CON NEG, CON POS). Eine Zusammenfassung der verschiedenen Einstellungen können in Tabelle 1 gefunden werden.

  1. Nehmen gewünschte Anzahl von Petrischalen und Rutschen und deckt sie mit UV-Licht unter einem Strom Schrank für 30 min.
  2. Setzen Sie den kleinen Petrischale in der großes und passen Sie die Folie durch den Spalt des kleinen Petrischale. Nehmen Sie eine Probe des warmen Zellsuspension in MMA und fügen Sie 150 ul in die Mitte Hohlraum eine Folie. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die mittleren Hohlräumen aller Folien sindmit MMA gefüllt. Warten Sie 5 Minuten für die MMA zu verfestigen.
  3. Verwenden Sie eine 1 cm Korkbohrer aus einem leeren PDA Platte Punch-Out kreisförmigen Flecken. Legen Sie ein Patch in einem Abstand von 2 mm neben dem MMA in dem kleinen Petrischale. Fügen Sie diese auf Myzelwachstum im Setup (PDA 3 in Abbildung 1) zu fördern.
  4. Schneiden gekrümmt PDA Patches als mechanische Barrieren. Verwenden Sie eine saubere und sterile kleine Petrischale Unterteil und drücken Sie sie in ein PDA-Platte. Verwenden Sie einen Spachtel, um einen anderen kleineren Ring in einem Abstand von 0,5 cm in den Agar, die in einem PDA-Ring führt zu schneiden.
    1. Schneiden Sie ein Stück, das passt genau in die Lücke des kleinen Petrischale im Mikrokosmos Setup und legen Sie sie in die Lücke an der Spitze der Folie. Sicherzustellen, dass der Abstand zwischen dem MMA und dem kreis PDA Barriere beträgt etwa 2 mm. Schließen Sie den Deckel des kleinen Petrischale leichten Druck in die PDA-Schranke.
    2. Wiederholen Sie die Schritte 3.4 und 3.4.1 mit einem PDA-Platte mit 2 g L -1Cycloheximid.
      HINWEIS: Dies ist die Steuer Setup für Lufttransport (CON AIR) zu den Bioreporter Zellen, da Myzel durch Cycloheximid gehemmt und nicht überwuchern MMA.
  5. Verwenden Sie eine 1 cm Korkbohrer zu Punch-Out kreisförmigen Flecken von einem leeren PDA Platte. Verwenden Sie ein anderes 0,5 cm Korkbohrer zu schneiden Sie die Mitte der ersten Patch. Platzieren der resultierenden kleine PDA-Ring in einem Abstand von 1 mm neben dem PDA Barriere (PDA 1 in Abbildung 1).
  6. In 2 mg FLU in das Loch des PDA 1. Verwenden Sie ein 1 cm Korkbohrer ausschneiden kreisförmigen Flecken von PDA-Platten überwuchert P. ultimum und stellen Sie einen Patch (PDA 2 in Abbildung 1) unten nach unten auf den PDA-Ring, so dass der Myzelmatte steht vor der Grippe-Kristallen.
    1. Wiederholen Sie diesen Schritt ohne Zusatz von FLU-Kristallen.
      HINWEIS: Dies ist die negative Kontrolle Setup (CON NEG), um festzustellen, HintergrundFluoreszenz Bioreporter Zellen.
  7. Verwenden Sie eine 1 cm Korkbohrer aus dem Agar mit Aktivkohle Punch-Out kreisförmigen Flecken. Zeigen vier Patches in jeder Mikrokosmos-Setup, um die gasförmigen FLU-Konzentration (Abbildung 1) weiter zu verringern.
  8. Bereiten Sie eine positive Kontrolle (CON POS). Fügen Sie einige FLU Kristalle zu 200 ul Zellsuspension MMA und steckte es in einen Hohlraum einer leeren Folie.
  9. Platzieren einer Petrischale (d = 10 cm) mit etwas Pulver aus Aktivkohle auf dem Boden der Inkubationskammer zu FLU Gaskonzentration in der Kammer zu minimieren. Auch legen vier vor fünf 50 ml-Bechergläser mit sterilem Wasser auf der Unterseite mit hoher Luftfeuchtigkeit in der Kammer aufrechtzuerhalten.
    1. Übertragen Mikrokosmos Setups in Inkubationskammern und Inkubation bei 25 ° C für 96 Stunden. Platz Proben nach dem Zufallsprinzip in den verschiedenen Wachstumskammern zur Lage Effekte auszuschließen.
      HINWEIS: Diese Inkubationszeit apLagen an den Oomyceten P. ultimum. Es könnte unterschiedlich für andere Organismen.

4. konfokale Laser Scanning Mikroskopie

  1. Idealerweise verwenden Sie ein CLSM-Setup mit aufrechten Mikroskop.
    HINWEIS: Es kann mit herkömmlichen Lasern Angebot zB 488, 561 und 633 nm Linien zur Anregung oder mit Tunable White Laserquelle ausgestattet werden.
  2. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen für die Sammlung von Bildern: Anregung: 490 nm (eGFP) und 585 nm (mCherry) an der entsprechenden Laserintensität (simultane Anregung); Emissionsbereiche: 500 bis 550 nm (eGFP) und 605 bis 650 nm (mCherry); Objektiv: 63X NA 0,9 Wasser eintauchbar (aufgrund seiner großen Arbeitsabstand); Schrittweite für Z-Stapel: 0,5 um.
  3. Öffnen Mikrokosmos Einrichtung und Verwendung eines Skalpells auf PDA 1, 2, 3 und den PDA Barriere zu entfernen. Setzen Sie ein Deckglas auf der Oberseite des MMA und drücken Sie sie vorsichtig, um Luftblasen zu entfernen. Montieren Sie gleiten auf Mikroskoptisch. Fügen Sie einen Tropfen Wasser auf der Oberseite des the Deckglas und benutzen mCherry Einstellungen Bioreporter Zellen in der Probe zu finden.
  4. Holen Sie sich einen schnellen Überblick über die Probe und optimieren Rauschabstand mit einem Schein-über-unter Tabelle für rot (mCherry) und Grün (eGFP) Kanal. Wählen Sie eine zufällige Position auf der Probe zu Bioreporter Fluoreszenz analysiert.
    HINWEIS: Hyphen können Autofluoreszenz im Bereich von Bioreporter Emissions (zB grüne Autofluoreszenz) 17 zeigen. Achten Sie darauf, Bereiche ohne Hyphen wählen, wenn dies der Fall ist.
  5. Definieren und notieren z-Stapel für jede Position im grünen (eGFP) und die rote (mCherry) Kanal. Vermeiden Ausbleichen der Probe von Long-Positionen in Epifluoreszenz Licht oder Laserlicht.
    1. Wiederholen Sie die vorherigen Schritt für zehn zufällig, gleichmäßig verteilte Positionen.
  6. Wiederholen Sie alle Schritte mit den gleichen Einstellungen für alle Proben der Teststrecke (SAM), CON AIR CON NEG und CON POS.

5. Bildanalyse

HINWEIS: Um die rote (mCherry) und Grün (eGFP) Fluoreszenz in den z-Stapel aufgezeichnet Analyse wird unter anderem die kostenlose Software ImageJ 18 (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html) kann verwendet.

  1. Achten Sie auf die logi_tool Plugin (http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10/) installieren.
  2. Öffnen Sie die Datei in ImageJ. Wählen Sie "aufgeteilt Kanäle" und in der Nähe grünen Kanal. Verwenden Sie das Makro 'mCherry Bereich "als Zusatzcode-Datei in Bereich der roten Fluoreszenz in Z-Stapel zu quantifizieren ist. Stellen Sie die gewünschten Einstellungen im Makro (fett gedruckt).
    1. Output ist eine Tabelle mit den gemessenen Pixel über dem Schwellenwert (und über dem festgelegten Mindestgröße) in z-Stack.
      Hinweis: Die Summe aller Werte ist die Gesamtzahl der roten Pixel (Bereich) in dem Stapel.
  3. Öffnen Sie die Datei in ImageJ. Wählen Sie "aufgeteilt Kanäle" und in der Nähe roten Kanal. Verwenden Sie den Makro 216; eGFP int 'als Zusatzcode-Datei zur Verfügung gestellt, um die Intensität der grünen Fluoreszenz in z-Stapel zu quantifizieren. Stellen Sie die gewünschten Einstellungen im Makro (fett gedruckt).
    1. Die Ausgabe ist eine Tabelle mit den mittleren Intensitäten und Fläche aller grünen Gegenstände über der Schwelle (und über dem festgelegten Mindestgröße) in Z-Stapel. Um im Stapel berechnen die Gesamtintensität der grünen Pixel, multiplizieren jeweils mittlere Intensität durch die entsprechende Region.
  4. Berechnen Sie den prozentuellen eGFP Induktion (eGFP rel):
    figure-protocol-1 (1)
    Hinweis: Da mCherry konstitutiv exprimiert wird, ist der resultierende Wert von eGFP rel ein relatives Maß für die Menge an eGFP durch eine bestimmte Anzahl von Zellen ausgedrückt. Bitte auf Tabelle 3, um weitere Informationen über die Berechnung des eGFP rel verwiesen.
tle "> 6. Chemical Quantifizierung

HINWEIS: Mikrokosmos Konfigurationen können auch verwendet werden, um chemische Quantifizierung transloziert FLU Mengen mit oder ohne einem abiotischen Verunreinigung Körper auszuführen.

  1. Wickeln Sie 15 ml Glasfläschchen, 1 ml GC / MS-Fläschchen und Fremdbeilagen in Aluminiumfolie. Füllen Abdampfschalen mit Na 2 SO 4; stellen alle in Muffelofen 5 h bei 450 ° C, um mögliche Verunreinigungen zu entfernen. Lagern Sie das Na 2 SO 4 innerhalb eines aktivierten Exsikkator.
  2. Schneiden PDMS beschichteten Glasfasern in 0,5 cm Länge. Fasern waschen durch Schütteln viermal 2 h in frischem Methanol. Wiederholen Sie die Schritte Waschen noch vier Mal mit Reinstwasser und speichern sauber Fasern in ultrareinem Wasser in einem verschlossenen Glasfläschchen.
  3. Bereiten 1,5 l Toluol / Aceton (3: 1, v / v), enthaltend 10 ug L -1 Phenanthren-d 10.
  4. Die Schritte 1, 2 und 3 des Protokolls. Bereiten Mikrokosmen ohne BIOR(-) und CON AIR (- SAM ()) eporter Zellen FLU Transport studieren und mit Bioreporter Zellen (SAM), um FLU Abbau zu überprüfen.
    1. Optional (ohne Bioreporter Zellen): Platz drei PDMS beschichteten Glasfasern (in der Regel für die SPME Experimente verwendet) als künstliche und messbaren Schadstoffwanne nach innen MMA von SAM (-) mit einer feinen Pinzette.
    2. Entfernen Glasfasern mit feinen Pinzetten und übertragen jeweils ein in ein GC / MS-Fläschchen mit Einsatz.
    3. Fügen Sie 200 ul Toluol und schütteln vertikal O / N und mittels GC / MS analysiert. Verwenden Sie die Einstellungen in der Tabelle 2 zur Verfügung gestellt.
  5. Übertragen MMA aus dem mittleren Hohlraum in eine 15 ml Glasphiole und etwa drei Spatel von Na 2 SO 4. Nach gründlichem Mischen mit einem Spatel und 10 ml Lösungsmittel. Vortex die Mischung und schütteln horizontal O / N im Dunkeln.
    1. Über 1001; l Probe in GC / MS-Fläschchen mit Einsatz. Zugabe von 10 ul Acenaphthylen-d 08 (10 mg L -1) und Analyse mittels GC / MS unter Verwendung desselben Programms wie in 6.4.3 beschrieben.

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Ergebnisse

Die hier vorgestellten Ergebnisse wurden bereits früher 15 veröffentlicht. Bitte auf den Artikel für detaillierte mechanistische und Umweltdiskussion verweisen.

Nach Bildaufzeichnung über CLSM kann ein Maximum Intensity Projection mit dem entsprechenden Mikroskop-Software oder ImageJ, um einen ersten visuellen Eindruck von der Probe und die Bedienelemente (Abbildung 2) zu gewinnen durchgeführt werden. Später können die Datensätze unterschiedlich, um sinnvolle Funk...

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Diskussion

Die vorgestellte Mikrokosmos Setup als geeignet, um die Bioverfügbarkeit von räumlich getrennten Chemikalien abbauenden Organismen nach der Aufnahme und den Transport von Myzel zu studieren. Potenzielle Gasphasentransport von teilweise flüchtigen Verbindungen verhindert und bakterielle Bioreporter Zellen können ohne aufwändige Probenvorbereitung mit minimaler Störung des sensiblen System visualisiert und somit werden. Gleichzeitig kann die chemische Analyse der Probe leicht durchgeführt werden was eine gute Kontrolle de...

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Offenlegungen

Die Verfasser erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Die Förderung durch die Deutsche Stiftung Umwelt (DBU) wird anerkannt. Die Autoren danken Ute Kuhlicke für die technische Hilfe bei der CLSM-Analyse und Birgit Würz, Rita Remer und Jana Reichenbach für die kompetente experimentelle Hilfe. Die Autoren danken insbesondere Prof. Jan Roelof van der Meer und Dr. Robin Tecon für die fruchtbare Diskussion und die Bereitstellung des Bioreporter-Stammes. Es beteiligt sich am Forschungsprogramm "Chemicals in the Environment" (CITE) der Helmholtz-Gemeinschaft.

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Materialien

Minimal Medium:Lösung 1Lösung 2Lösung 3Lösung 2td colspan="4">Lösung 3 (pH 6,0)
Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
KonfokalmikroskopLeicaTCS SP5X, LAS AF - Version 2.6.1; oder gleichwertig CLSM
GC HP 7890 Serie GC und Agilent 5975C MSDAgilentkann ein gleichwertiger GC/MS verwendet werden
GC Kapillarsäule J& W 121-5522                         Agilent
KorkbohrerFisher Scientific12863952oder andere
DeckgläserMarienfeld107222High Performance, No.1.5H
GC/MS instertsWICOMWIC 47080
GC/MS Fläschchen 2 mlWICOMWIC 41150
Deckel / Septen für Fläschchen mit SchraubverschlussDIONEX49463 / 049464 
Deckel für GC/MS-FläschchenWICOMWIC 43948/B
ObjektträgerMenzelgewöhnliche
PDMS-beschichtete GlasfasernPolymicro Technologies, Inc.V (PDMS) = 13,55  ±   0.02  &Mikro; l  m-1
Petrischalen klein / großGreiner633-102 / 628-102
Fläschchen mit Schraubverschluss 40 mlDIONEX48783andere Glasfläschchen können verwendet werden
Fläschchen mit Schraubverschluss 60 mlDIONEX48784andere Glasfläschchen können verwendet werden
Acenaphthylen d08Dr. EhrenstorferC 20510100
AcetonCarl Roth9372.2
AktivkohleSigma-Aldrich242276-1kg
AgaroseCarl Roth2267.4
FluorenFluka46880
KanamycinsulfatCarl RothT832.250 mg L-1
MethanolCarl RothP7171<
Lösung 1
AmmoniumsulfatCarl Roth3746.15 g L-1 
Magnesiumchlorid x 6  H2OCarl Roth2189.11 g L-1
Calciumnitrat x 4  H2OCarl RothP740.10,5 g L-1<
DinatriumphosphatCarl RothP030.155,83 g L-1
MonokaliumphosphatCarl Roth3904.120 g L-1<
Dinatrium-EDTAMERCK10841802500,8 g L-1
>Eisen(II)-chlorid x 4  H2O MERCK10386102500,3 g L-1
Cobalt(II)-chlorid x 6  H2OCarl RothT889.34 mg L-1
Mangan(II)-chlorid x 1  H2OCarl Roth4320.210 mg L-1
Kupfer(II)-sulfatCarl RothP023.11 mg L-1
Natriummolybdat x 2  H2OCarl Roth0274.13 mg L-1
ZinkchloridMERCK10881602502 mg L-1
LithiumchloridCarl RothP007.10,5 mg L-1
Zinn(II)-chlorid x 2  H2OCarl Roth4473.10,5 mg L-1
BorsäureRiedel-de-Haen                         116061 mg L-1
KaliumbromidCarl RothA137.12 mg L-1
KaliumiodidCarl Roth6750.12 mg L-1
BariumchloridCarl Roth4453.10,5 mg L-1
MMAMinimales Medium + Agarose 0,2%
Phenanthren d10Dr. EhrenstorferC 20920100
Kartoffel-Dextrose-Agar: 24 g L-1 Brühe + Bacto-Agar 1,5%; pH 6,8
Kartoffel-Dextrose-BrüheDifco/ Beckton Dickinson254920
Bacto-AgarDifco/ Beckton Dickinson214040
Natriumacetat x 3 hydr.Carl Roth6779.1
NatriumsulfatMERCK1066495000
ToluolMERCK1083252500
mTY medium: 3 g  L-1 Hefeextrakt, 5  g  L-1 Bacto Trypton und 50 mM NaCl
HefeextraktMerck1037530500
TryptonServa4864702
NatriumchloridCarl Roth3957.1
ImageJ mit logi tool pluginhttp://rsb.info.nih.gov/ij/download.html und http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10
Pythium ultimum Stamm 67-1Gewonnen aus dem Labor von Dr. Christoph Keel; Departement für Fundamentale Mikrobiologie, Universität Lausanne, Schweiz
Burkholderia sartisoli RP037-mCheGewonnen aus dem Labor von Prof. Jan Roelof van der Meer; Institut für fundamentale Mikrobiologie, Universität Lausanne, Schweiz
td colspan="4"> 100 ml + 25 ml + 5 ml ad. 1.000 ml aqua desttd colspan="4">

Referenzen

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  2. Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The unseen majority. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6578-6583 (1998).
  3. Kieft, T. L., et al. Microbial abundance and activities in relation to water potential in the vadose zones of arid and semiarid sites. Microbial ecology. 26, 59-78 (1993).
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