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Methodenartikel

Bewertung der dendritischen Verzweigung im Gyrus dentatus des Hippocampus-Region an der Maus

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DOI:

10.3791/52371

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31. März 2015

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In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben zwei Methoden zur Visualisierung und Quantifizierung der dendritischen Arborisierung im Hippocampus von Mausmodellen: Echtzeit- und erweiterte Tiefenschärfebildgebung. Während die erste Methode eine ausgefeilte topographische Verfolgung und Quantifizierung des Ausmaßes der Verzweigung ermöglicht, ermöglicht die zweite eine schnelle Visualisierung des dendritischen Baumes.

Zusammenfassung

Dendritische Arborisation hat sich als zuverlässiger Marker für die Untersuchung der strukturellen und funktionellen Integrität von Neuronen erwiesen. In der Tat korreliert die Komplexität und das Ausmaß der dendritischen Arborisation gut mit der synaptischen Plastizität in diesen Zellen. Eine zuverlässige Methode zur Beurteilung der dendritischen Arborisation ist erforderlich, um die schädlichen Auswirkungen neurologischer Erkrankungen auf diese Strukturen zu charakterisieren und die Auswirkungen therapeutischer Interventionen zu bestimmen. Die Quantifizierung dieser Strukturen hat sich jedoch angesichts ihrer komplexen und dynamischen Natur als eine gewaltige Aufgabe erwiesen. Glücklicherweise können ausgefeilte bildgebende Verfahren mit herkömmlichen Färbemethoden kombiniert werden, um den Zustand der dendritischen Arborisation zu beurteilen, was ein zuverlässigeres und schnelleres Mittel zur Beurteilung bietet. Im Folgenden finden Sie ein Beispiel dafür, wie diese bildgebenden Verfahren mit Färbemethoden kombiniert wurden, um die dendritische Arborisation bei Wildtyp-Mäusen zu charakterisieren. Diese komplementären bildgebenden Verfahren können zur qualitativen und quantitativen Beurteilung der dendritischen Arborisation verwendet werden, die sich über einen relativ großen Bereich innerhalb der Hippocampusregion erstrecken.

Einleitung

Dynamische Veränderungen in der Anzahl und Struktur der Synapsen sind die Markenzeichen der Entwicklung, Alterung, und zahlreiche neurodegenerative Erkrankungen 1-3. Die Fähigkeit der Neuronen synaptische Informationen zu erhalten und zu integrieren, hängt von dendritischen Morphologie und dynamische Veränderungen synaptischer Verbindungen. Tatsächlich existiert eine positive Korrelation zwischen dendritischen Dorn und Synapsen Nummer, die sowohl die kognitiven Funktionen beeinflussen 4. So ist es nicht verwunderlich, dass Verringerungen in dendritischen Dorn Nummer haben mit kognitiven Störungen in einer Reihe von neurologischen Erkrankungen

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Protokoll

HINWEIS: Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den vom Ausschuss für Tierforschung an der Veterans Affairs Palo Alto Gesundheitswesen genehmigt ethischen Standards durchgeführt.

1. Golgi-Cox Färbung

  1. Gehirn-Extraktion und Färbung
    1. Am 1. Tag, tief betäuben Mäusen mit 100 mg / kg Ketamin und 10 mg / kg Xylazin vor euthanizing über Ausbluten.
    2. Entfernen Sie vorsichtig das Schädeldach und sezieren das Gehirn.
      1. Entfernen Sie zuerst die Haut auf der Oberseite des Schädels, indem eine gekrümmte Schere an der Oberseite des Kleinhirns und sanft Messer durch die Schädeldach parallel zur zentralen Sulcus mi....

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Ergebnisse

Das Ausmaß der Verzweigung, die aus vorhandenen und neu geboren dentatus Körnerzellen in Wildtyp-Mäusen entweder mit Golgi-Cox oder DCX-Färbung (Abbildung 1) analysiert. Dendritische Segmente DCX-positiven Zellen gefunden wurden 13-36 Micron lang. Die Normalverteilung der dendritischen Länge wurde mit Kolmogorov-Smirnov-Test geprüft (D = 0,1217, p <0,01, Liliefors p <0,001; Figuren 4 und 5).

Bei der Analyse der Länge der Segmente pro B.......

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Diskussion

Hier wurden zwei Methoden beschrieben, um das Ausmaß der dendritischen Verzweigung in reifen und neugeborenen Neuronen mit herkömmlichen Färbemethoden in Verbindung mit RTI und EDFI quantifizieren. Die Übernahme von hochauflösenden Bildern von Neuronen ein extrem nützliches Verfahren zum Testen der schädlichen Wirkungen von neurodegenerativen Erkrankungen und wiederum stellt ein Mittel zur therapeutischen Strategien, Hippocampusneuronen Ziel beurteilen.

Während die RTI-Methode wurde verwende.......

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Offenlegungen

Veröffentlichungskosten für diesen Artikel werden von MBF Bioscience gesponsert.

Danksagungen

Diese Forschung wurde durch Zuschüsse der LuMind Foundation, Research Down Syndrome und der Alzheimer's Association (AS) unterstützt. CP wurde teilweise durch ein Fakultätsentwicklungsstipendium des College of Nursing and Health Professions an der Arkansas State University unterstützt.

....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Modifizierte Golgi-cox-Färbelösung Weill Cornell Medical CollegeNAGeschäft bei 4° C bis zur Verwendung
1x Entwicklungslösung (Lager 10x)Weill Cornell Medical CollegeNAStore at 4° C bis zur Verwendung
30% Saccharose,SigmaCAS # 57-50-1frisch machen   in ddH2O
0,3 % GelatineSigmaCAS # 9000-70-8NA
Graded Ethanol Solutions (20%, 30 %, 40 %, 50 %, 80 %, 90 %, 90 %, 90 %, 100 %)SigmaCAS 603-003-00-5NA
XylolSigmaCAS # 1330-20-7NA
DPX MediumEMS #13510NA
Superfrost (+) weißElektronenmikroskopieSciences 71869-10NA
Deckglas 22x50mm (VWR #48393-059)VWR #4811-703NA
DCX AntikörperSanta Cruz Biotechnologysc-80664 C
DABSigmaCAS-Nummer 91-95-2  -20
OCTTissue-tek4583NA
TrisSigmaCAS-Nummer 77-86-1  Na
ABC LiteVectorPK4000NA
MikroskopNikonEclipse 80i
DigitalkameraNikonDS-Ri1
12 Bit Kamera QImbsp 01 MBF2000RF-CLR-12
Neurolucida SystemMBF BioscienceV.10
Image Composite EditorMicrosoft1.4.4.0
NIS ElementsNikonF 3.0
Image Pro PlusMediacyVersin 7.00
kg

Referenzen

  1. Bosch, M., Hayashi, Y. Structural plasticity of dendritic spines. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 383-388 (2012).
  2. Isaac, J. T. The synapse: center stage for many brain diseases. The Journal of Physiology. 587 (4), 727-729 (2009).
  3. Sheng, M., Sabatini, B. L., Südhof, T. ....

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Nachdrucke und Genehmigungen

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