Experimentelle Glaukom von Ocular Injektion von magnetischen Mikrokügelchen Induzierte

Zusammenfassung

Wir stellen eine Methode zur Induktion eines erhöhten Augeninnendrucks (IOD) vor, indem magnetische Mikrosphären in das Rattenauge injiziert werden, um das Glaukom zu modellieren. Dies führt zu starken Druckanstiegen und einem ausgedehnten Absterben der Neuronen. Dieses Protokoll ist einfach durchzuführen, erfordert keine wiederholten Injektionen und erzeugt einen stabilen, lang anhaltenden IOD-Anstieg.

Zusammenfassung

Fortschritte beim Verständnis der Pathophysiologie und der Bereitstellung neuartiger Behandlungen für Glaukom hängen von guten Tiermodellen der Krankheit ab. Wir stellen hier ein Protokoll zur Erhöhung des Augeninnendrucks (IOD) bei der Ratte vor, indem magnetische Mikrosphären in die vordere Augenkammer injiziert werden. Die Verwendung von magnetischen Partikeln ermöglicht es dem Benutzer, die Kügelchen in den Iridokornealwinkel zu manipulieren, wodurch der Flüssigkeitsabfluss aus dem Trabekelwerk sehr effektiv blockiert wird. Dies führt zu einem lang anhaltenden Anstieg des Augeninnendrucks und schließlich zum neuronalen Tod in der Ganglienzellschicht (GCL) sowie zu einer Pathologie des Sehnervs, wie sie bei Patienten mit der Krankheit zu beobachten ist. Diese Methode ist einfach durchzuführen, da sie keine Maschinen, spezielle chirurgische Fähigkeiten oder viele Stunden Übung erfordert, um sie zu perfektionieren. Darüber hinaus sind die Druckerhöhungen sehr robust, und eine erneute Injektion der magnetischen Mikrosphären ist in der Regel nicht erforderlich, im Gegensatz zu einigen anderen Modellen mit Kunststoffkügelchen. Darüber hinaus glauben wir, dass diese Methode für die Adaption an das Mausauge geeignet ist.

Einleitung

Primäres Glaukom ist eine verheerende Augenkrankheit schätzungsweise 60,5 Millionen Menschen in aller Welt ¹ zu beeinflussen, was zu lebensverändernden Sehverlust und Erblindung ² führen kann. Die Erforschung der Krankheitsmechanismen und Entwicklung neuartiger Therapeutika für Glaukom, sind abhängig von guten Modellen der Krankheit, die einige der Markenzeichen der Pathologie zu rekapitulieren.

Wir stellen hier eine Ratte Glaukommodell basierend auf der Methode von Samsel et al. ³ Das Ziel dieses Verfahrens ist es, den Augeninnendruck (IOP) in das Auge durch die Injektion von magnetischen Mikrokügelchen in die vordere Kammer, und mit einem Magnetring direkt erhöhen sie in den Kammerwinkel. Dies behindert Kammerwasserabfluss, der IOP erhöht, was zu Nervenschäden und Zellverlust. Das Protokoll wurde entwickelt, um zu versuchen, ein einfacheres, induzierbar Modell von Glaukom ist.

Dieses Protokoll kann einige Vorteile haben,gegenüber bestehenden Techniken. Genetische Maus-Modellen wie dem DBA / 2J zur Verfügung, die nicht verlangen, Verfahren einzuleiten; aber diese können eine unvorhersehbare Auftreten von Krankheitsprogression ^4. Demgegenüber induzierbare Modelle, von denen die meisten auf chirurgisch Hebe IOP bei Nagetieren zu verlassen, haben den Vorteil, dass die Einleitung durch den Benutzer gesteuert werden. Einige dieser Methoden können Nachteile der eigenen jedoch haben, auch als technisch anspruchs ^5, und kann mehrere Verfahren erfordern erhöhten IOP ⁶ zu halten.

Im Gegensatz dazu ist die induzierbare Verfahren in diesem Manuskript detailliert eine einfache, wirksame und reproduzierbare Technik, die stabile, robuste Druckerhöhungen mit einem minimalen Bedarf an Reinjektion produziert. Zusätzlich, es werden aber keine teure Ausrüstung und erfordert nur grundlegende chirurgische Fähigkeiten durchzuführen. Dieses Protokoll kann für die Leser, die sich um eine technisch weniger anspruchsvolle induzierbaren einzurichten geeignetGlaukom-Modell in ihrem Labor.

Protokoll

Ethics Statement: Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) durchgeführt wurden, und wurden im Einvernehmen mit Großbritannien Home Office Richtlinien (genehmigt http://goo.gl/FLkirW , letzter Zugriff 10 ^Juni , 2014) und der ARVO Erklärung für die Nutzung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research ( http://goo.gl/4LFOjD , letzter Zugriff ^10. Juni 2014).

1. Ocular Hypertension Induktions

1. Induzieren experimentellen Glaukom durch Erhöhung des Augeninnendrucks (IOP) durch einseitige Injektion von paramagnetischen Mikrosphären in der vorderen Kammer des Brown-Norway-Ratten, basierend auf der Methode von Samsel et al. ³ Andere pigmentierte Ratten geeignet sein können, obwohl diese müssten validiert zuerst durch den Benutzer.
2. Haus von 250 bis 300 g weiblichEx-Züchter Brown Norway Ratten in einem ständigen schlechten Lichtverhältnissen (40-60 lux) auf Tagesschwankungen IOP ⁷ zu minimieren, mit Zugang zu Futter und Wasser ad libitum.
3. Sie intra IOP-Messungen an wachen Tieren ⁸ vor der Anästhesie und Wulst Injektion, unter Verwendung eines Rebound-Tonometer zur Verwendung im Rattenauge ⁹ kalibriert. IOP wird als Mittelwert von fünf Ablesungen vorgenommen.
4. Betäuben Ratten mit 37,5 mg / kg Ketamin und 0,25 mg / kg intraperitoneal Medetomidinhydrochlorid geliefert. Narkosetiefe Bestätigen Sie durch Testen hinteren Fuß Reflexe Tieres, vor der Jod-Anwendung (siehe Schritt 1.5), und Perlen Injektion Povidon (siehe Schritt 1.8). Verwalten 0,5% Proparacainhydrochlorid zur Analgesie.
   HINWEIS: die Schüler jederzeit erweitern Sie nicht. Dies wird helfen, die Perlen, sich besser in die Kammerwinkel zu regeln, und verhindern, dass die Bindung an der Linse. Bewerben Augensalbe zur Hornhaut Trocknen auf un-betriebenen andere Auge zu verhindern.
5. WAsche der operativen Augen mit 5% Povidon-Iod in Wasser ¹⁰ 5 min vor der Injektion.
6. Nach 5 min Docht die Povidoniod Ausschalten mit steriler Gaze, und waschen Sie das Auge mit 0,9% steriler Kochsalzlösung. Halten Sie die Augen während der Narkose bei regelmäßiger Anwendung steriler Kochsalzlösung feucht.
7. Legen Sie einen Ringmagneten um das Auge.
8. Injizieren 25 ul einer Lösung, die 30 mg / ml des gamma-Bestrahlung sterilisiert 8 um magnetischen Mikrokügelchen in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) in die vordere Augenkammer, mit einer 33 G Nadel abgeschrägt.
   1. Um Perlen herzustellen, Waschen durch Resuspendieren und dann 3mal Zentrifugieren bei 10.000 xg für 5 Minuten mit 1 ml HBSS, bevor die endgültige 30 mg / ml Lösung. Pflegen sterilen Bedingungen im gesamten.
   2. Für die Injektion vorsichtig sein, um zu vermeiden, die Nadel an der Iris, um das Risiko von Iris Trauma zu minimieren. Dies kann durch Ausrichten der Nadel tangential zur Hornhautoberfläche verhindert werden, die parallel zudie Iris wie möglich. Dies wird auch dazu beitragen, Perlenverlust von der Injektionsstelle zu minimieren.
      Hinweis: Spritzen Sie Perlen mit einer schnellen Rate, um eine gleichmäßige Verteilung auf der Kammerwinkel, die entscheidend für die Anhebung IOP ist zu gewährleisten. Zusätzlich Shop Perlen, Nadeln und Magnetringe getrennt, so dass die Perlen bilden keine Cluster, so dass sie nur schwer in die Spritze zu laden und zu injizieren, und die Nadel nicht magnetisiert werden.
9. Lassen Sie die Nadel an Ort und Stelle für 1 min nach der Injektion um sicherzustellen, dass es sich in Perlen der Kammerwinkel zu wässrigen Kondensat ab, das Trabekelwerk behindern. Leicht Winkel der Nadel nach der Perlen wurden zunächst einige Leckage von wässrigen zu ermöglichen, um eine vorübergehende Erhöhung des Augeninnendruck zu minimieren siedelt. Am Ende der Operation zu spülen Sie die Nadel durch mit ersten phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), dann 70% Ethanol, gefolgt von destilliertem Wasser, um die weitere Verwendung der Nadel in getrennten Verfahren zu gewährleisten. Alternativ könnte man verwendenEinweg-Nadeln, wenn die richtige Spurweite und Spritze Kombination zur Verfügung. Optional: Nadeln mit Hilfe eines Schweißkantenformer, deren Nutzung zu verlängern geschärft werden.
10. Zu diesem Zeitpunkt ggf. entfernen Sie den Magneten, und verwenden Sie es, um die Kügelchen in Bereiche unvollständige Abdeckung ziehen.
11. Lassen Sie den Magneten an Ort und Stelle um das Auge für weitere 10 min nach der Injektion, um sicherzustellen, Perlen absetzen gut in die Kammerwinkel.
12. Reverse Anästhesie unter Verwendung von 0,25 mg / kg atipemezole Hydrochlorid.
13. Verabreichen Chloramphenicol oder anderen Antibiotika-Salbe, beispielsweise Gentamycin oder Terramycin topisch auf eine Infektion zu verhindern, und 0,5% Proparacain-Hydrochlorid zur Analgesie. Lassen Sie Tiere auf eine Wärmematte erholen, bis sie die Bewegung wieder zu erlangen, dann in einen warmen Box und Versorgung mit zusätzlicher Nahrung, zu übertragen, wie als Nahrungsergänzungsmittel oder angefeuchtet normalen Ernährung, bis die Wiederherstellung abgeschlossen ist. Systemische oder lokale Analgesie sollte Tiere mit Anzeichen von Schmerzen 24 Stunden nach der Operation gegeben werden. Wenn thestrotz Behandlung e anhaltenden Beschwerden sollten die Tiere auf humane Weise getötet werden.
14. Verwenden Sie das andere Auge als nicht operierten Kontrolle.
15. Nehmen IOP-Messungen alle 2-3 Tage nach der Wulst Verabreichung und alle 2-3 Tage danach mit einem Rebound-Tonometer zur Verwendung im Rattenauge ⁹ kalibriert.
16. Die Kriterien für die Aufnahme in die Augen Studien können sein: wenn 1) die IOP über der kontralateralen Kontrolldruck von 5 mm Hg erhöht, und 2) nicht über 60 mm Hg nicht übersteigt.
17. Augen, wo der Druck wieder zum Ausgangswert (in der Regel von 1 Woche nach der Injektion) sollte nicht in die Studien aufgenommen werden, ist es jedoch möglich, wieder zu injizieren Perlen in die Augen, die zu hohen Augeninnendruck entwickeln, wenn gewünscht ausfallen.
18. Euthanize Tiere durch CO ₂ Erstickung am Ende des Experiments.
19. Präparieren Sie die Augen und Sehnerven, und befestigen Sie in 4% Paraformaldehyd (PFA) über Nacht für weitere histologische Analyse.

2. Beurteilung der Netzhaut Neuron Schaden Mit TUNEL Shaltigen

1. Um apoptotischen Zellen zu quantifizieren in ganze Berg retinasuse der Desoxyribonukleotidyltransferase vermittelte dUTP nick-Kennzeichnung (TUNEL) Assay, nach den Anweisungen des Herstellers.
2. Präparieren der Netzhaut von der Augenmuschel, Waschen für 3 x 5 min in 0,3% Triton X-100 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (T-PBS).
3. Permeabilisieren Gewebe in 3% T-PBS für 2 Stunden.
4. Pre-äquilibrieren Retinae in Äquilibrierungspuffer 10 min, vor der Inkubation TUNEL Reaktionslösung 1 h bei 37 ° C.
5. 3 x 5 min in 0,3% T-PBS waschen das Gewebe gründlich in 0,3% T-PBS mit 5 uM DAPI und Flachhalterung bei der Montage Medien.
6. Zur Quantifizierung TUNEL positiven Kerne mit einem konfokalen Mikroskop bis 10 um z-Stacks durch die Ganglienzellschicht bei 20-facher Vergrößerung zu nehmen. Nehmen Sie 3 Bilder auf jedem der 4 Blütenblätter, an Orten in der Nähe des Sehnervs, in der Mitte der Peripherie, und am äußersten Peripherie der Netzhaut, was eine Gesamtzahl von 12 Bildern pro ganze mount, Probenahme ca. 7.000 Zellen. Morphologischer Kriterien unterschieden nicht neuronale (endotheliale und Glia-Zellen) aus neuronalen Zellen.
7. Wählen Sie die Bereiche für die Bildgebung nur mit der DAPI-Kanal und Maske Ermittler zu den Behandlungsgruppen.

3. Bewertung Optic Nerve Damage Mit Toluidinblaufärbung

1. Fix Sehnerven Nacht in Karnovsky-Lösung bei 4 ° C.
2. Saures Proben für 2 Stunden in 1% (w / v) Osmiumtetroxid und anschließend in 100% Ethanol dehydriert.
3. Sehnerven in Propylenoxid inkubieren für 30 Minuten, und legen Sie in einer 50:50 Mischung von Propylenoxid: Araldit Nacht.
4. Wechseln diese Lösung zu 100% Araldit, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei 60 ° C.
5. Cut Semidünnschnitten (0,75 mm dick) und Fleck mit 1% Toluidinblau / Borax (TB) in 50% Ethanol vor der Sachprüfung mittels Lichtmikroskopie.

4. Statistische Analyse

1. Die statistische analysiert mit einem entsprechenden Statistik-Software-Paket. Ein Zwei-Wege-ANOVA mit der Newman-Keul Post-hoc-Test kann verwendet werden, um die statistische Signifikanz berechnen IOP über die Zeit verändert werden.
2. Ein p-Wert von weniger als 0,05 kann als signifikant angesehen werden.

Ergebnisse

Die Injektion von magnetischen Kügelchen in den Kammerwinkel konsequent führte zu einer anhaltenden und robusten Druckanstieg (Abbildung 1), die an dem ersten Zeitpunkt, 3 Tage nach der Injektion leicht beobachtbar war. Ferner wurde der Druckanstieg während der gesamten Dauer des Experiments gehalten und obwohl unser Zeitverlauf beendet bei 18 Tage nach der Injektion wurden andere berichteten Druck bestehen bleibt langfristig ^3. Die mittlere IOP gemittelt über die gesamte Länge des Experiments für die Steuerung, nicht-Wulst-injizierten Augen betrug 19,7 ± 0,3 mmHg gegenüber 40,5 ± 2,8 mmHg für Wulst-injizierten Augen (P <0,001). Zusätzlich erhöhte Spitzen IOD von 22,8 ± 0,3 mmHg auf 49,9 ± 2,3 mmHg.

Um zu bestimmen, ob die Erhöhung in IOP führt zum Tod von retinalen Ganglienzellen, führten wir TUNEL-Färbung an Retinae und Histologie an Quer Sehnerv Abschnitte (Abbildung 2). In der Netzhaut Wir beobachteten einen Anstieg der TUNEL-Färbung (2A) in sicken injizierten Augen mit erhöhtem IOP. Die Anzahl an apoptotischen Kernen stieg etwa 15-fach, von 1,6 ± 0,5 Zellen in kontralateralen Kontrollen auf 24,5 ± 0,5 Zellen in hypertensive Retinae (2B; P <0,05). Ferner ist in den Augen, in denen magnetische Kügelchen injiziert aber Druck nicht erhöht (wahrscheinlich aufgrund einer unvollständigen Blockade der Kammerwinkel), waren die Anzahlen von TUNEL-positiven Zellen nicht signifikant verschieden von denen der nicht-injizierten Kontrollen (P> 0,05). Dies legt nahe, dass der Zelltod auf Druck ansteigt, nicht auf direkte Toxizität der magnetischen Mikrokugeln zusammen. Schließlich wurde untersucht, Sehnerv Pathologie in der Glaukommodell und sah Akkumulation von Toluidinblau in vielen der Axone, anzeigt Degeneration dieser zellulären Prozesse (2C).

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Abbildung 1. Erhöhung des intraokularen Drucks unter Verwendung von magnetischen Mikrosphären. Die Injektion von magnetischen Mikrokügelchen in die vordere Kammer induziert eine robuste, signifikanten Anstieg des intraokularen Drucks (IOP) im Vergleich zur contralateralen Kontroll, nicht injizierten Augen. Y-Achsen-Einheiten = Millimeter Quecksilbersäule (mmHg). Daten = Mittelwert ± SEM. * = P <0,001;. N = 12. Dieser Wert wurde von Foxton et al, Am modifiziert. J. Pathol 182 (4):. 1379-1390.

Abbildung 2. Erhöhung von IOP durch Injektion von magnetischen Mikrokügelchen in den Kammerwinkel, induzierten neuronalen Tod in der Ganglienzellschicht (GCL). (A) Repräsentative Bilder der Netzhaut von der Kontrolle (links) und Glaukom (rechts) die Augen für apoptotische Kerne befleckt von TUNEL (grün;weiße Pfeile) und DAPI (blau), die die Anzahl der apoptotischen Kernen erhöht IOP stieg. (B) Quantifizierung von TUNEL-positiven Zellen in der GCL und zeigt, daß die Augen mit erhöhtem IOP (Mitte), signifikant mehr apoptotische Zellen im Vergleich zu Kontrolle (links). Im Gegensatz dazu wird in sicken injizierten Augen, wo der Druck nicht steigt (rechts), keine signifikante Erhöhung der TUNEL-Färbung beobachtet wurde. Daten = Mittelwert ± SEM. * = P <0,05; N = 7-8 (C) Repräsentative Bilder der Sehnerv Färbung und zeigt einen Anstieg der Toluidinblau-Ansammlung (schwarze Pfeile) in beschädigten Axone von Glaukom (rechts), aber keine Kontrolle Augen (links).. Maßstabsbalken = 50 um. Diese Zahl hat sich von Foxton et al modifiziert., Am. J. Pathol 182 (4):. 1379-1390.

Diskussion

Hier zeigen wir ein Verfahren zum Induzieren erhöhten IOP bei der Ratte durch Injektion von magnetischen Mikrokügelchen in die Vorderkammer des Auges. Diese Methode ist einfach durchzuführen und erfordert nur wenig chirurgischem Know-how oder Stunden des Übens und Raffinesse. Weiterhin ist das Verfahren wirksam sind; selten, die mehr als eine einzige Injektion von Perlen, eine starke, robuste Druckanstieg (ca. 10% Reinjektion Rate) zu induzieren. Dies kann einen Vorteil gegenüber bestehenden induzierbaren Methoden, wie dem technisch anspruchs episceral Vene bereitzustellen Sklerose ¹¹ Modell oder Laserphotokoagulation Protokoll ^6, die mehrere Verfahren zu erhöhten IOP maintain erfordern kann.

Damit die Methode, um erfolgreich sein, jedoch gibt es einige kleine kritische Schritte, die ergriffen werden müssen. Erstens ist es sinnvoll, eine Ringförmigen Magneten benutzen, um Korne in den Kammerwinkel zu zeichnen. Dieser Schritt ist eine Modifizierung des ursprünglichen Protokolls where wurden die Kügelchen in die vordere Kammer injiziert, und dann freihändig bewegt um das Auge ^3. Mit einem Ringmagneten bedeutet, dass Mikrokügelchen sollten gleichmäßig um den Winkel zu regeln, minimale manuelle Umverteilung erfordern. Zu langsam, und die Perlen werden in erster Linie sammeln sich auf der einen Seite der Winkel, was zu unvollständigen Erfassung und möglicherweise ohne Druckanstieg - Zweitens sollte die Injektionsgeschwindigkeit schnell. Im Allgemeinen jedoch ist das Verfahren einfach genug, daß der Benutzer leicht Modifikationen des Protokolls, wie beispielsweise Variation der Größe oder das Volumen der Mikrokügelchen-Partikel, vielleicht, um zu versuchen, den Grad der IOP Elevation verändert werden.

Allerdings ist ein möglicher Nachteil der Methode, dass ein wenig Kontrolle über das Ausmaß der Bluthochdruck, die in etwa 5-10% der Fälle haben wir beobachtet stieg über 60 mmHg hat. Übermäßiger Anstieg der IOP kann sehr schädlich für Netzhautgewebe sein und machen die Erforschung der Mechanismen und biologie des Zelltods Herausforderung. Das Verfahren erzeugt jedoch eine konsistente neuronale Pathologie, sowohl in der Netzhaut und des Sehnerven, die pharmakologisch ¹² manipuliert werden kann. Dies kann das Modell attraktiv für die Entwicklung neuartiger Therapeutika zur Behandlung von Glaukom zu machen. Darüber hinaus, da die Perlen in den Kammerwinkel ausgerichtet, lässt dies die Sichtachse frei für Echtzeit-Bildgebung der Netzhaut oder der Papille. Wir gehen davon aus, dass dieses Modell angepasst und für zukünftige Anwendungen in anderen Spezies, einschließlich der Maus verwendet werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
250 - 300g weiblich Braun Norwegen Ex-Züchter Ratten	Harlan UK	203
Tonolab Rebound Tonometer	Tiolat	TV02
Ketaset (Ketamin)	Fort Dodge Tiergesundheit	BN1000118	37,5 mg/kg
Domitor (Medetomidinhydrochlorid)	Orion Pharma	140-999	0,25 mg/kg
Povidon-Jod	Ecolab	BN4369LE10	5% in H2O
Minim's Kochsalzlösung	Bausch und Lomb	PL00033/5017
Ringkernmagnet	Supermagnet	R-10-07-03-N
Magnetische Mikrosphären	Bangs Laboratories	UMC4N/9692
HBSS	Invitrogen	14025
33 G abgeschrägte Nadel	Hamilton	7747-01	Benutzerdefinierte Nadel
Luer-Spitzenspritze	Hamilton	80601
Antisedan (Atipemezolhydrochlorid )	Orion Pharma	141-003	0,25 mg/kg
Chloramphenicol-Salbe	Medicom	18956-0005
TUNEL-Färbeset	Promega	G3250
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Vectashield Eindeckmedien	Vector Labs	H-1000