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Methodenartikel

Die vielfältigen Vorteile von Protein Co-expression in

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DOI:

10.3791/52431

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5. Februar 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacy and Biotechnology, University of Bologna, 2CSGI, Department of Chemistry, University of Firenze

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Protein-Co-Expression ist eine leistungsstarke Alternative zur Rekonstitution von Proteinkomplexen in vitro und hilft bei der Durchführung biochemischer und genetischer Tests in vivo. In diesem Artikel berichten wir über die Verwendung der Protein-Co-Expression in Escherichia coli, um Proteinkomplexe zu erhalten und die Mutationshäufigkeit von Zellen zu optimieren.

Zusammenfassung

Wir berichten hier, dass die Expression von Proteinkomplexen in vivo in Escherichia coli bequemer sein kann als traditionelle Rekonstitutionsexperimente in vitro. Insbesondere zeigen wir, dass die schlechte Löslichkeit der Escherichia coli DNA-Polymerase III ε-Untereinheit (mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität) stark verbessert wird, wenn das gleiche Protein mit den α- und θ-Untereinheiten (mit DNA-Polymerase-Aktivität bzw. stabilisierender ε) koexprimiert wird. Wir zeigen auch, dass die Protein-Co-Expression in E. coli genutzt werden kann, um die Kompetenz von Untereinheiten aus verschiedenen Bakterienarten effizient zu testen, sich in einem funktionellen Proteinkomplex zu assoziieren. Wir zeigen tatsächlich, dass die α Untereinheit von Deinococcus radiodurans DNA-Polymerase III in vivo mit der ε Untereinheit von E. coli koexprimiert werden kann. Darüber hinaus berichten wir über die Verwendung von Protein-Co-Expression zur Modulation der Mutationshäufigkeit in E. coli. Durch die Expression der Wildtyp-ε-Untereinheit unter der Kontrolle des araBAD-Promotors (Arabinose-induzierbar) und die Co-Expression der mutagenen D12A-Variante desselben Proteins unter der Kontrolle des lac-Promotors (induzierbar durch Isopropyl-Thio-β-D-Galactopyranosid, IPTG) konnten wir die Mutationshäufigkeit von E. coli unter Verwendung geeigneter Konzentrationen der Induktoren Arabinose und IPTG verändern. Schließlich diskutieren wir die jüngsten Fortschritte und zukünftigen Herausforderungen der Protein-Co-Expression in E. coli.

Einleitung

Die Einführung der Überexpression Technologien erhöht entweder die biochemische Untersuchungen von niedriger Kopienzahl Enzyme und die industrielle Herstellung von pharmakologisch aktiven Proteinen (zB Insulin). Seit der Einführung dieser Technologien wurden erhebliche Fortschritte erzielt worden, um die Ausbeute und Qualität von rekombinanten Proteinen zu erhöhen. Darüber hinaus wurden 1,2 prokaryotischen und eukaryotischen 3 Überexpression Systeme über die Jahre entwickelt und bietet sinnvolle Alternativen zu dem "Arbeitspferd" der Proteinbiotechnologie, also Escherichia coli. Insbesondere die Verfügbarkeit von alternativen Plattformen E. coli führte zur Produktion von rekombinanten Peptiden oder Proteinen, die post-translationale Modifikationen. Es sollte jedoch erwähnt werden, dass E. coli stellt noch immer den Organismus der Wahl für die Produktion rekombinanter Proteine. Dies ist auf mehrere Faktoren, von denen die relevantesten sein kannberücksichtigt: i) die Verfügbarkeit von einer ganzen Reihe von Überexpression Systeme (Expressionsvektoren und Stämme) für E. coli 1,2; ii) die kurze Generationszeiten und hohe Biomasseerträge, der E. coli in einer Vielzahl von reichen und synthetische Medien; iii) die leichte Manipulation entweder auf biochemischer und genetischer Ebene dieses Mikroorganismus; iv) die Isolierung der Stämme, die die Produktion von toxischen Proteinen 4; v) die Konstruktion von Stämmen mit homogenen Induktion auf Bevölkerungsebene 5,6. Darüber hinaus wurde kürzlich gezeigt, dass Expressionssysteme für die Produktion in E. coli von posttranslational modifizierten Proteinen entwickelt werden können, und 2 aufgebaut.

Gegenwärtig wird die Proteinexpression vor allem zur monomeren oder homo-oligomere Proteine, deren hypersynthesis kann mit einem einzigen Gen in ein geeignetes Plasmid kloniert geführt werden erhalten. Doch vor kurzem war die Aufmerksamkeitfür den Bau von E. bezahlt coli-Protein co-Expressionssysteme, gegen die Produktion, in vivo, der Hetero oligomeren Komplexen 2. Interessanterweise frühen Experimenten von Protein Co-Expression adressiert die Interspezies-Montage von großen und kleinen Untereinheiten der Cyanobakterien Ribulose-1,5-Bisphosphat-Carboxylase / Oxygenase 7,8, und die Assoziation von abgeschnitten und in voller Länge Formen von HIV-1- Reverse-Transkriptase-9. Diese bahnbrechenden Studien gezeigt, dass Protein Co-Expression stellt eine leistungsstarke Alternative zu herkömmlichen in vitro Rekonstitution. Zusätzlich Protein Co-Expression in E. coli wurde verwendet, um verschiedene Proteine ​​tragen post-translationale Modifikationen 2 zu produzieren, um Proteine, die unnatürliche Aminosäuren 2 zu erhalten, und die Ausbeute an überexprimiert Membranproteine ​​2 zu erhöhen. Ferner wird das Potential der Protein Coexpression als Werkzeug zum E. verleihen coli Wettbewerbnce in Proteinsekretion ist aktiv untersucht 2.

Zwei Hauptstrategien von Protein Co-Expression in E. coli können verfolgt werden: i) die Verwendung eines einzigen Plasmid, um die verschiedenen Gene Gastgeber zu überexprimiert wird; ii) die Verwendung von mehreren Plasmiden in einzelnen Zellen zu co-exprimieren, die Zielproteine. Im ersten Fall müssen die Kriterien für die Auswahl von Plasmid nicht von denen der traditionellen einzelnen Proteinexpression Experimente unterscheiden, auch wenn insbesondere Plasmide, die Tandem-Promotor / Operator-Elemente wurden für die Co-Expression 10 aufgebaut. Dieser erste Ansatz ist daher ganz einfach. Es sollte jedoch erwähnt werden, dass die Verwendung von einem einzigen Plasmid zu co-exprimieren verschiedene Proteine ​​vor zwei Hauptschwierigkeiten: i) die Molekularmasse des Vektors mit der Anzahl von bereitgestellten Gene, wodurch die Anzahl der co-exprimierten Proteine; ii) wenn mehrere Gene unter der Kontrolle eines einzelnen Promotors kloniert, können Polarität Verklee die Expression der Gene, die distal von dem Promotor. Die Verwendung von Doppel- oder Mehrfach Plasmide in Einzel E. coli-Zellen hat, um die Kompatibilität der Vektoren der Wahl zu erreichen, daher Ohne Zwang auf die förderfähigen Kombinationen von Plasmiden. Diese zweite Co-Expression Strategie verfügt jedoch den Vorteil, das die Molekülmasse von Vektoren und begrenzt Polarität. Wir haben vor kurzem gebaut ein Protein Co-Expressionssystem entwickelt, um die Pendel von Genen zwischen den Co-Expressionsplasmide 11 zu erleichtern. Insbesondere konstruierten wir das PGOOD Vektoren Serie, die relevanten Merkmale davon sind: i) einem p15A-Replikationsursprung, um die Kompatibilität der PGOOD Plasmide mit den kommerziellen Vektoren, die den ColE1 Ursprung (zB den pBAD-Serie 12) bereitzustellen; ii) ein Tetracyclin-Resistenz-Kassette; iii) die Anwesenheit von lac abgeleitete regulatorische Elemente, dh der Promotor-Operator (O 1) Paar und das lacI q Gen. Unter Verwendung eines geeigneten pBAD-PGOOD Paar, waren wir in der Lage, den katalytischen Kern von E. überexprimieren coli-DNA-Polymerase III, die aus drei verschiedenen Untereinheiten zusammengesetzt ist, das heißt, α (der 5'-3'-Polymerase), ε (der 3'-5'-Exonuklease) und θ (Stabilisierungs ε) 13. Insbesondere haben wir gezeigt, dass die Co-Expression des αεθ Komplex war streng abhängig von der zusätzlich zu dem E. coli-Kulturmedium sowohl IPTG und Arabinose, Auslösung Expression von PGOOD und pBAD, bzw. (1A).

In diesem Bericht zeigen wir, wie Protein Co-Expression effizient Schwierigkeiten der schlechten Löslichkeit von einem Proteinkomplex Untereinheit verbunden zu lösen. Darüber hinaus zeigen wir, wie in vivo Protein Ergänzung Tests durchgeführt werden, und wir endlich über die Verwendung von Protein Co-Expression zu stimmen Mutationsfrequenz in E. berichten colich a. Zu diesem Zweck haben wir PGOOD-pBAD Paare geeignet, relevante Beispiele für jede Fallstudie veranschaulichen.

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Protokoll

1. Isolierung von E. coli Cotransformanten

  1. Bereiten elektrokompetenten Zellen des entsprechenden E. coli-Stamm transformiert werden. Transfer zum 1 ml LB-Medium (Trypton, Hefeextrakt, NaCl bei 10, 5 und 10 g / L, respectively) einer Einzelkolonie des Stammes der Wahl, und bei 37 ° C unter Schütteln Bedingungen von 180 Umdrehungen pro Minute. Verdünne die Vorkultur 1: 500 in 25 ml frischem LB-Medium und Inkubation der Kultur bei 37 ° C.
  2. Bei log-Phase (0,6 OD) Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 5.000 × g für 20 min), und das Pellet in 10%, v / v eiskaltes steriles Glycerin-Wasser in die Hälfte des ursprünglichen Kulturvolumens. Wiederholen Sie diesen Schritt 4 Mal, jedes Mal, wenn die Halbierung der Resuspensionsvolumen. Schließlich das Pellet in Glycerin / Wasser und teilen Sie die Zellsuspension in 50 ul Aliquots. Bewahren Sie die Aliquots bei -80 ° C bis zu 6 Monaten.
  3. Lösen Sie das gewünschte Plasmid in sterilem Wasser mit 0,5 mM EDTA ergänzt. Thaw auf ice ein Aliquot elektrokompetenter Zellen und Mischen mit einer geeigneten Menge (2,5-5 ng) des Vektors. Abgeben der Mischung in eine 0,1 cm-Küvette für Elektroporation und gelten 1,8 kV.
  4. Die elektroporierten Zellen unmittelbar Transfer in 1 ml SOC-Medium (LB-Medium mit 0,2% w / v Glucose, 10 mM MgCl 2, 2,5 mM KCl ergänzt), Inkubation für 1 h unter Schütteln und schließlich dann 100 ul Aliquots auf Petrischalen, LB-Agar mit dem entsprechenden Antibiotikum. Inkubieren Sie O / N bei 37 ° C.
  5. Reinige die Transformanten durch Ausstreichen von Einzelkolonien auf Petrischalen.
  6. Bereiten von elektrokompetenten Zellen der primären Transformanten und die Schritte 1.1 bis 1.5 mit weiteren Plasmide transformieren.
  7. Bereiten Glycerin Aktien der Co-Transformanten. Übertragen einer einzelnen Kolonie in LB mit den geeigneten Antibiotika ergänzt, bei 37 ° C unter Schütteln und bei log-Phase (0,6 OD) Zentrifuge die Zellen Suspension bei 5000 g für 20 min. Resuspend des Pellets in LB-Medium, das Antibiotika, 15% v / v Glycerin. Dispense in Aliquots und Lagerung ist - 80 ° C.

2. Die Co-Expression von α und ε-Untereinheiten von E. coli DNA Polymerase III

  1. Übertragen Sie mit einer sterilen Schleife eine kleine Menge des entsprechenden Stammes Glycerolstammlösung (zB TOP10 / PGOOD-ε243 und TOP10 / PGOOD-ε243-θ / pBADα1160, siehe Abbildung 1) in eine Petrischale mit LB-Medium und Antibiotika. Lassen Sie die Zellsuspension trocken auf die Petrischale, und streifen die Zellen Tröpfchen. Bei 37 ° CO / N.
  2. Transfer mit einem sterilen Zahnstocher eine einzelne Kolonie zu 1 ml LB-Medium Antibiotika. Inkubieren 8 h bei 37 ° C. Verdünnen Sie die Vorkultur 1: 500 in frischem Medium und Inkubation bei 30 ° C für 15 Stunden.
  3. Fügen IPTG, Arabinose, oder Arabinose und IPTG, 1 mM jeweils. Inkubiere bei 30 ° C für 2,5 Std. Sammeln Sie die Zellen, und die Pellets lagern bei -20 ° C.
  4. Tau-Pellets auf Eis und Resuspendieren in Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2,5 mM Dithiothreitol, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), pH 8). Homogenisierung vorsichtig die Zellsuspension mit einem kalten Glas Töpfer.
  5. Ultraschallbehandlung bei 15 W für 15 Sekunden, gefolgt von 15 Sekunden Kühlintervall (4 Zyklen).
  6. Zentrifugieren der Gesamtproteinextrakte bei 10.000 × g für 20 min bei 4 ° C, um die lösliche Fraktion zu gewinnen.
  7. Analyse durch SDS-PAGE (12,5% Acrylamid) Aliquots jeder löslichen Proteinextrakt. Zu diesem Zweck übertragen 20 ul jeder löslichen Proteinextrakt in Eppendorf-Röhrchen, enthaltend 60 & mgr; l H 2 O und 20 & mgr; l Ladepuffer (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10 mM β-Mercaptoethanol, 10% (w / v) SDS, 50% (v / v) Glycerin, 0,25% (w / v) Bromphenolblau) eingestellt und die Mischung 5 min. Last 18 ul jeder Probe und führen Sie die Elektrophorese bei 140 V für ca. 1,5 Stunden.

3. Co-Expression der α-Untereinheit des Deinococcus durans DNA Polymerase III und ε-Untereinheit von E. coli DNA Polymerase III

  1. Bereiten Sie eine Vorkultur des E. coli-Stamm TOP10 / pBAD-α Dr / PGOOD-ε243 in 1 ml LB-Ampicillin-Tetracyclin Medium und Inkubation 8 h bei 37 ° C. Gebrauchslösung: 1: 1000 in frischem Medium und Inkubation O / N bei 37 ° C.
  2. Verdünne 1: 100 in 200 ml frischem Medium, Inkubation bei 37 ° C für 3 Stunden inkubiert, anschließend für 3 h mit Arabinose und IPTG, 1 mM jedes induzieren. Ernten Sie die Zellen, und speichern Sie das Pellet bei -20 ° C.
  3. Das Pellet in 50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF. Homogenisieren und stören die Zellen wie in 2.4 und 2.5 beschrieben.
  4. Unmittelbar Zentrifuge die Zellen Lysat bei 10.000 × g für 20 min. Entsorgen Sie das Pellet. Den Überstand mit einem Büchner-Trichter mit 3 Lagen Filterpapier ausgestattet. Bewerben leichtem Vakuum. Um eine übermäßige Schaumbildung zu vermeiden, halten das Vakuum-Erlenmeyerkolben auf Eis während der Filtration.
  5. Bestimmen der Proteinkonzentration nach Bradford 14.

4. Gelfiltrationschromatographie

  1. Äquilibrieren einem mit Wassermantel 16x70 (200) Gelfiltrationssäule mit 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8. Laden auf die Säule die löslichen Proteinextrakt. Für die optimale Auflösung, verwenden Sie ein 1 ml Probenschleife. Führen Sie die Chromatographie bei 0,6 ml / min. Halten Säulentemperatur bei 4 ° C im gesamten.
  2. Sammeln 0,9 ml-Fraktionen und zu analysieren durch SDS-PAGE. Transfer 20 ul jeder relevanten Fraktion in Eppendorf-Röhrchen, enthaltend 60 & mgr; l H 2 O und 20 & mgr; l Ladepuffer (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10 mM β-Mercaptoethanol, 10% (w / v) SDS, 50% ( v / v) Glycerol, 0,25% (w / v) Bromphenolblau) eingestellt und die Mischung 5 min. Last 18 ul jeder Probe und führen Sie die Elektrophorese bei 140 V für ca. 1,5 Stunden.
  3. Bestimmen die 3'-5'-Exonuclease und der DNA-Polymerase-Aktivität von jeder Fraktion in 96-well Mikrotiterplatten. Assay wird die Exonukleaseaktivität mit Thymidin-5'-monophosphat-p-nitrophenylester (p NP-TMP) als das Substrat 15. Abzuschätzen DNA-Polymerase-Aktivität unter Verwendung des PPX (Pyrophosphatase, Purinnucleosidphosphorylase, Xanthinoxidase) enzymgekoppelten Assay 16 und 2- (4-Jodphenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5-phenyl-2H-tetrazoliumchlorid (INT) als Elektronenakzeptor 16.

5. Mutationsanalyse von Populationen Co-Expression des Wildtyp-ε-Untereinheit der E. coli-DNA-Polymerase III und die mutagene εD12A Variant

  1. Übertragen einer Einzelkolonie von E. coli TOP10, die das pBAD-ε und die pGOOD1-εD12A 11 Vektoren zu 1 ml LB-Medium Antibiotika. Inkubieren Sie O / N bei 37 ° C.
  2. Verdünnen Sie die Vorkultur 1: 250 in 3-Kolben mit frischem Medium (10 ml), fügen Sie die entsprechenden Induktoren (Arabinose, IPTG oder Arabinose und IPTG 1 mM jeweils) und bei 37 ° C8 h. Bereiten parallel nicht-induzierten Kulturen.
  3. Sammeln Aliquots von 1 ml, dann verdünnt 1: 500 in neue Kolben mit frischem Medium (10 ml) ergänzt oder nicht mit den entsprechenden Induktoren. Inkubieren Sie O / N bei 37 ° C.
  4. Wiederholen Sie die Schritte 5.2 und 5.3 und sammeln Aliquots von 1 ml.
  5. Bestimmung der Anzahl der Generationen in jeder Kultur aufgetreten. Übertragen auf LB-Platten, 100 & mgr; l geeignete Verdünnungen des Inokulums und der Kultur. Inkubieren Sie O / N bei 37 ° C. Die Kolonien auf den LB-Platten, und berechnet den Logarithmus der Anzahl der im Inokulum vorhanden ist (log I) und in der Kultur am Ende des Wachstums (log C) Zellen. Um die Anzahl der Generationen zu bestimmen, verwenden Sie die Formel: (log C - log I) /0.301.
  6. Zentrifuge bei 5000 × g für 20 min, und die Zellen werden in 1 ml 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 50 mM NaCl. Um die Zellen durchlässig, fügen Sie 2-3 Tropfen Chloroform und Vortex für 20 Sekunden.
  7. Bestimmen Sie die β-Glukosidase Aktivität jedes Aliquot in einer 96-Well-Mikroplatte, unter Verwendung von p-Nitrophenyl-β-D-glucopyranosid (PNPGluc) als Substrat. Hinzufügen zu jeder Vertiefung 100 ul der permeabilisierten Zellen und 100 ul Substrat (16 mg / ml Stammlösung in H 2 O). Achten Sie auf Luftblasen in den Vertiefungen zu vermeiden. Die Absorption bei 420 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegerät und den entsprechenden Filter.

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Ergebnisse

Die ε-Untereinheit der E. coli-DNA-Polymerase III aus 243 Aminosäuren und verfügt Schwerlöslichkeit 17,18, wenn die Stoffreste 187-243 deletiert 17. Allerdings haben wir früher gezeigt haben, dass 11 die Co-Expression von Volllängen-α, ε und θ-Untereinheiten ergibt lösliche DNA-Polymerase III katalytischen Kern (Abbildung 1). Insbesondere unter Verwendung des pBAD-PGOOD Co-Expressionssystem, zeigten wir, dass: i) die Überexpression von α und ε-Untereinheiten kön...

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Diskussion

Proteine ​​können sich nicht in Ordnung sein, mit Regionen, deren Tertiärstruktur ist nicht auf eine begrenzte Anzahl von Konformationen, 25 beschränkt. Diese ungeordnete Proteine ​​sind in der Regel anfälliger für Aggregation 25, und deren Isolierung und Charakterisierung könnte eine schwierige Aufgabe darstellen. Die ε-Untereinheit der E. coli-DNA-Polymerase III verfügt über zwei getrennte Bereiche 26,27, und zwar: i) die N-ter-Domain, mit dem 3'-5'-Exonukleaseaktivitä...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Die Genehmigung von Springer und Elsevier Zahlen Nachdruck stark anerkannt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AgarSigma-AldrichA1296
AmpicillinSigma-AldrichA9518
ChloroformSigma-Aldrich288306
EDTASigma-AldrichEDS
GlycerinSigma-AldrichG5516
INTSigma-AldrichI8377
IPTGSigma-AldrichI5502
KClSigma-AldrichP9541
L-ArabinoseSigma-AldrichA3256
MgCl2Sigma-AldrichM2670
NaClSigma-Aldrich31434
PMSFSigma-AldrichP7626
PNP-glucSigma-AldrichN7006
pNP-TMPSigma-AldrichT0251
TetracyclinSigma-Aldrich87128
Trizma base Sigma-AldrichT1503
TryptonSigma-Aldrich95039
HefeextraktFluka70161
Acrylamidlösung 30%BioRad161-0158Für die Gelelektrophorese
AmmoniumpersolphatBioRad161-0700Für die Gelelektrophorese
GlycinBioRad161-0718Für Gel Elektrophorese
SDSBioRad161-0302Für Gelelektrophorese
TEMEDBioRad161-0800Für Gelelektrophorese
TrisBioRad161-0719Für Gelelektrophorese
Küvetten 0,1 cmBioRad1652089Für Elektroporation
Zentrifuge 5415REppendorf
Zentrifuge Allegra 21RBeckman
Chromatographiegerät GradiFracPharmacia Biotech
Gene Pulser II ElektroporationBioRad Microplate
Reader 550Biorad
MiniProtean 3 ZellenBioRad
NetzteilBioRad
Ultraschallgerät 3000Misonix

Referenzen

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