Eine vergleichende Analyse der Expression rekombinanter Proteine ​​in verschiedenen Biofabrik: Bakterien, Insektenzellen und Pflanzensysteme

Summary

In dieser Studie wurde die Expression eines humanen rekombinanten Zielproteins in verschiedenen Produktionsplattformen verglichen. Wir konzentrierten uns auf traditionelle fermenterbasierte Kulturen und auf Pflanzen, beschrieben den Aufbau jedes Systems und hoben auf der Grundlage der berichteten Ergebnisse die inhärenten Grenzen und Vorteile für jede Plattform hervor.

Abstract

Pflanzliche Systeme sind als wertvolle Plattform für die Produktion rekombinanter Proteine ​​als Ergebnis ihrer gut dokumentierten Potential für die flexible und kostengünstige Herstellung von qualitativ hochwertigen, bioaktive Produkte.

In dieser Studie verglichen wir die Expression eines Ziel humanen rekombinanten Protein in herkömmlichen Fermenter basierenden Zellkulturen (Bakterien und Insekten) mit pflanzlichen Expressionssysteme, sowohl transient und stabil.

Für jede Plattform beschrieben wir den Aufbau, die Optimierung und die Länge der Herstellungsverfahren, der Endproduktqualität und der Ausbeute und wir geprüft vorläufigen Herstellungskosten, die spezifisch für das ausgewählte rekombinante Zielprotein fusionieren.

Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse, dass die Bakterien zur Produktion des Zielproteins ungeeignet aufgrund ihrer Akkumulation in unlöslichen Einschlusskörpern. Andererseits sind Pflanzenbasierte Systeme flexiblen Plattformen tKappe ermöglichen die Produktion des ausgewählten Proteins zu niedrigeren Kosten als die Baculovirus / Insektenzellsystem. Insbesondere angezeigten stabilen transgenen Linien die höchste Ausbeute des Endproduktes und vorübergehend exprimierenden Pflanzen der schnellste Prozessentwicklung. Allerdings können nicht alle rekombinanten Proteinen aus pflanzlichen Systemen profitieren, aber die beste Produktionsplattform sollte empirisch mit einer Fall-zu-Fall-Ansatz bestimmt werden kann, wie hier beschrieben.

Introduction

Rekombinante Proteine werden kommerziell in heterologen Expressionssystemen mit Hilfe neuer biotechnologischer Werkzeuge in Massenproduktion hergestellt. Zu den Schlüsselfaktoren, die bei der Auswahl des heterologen Expressionssystems berücksichtigt werden müssen, gehören: Proteinqualität, Funktionalität, Prozessgeschwindigkeit, Ausbeute und Kosten.

Im Bereich der rekombinanten Proteine expandiert der Markt für Pharmazeutika schnell und folglich sind die meisten heute hergestellten Biopharmazeutika rekombinant. Proteine können in Zellkulturen von Bakterien, Hefen, Schimmelpilzen, Säugetieren, Pflanzen und Insekten sowie in pflanzlichen Systemen (entweder über stabile oder transiente Transformation) und transgenen Tieren exprimiert werden; Jedes Expressionssystem hat seine inhärenten Vorteile und Grenzen, und für jedes rekombinante Zielprotein muss das optimale Produktionssystem sorgfältig evaluiert werden.

Pflanzliche Plattformen entstehen als wichtige Alternative zu herkömmlichen fermenterbasierten Systemen für eine sichere und kostengünstige rekombinante Proteinproduktion. Obwohl die Kosten für die nachgelagerte Verarbeitung mit denen von mikrobiellen Zellen und Säugetierzellen vergleichbar sind, sind die geringeren Vorabinvestitionen, die für die kommerzielle Produktion in Pflanzen erforderlich sind, und die potenziellen Skaleneffekte, die durch den großflächigen Anbau erzielt werden, entscheidende Vorteile.

Wir untersuchten Pflanzen als Bioreaktoren für die Expression der 65 kDa-Isoform der humanen Glutaminsäure-Decarboxylase (hGAD65), eines der wichtigsten Autoantigene bei Typ-1-Autoimmundiabetes (T1D). hGAD65 wird weitgehend als Marker verwendet, sowohl zur Klassifizierung als auch zur Überwachung des Fortschreitens der Krankheit, und seine Rolle bei der T1D-Prävention wird derzeit in klinischen Studien untersucht. Wenn diese Versuche erfolgreich verlaufen, wird die weltweite Nachfrage nach rekombinantem hGAD65 drastisch steigen.

Hier konzentrieren wir uns auf die Expression des enzymatisch inaktiven Gegenstücks von hGAD65, hGAD65mut, einer Mutante, die durch Substitution des Lysinrests, der den Cofaktor PLP (Pyridoxal-5'-phosphat) bindet, mit einem Argininrest (K396R)¹

erzeugt wird.

hGAD65mut behält seine Immunogenität bei und reichert sich in Pflanzen- und Insektenzellen bis zu zehnmal höher an als hGAD65, sein Wildtyp-Gegenstück. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die enzymatische Aktivität von hGAD65 in den Stoffwechsel der Pflanzenzellen so stark eingreift, dass es seine eigene Synthese unterdrückt, während hGAD65mut, die enzymatisch inaktive Form, in Pflanzenzellen auf einem höheren Niveau akkumuliert werden kann.

Für die Expression von hGAD65mut wurde hier der Einsatz verschiedener Technologien, die in der Pflanzenbiotechnologie weit verbreitet sind, untersucht und mit traditionellen Expressionsplattformen (Escherichia coli und Baculovirus/Insektenzell-basiert) verglichen.

In dieser Arbeit wurden die rekombinanten Plattformen, die für die Expression von hGAD65mut entwickelt wurden und traditionelle und pflanzliche Systeme umfassen, auf der Grundlage von Prozessgeschwindigkeit und -ausbeute sowie der Qualität und Funktionalität des Endprodukts überprüft und verglichen.

Protocol

1. Konstruktion von Expressionsvektoren

1. Kommerzielle Rekombination Klonierungssystem:
   1. Erhöhen der Volllängensequenz des Zielgens (hGAD65mut) mit geeigneten Primern, die den Zusatz eines CACC Klemme am 5'-Ende des Gens, wie zuvor beschrieben ^2.
   2. Klonierung des gelgereinigten Amplifikationsprodukt entsprechend den Richtungs Klonierungskit Spezifikationen, in der Eingangsvektor (Topoisomerase gebunden) durch Zusammensetzen, die Reaktion in einem Gesamtvolumen von 6 & mgr; l, mit einem 1,5: 1-Molverhältnis Insert: Vektor und 1 & mgr; Salzlösung (0,2 M NaCl und 0,01 MgCl _2). Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur (RT).
   3. Verwandeln Sie das gesamte Reaktions in chemisch kompetente E. coli-Zellen gemäß Richtungs Klonierungskit Spezifikationen und Bildschirm erhaltenen Kolonien durch Kolonie-PCR ³ mit den M13 Vorwärts- und Rückwärtsprimer in der gerichteten Klonierung Kit enthalten. Trennen Sie das Plasmid von einem poempfindlichen Kolonie nach Plasmid-DNA-Präparation Kit Spezifikationen und Sequenz der Einsatz unter Verwendung von M13 Vorwärts- und Rückwärtsprimer, um die Abwesenheit von Mutationen ³ zu gewährleisten.
   4. Verwenden Sie das erhalten entry clone, um die Rekombinationsreaktion von der Lambda-Rekombinase Clonase II Enzyme (LR) mit spezifischen Zielvektoren durchführen: für Expression rekombinanter Proteine ​​in Bakterienzellen mit pDEST17 (was pDEST17.G65mut), bei Pflanzen (transient oder stabil) mit pK7WG2 (Streck pK7WG2.G65mut) in Baculovirus / Insektenzellen-System mit dem linearisierten Virus-DNA (wodurch Baculo.G65mut) ^4. Montieren der Reaktion nach Clonase Kit Spezifikationen, mit 100 ng der Eingangsvektor, 150 ng des Zielvektors und 2 & mgr; l Enzymgemisch in einem Endvolumen von 10 ul. Inkubieren des Gemisches bei Raumtemperatur für 1 Std.
   5. Wandeln Sie die Rekombinationsprodukt in chemisch kompetente E. coli-Zellen gemäß Clonase Kit Spezifikationen. Bildschirm erhaltenen Kolonien durch ^PCR-3 mit für alle Transformationsreaktion abgeleitet Kolonien der gleichen Reverse GAD65mut spezifischen Primers (5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ') und den folgenden spezifischen Zielvektoren Vorwärts-Primer: für pDEST17: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'; für pK7WG2: 5'-AAGATGCCTCTGCCGACAGT-3 '; für Baculo linearisierte Vektor: 5'-AAATGATAACCATCTCGC-3 '.
   6. Isolieren von Plasmid-DNA unter Verwendung eines kommerziellen DNA-Minipräparation Kit und bestätigen das Vorliegen der Zielsequenz durch PCR ³ mit Hilfe der in dem vorherigen Schritt beschrieben gleichen spezifischen Primer-Kombinationen.
   7. Mit den erhaltenen PCR-positive Plasmide, verschiedene Zielorganismen zu transformieren, in Abhängigkeit von dem für die rekombinante Proteinexpression gewählt, wie in den folgenden Schritten beschrieben Plattform.
2. MagnICON System ^5-7:
   1. Klonierung des Zielgens in der 3'-Modul pICH31070, wie zuvor im Detail ⁷ beschrieben, wodurch pICH31070.G65mut. Verwenden Sie diefolgenden spezifischen Reaktionszyklus: 30 min Inkubation bei 37 ° C, 5 min bei 50 ° C und dann 5 min bei 80 ° C.

2. Expression rekombinanter Proteine

1. Bakterielle Zellsystem:
   1. Trans pDEST17.G65mut in E. coli BL21 (DE3) elektrokompetente Zellen unter Verwendung von Standardtechniken und Screening der Kolonien auf Ampicillin-haltigen (100 ug / ml) gezüchtet LB-Medium, durch Kolonie-PCR unter Verwendung der folgenden Transgen-spezifische Primer: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 'und 5' -CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ', mit einer Annealingtemperatur von 58 ° C und einer Dehnung von 20 sec. Durchführung der PCR-Reaktion in einem Gesamtvolumen von 20 ul nach Auflösen Bakterienzellen mit einer Kunststoffspitze in die Röhre.
   2. Beimpfen von einer Einzelkolonie über Nacht bei 37 ° C in 3 ml ampicillinhaltigem (100 ug / ml) LB-Medium.
   3. Verdünne die Bakterienkultur 1: 100 in 100 ml frisches LB-Medium (einschließlich ampicillin) und bei 37 ° C für 1-6 Stunden bis zu einer endgültigen OD ₆₀₀ von 0,8.
   4. Induzieren rekombinanten Proteinexpression durch Zugabe von isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) in einer Endkonzentration von 1 mM und Inkubation Kultur unter heftigem Schütteln für 3 h bei 37 ° C.
   5. Sammle die Zellen durch Zentrifugation bei 4.000 × g für 20 min und mit Bakterienpellet zur Proteinextraktion (Schritt 3.1.1.1).
2. Baculovirus / Insektenzellen-System:
   1. Samen Spodoptera frugiperda (Sf9) Zellen in 6-Well-Platten (8 x 10 ⁵ Zellen pro Vertiefung) und waschen zweimal mit 2 ml nicht ergänzt Grace Insektenmedium.
   2. Entfernen und ersetzen Sie das Medium tropfenweise mit Transfektionsmischung (5 ul LR rekombinanten Reaktion, 6 ul Celfectin Lösung und 200 ul nicht-ergänzten Graces Insekt Medium).
   3. Inkubation erfolgt bei 27 ° C für 5 Stunden.
   4. Entfernen und ersetzen Sie Transfektion Gemisch mit 2 ml frischem Sf-900 Medium mit 10% fötalem Rinderserum, 10 ug / ml Gentamycin und 100 uM Ganciclovir ergänzt rekombinanten Baculovirus-Klone auszuwählen.
   5. Nach einer Inkubationszeit von 96 Stunden bei 27 ° C, sammeln Medium (V1 virale Stammlösung), Zentrifuge bei 4.000 xg für Zellen und große Trümmer und bei 4 ° C zu entfernen in der Dunkelheit.
   6. Seed 1 x 10 ⁶ Sf9-Zellen pro Vertiefung in 2,5 ml Sf-900-Medium mit 10% fötalem Rinderserum, 10 ug / ml Gentamycin und 100 uM Ganciclovir und infizieren mit 100 ul V1 Lager in jede gut.
   7. Inkubieren Zellen 3 Tage lang bei 27 ° C.
   8. Sammeln und Zentrifuge Medium bei 4000 x g.
   9. Lagern Sie den Überstand (V2 hochtitrige Lager) bei 4 ° C.
   10. Seed 1 x 10 ⁶ Sf9-Zellen pro Vertiefung in 2,5 ml Sf-900-Medium mit 10% fötalem Rinderserum, 10 ug / ml Gentamycin und 100 uM Ganciclovir und infizieren mit 25 ul V2 Lager in jede gut.
   11. Inkubieren Zellen 3 Tage lang bei 27 ° C.
   12. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 4000 xg und benutzen Insektenzellpellet zur Proteinextraktion (Schritt 3.1.2. 1).
3. Nicotiana benthamiana vorübergehende Expressionssysteme:
   1. Wachsen N. benthamiana Pflanzen im Gewächshaus, unter natürlichem Licht in einem Temperaturbereich von 18 bis 23 ° C. Für Agroinfektion verwenden 4-5 Wochen alten Pflanzen.
   2. Halten agroinfected Pflanzen in einer Klimakammer bei 22 ° C mit einer 13 Stunden am Tag / 11 h Nachtphotoperiode.
   3. Kommerzielle Rekombination Klonierungssystem:
      1. Einzuführen pK7WG2.G65mut in Agrobacterium tumefaciens-Stamm EHA105 elektro Zellen wie zuvor beschrieben ⁸ und screenen, die Kolonien auf LB-Medium, das Rifampicin (50 ug / ml), Streptomycin (300 ug / ml) und Spectinomycin (100 ug / ml) nach 2 gezüchtet Tagen Inkubation bei 28 ° C, durch Kolonie-PCR unter Verwendung der folgenden ^{8-Transgen-spezifische} Primer: 5'-CATGGTGGAGCACGACACGCT-3 & #8217; und 5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ', mit einer Annealingtemperatur von 58 ° C und einer Elongationszeit von 50 Sekunden. Durchführung der PCR-Reaktion in einem Gesamtvolumen von 20 ul.
      2. Beimpfen von Bakterien in 30 ml LB-Medium, das Rifampicin (50 ug / ml), Streptomycin (300 ug / ml) und Spectinomycin (100 ug / ml) für zwei Tage bei 28 ° C.
      3. Sammeln Bakterien durch Zentrifugation bei 4.000 × g für 20 min und das Pellet erneut in 10 ml Infiltrations Puffer (10 mM MES, 10 mM MgCl _2, 100 & mgr; M Acetosyringon, pH 5,6). Messen Sie die _OD600-Wert und passen Sie sie auf 0,9 durch Verdünnen in dem gleichen Puffer.
         HINWEIS: das Gesamtvolumen zum Infiltrieren drei N. erforderlich benthamiana Pflanzen ist 30 ml.
      4. Verwenden Sie eine 2,5 ml Spritze ohne Nadel, um die Agrobacterium-Suspension in N. infiltrieren benthamiana Blätter. Vorsichtig und langsam injiziert Blatt Platten mit der Suspension aus der Spritze. Infiltrieren drei erweitert lTraufe pro Pflanze und verwenden drei Pflanzen als dreifach.
         HINWEIS: für Gesundheits- und Sicherheitsgründen eine Schutzbrille tragen bei Infiltrationsprozess.
      5. Sammeln agroinfiltrated Blättern 2 Tage nach der Infektion (dpi) und gefrier in flüssigem Stickstoff. Speicher Pflanzengewebe bei -80 ° C.
   4. MagnICON System:
      1. Führen Sie die magnICON Vektoren - die "Modul (pICH20111), die 3'-5-Modul (pICH31070.G65mut) und die Integrase-Modul (pICH14011) - in A. tumefaciens GV3101 Stamm unter Verwendung von Standardverfahren. Bildschirm die Kolonien auf LB-Medium gezüchtet 50 ug / ml Rifampicin und geeigneten Vektor spezifische Antibiotika (50 ug / ml Carbenicillin für pICH20111 und pICH14011, 50 ug / ml Kanamycin für pICH31070), durch Kolonie-PCR mit spezifischen Primern für jeden Vektor.
      2. Impfen Sie separat die drei A. tumefaciens-Stämme in 5 ml LB-Medium, das 50 ug / ml Rifampicin und entsprechenden vektorspezifischen antibiotischenund schütteln über Nacht bei 28 ° C.
      3. Pellet über Nacht Bakterienkulturen durch Zentrifugation bei 4.000 xg für 20 Minuten und Resuspendieren sie in zwei Volumen der anfänglichen Bakterienkultur von 10 mM MES (pH 5,5) und 10 mM MgSO _4.
      4. Mischen Sie gleiche Volumina Bakteriensuspensionen mit den drei Vektoren und verwenden Sie die Aufhängung Mix für Spritze Infiltration von N. benthamiana Blätter. Infiltrieren drei entwickelte Blätter pro Pflanze.
      5. Sammeln agroinfiltrated Blätter 4 dpi und frieren in flüssigem Stickstoff.
      6. Speicher Pflanzengewebe bei -80 ° C.
4. Nicotiana tabacum stabiles Expressionssystem:
   1. Aufbau und zur Pflege in vitro Pflänzchen von N. tabacum (var Sr1.) auf festen Pflanzenkulturmedium (4,4 g / l Murashige und Skoog - MS - Medium, das Vitamine, 30 g / l Saccharose, pH 5,8, 7 g / L Plant Agar) unter kontrollierten Bedingungen im Klimaraum bei 25 ° C bei 16 h / 8 h Tag / night Regimes.
   2. Starten Sie eine Vorkultur von A. tumefaciens EHA105 den Expressionsvektor pK7WG2.G65mut in 5 ml YEB Flüssigmedium mit geeigneten Antibiotika (Rifampicin 50 & mgr; g / ml, Streptomycin 300 ug / ml Spectinomycin 100 ug / ml) und über Nacht wachsen bei 28 ° C in einem Orbitalschüttler set bei 200 Umdrehungen pro Minute.
   3. Verwenden 1 ml der Vorkultur, um eine 50 ml Agrobacterium-Kultur in YEB-Medium plus Antibiotika beimpfen (Rifampicin 50 & mgr; g / ml, Streptomycin 300 ug / ml Spectinomycin 100 ug / ml) wachsen und für 24 h, bis die Bakterienkultur gesättigte (OD _600-Wert von 0,5 bis 1,0).
   4. Sammeln Bakterien durch Zentrifugation bei 4.000 × g für 20 min und das Pellet erneut in 50 ml des flüssigen Pflanzenkulturmedium. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal gegen Antibiotika vollständig zu entfernen.
   5. Nehmen Sie die erste gesunde voll entwickelte Blätter von in-vitro-Tabakpflanzen und schneiden sie in ca. 1 cm große Quadrate.
   6. Überblattstücketiefe Petrischalen mit Bakteriensuspension und verlassen im Dunkeln für 20 min.
   7. Entfernen Sie Blattstücke von der Aussetzung und trocken tupfen auf sterilem Filterpapier.
   8. Platzieren Blattstückchen mit adaxial Seite (obere Blattoberfläche) auf festen Pflanzenkulturmedium, das 1,0 ug / ml 6-Benzylaminopurin (BAP) und 0,1 & mgr; g / ml Naphthalinessigsäure (NAA) und inkubieren Platten für zwei Tage in einem Klimaraum bei kontrollierter Bedingungen (25 ° C, 16 Stunden am Tag / 8 Stunden Nacht).
   9. Überblattstücke auf festen Kulturmedium (einschließlich 1,0 g / ml BAP, 0,1 ug / ml NAA, 500 ug / ml Cefotaxim, 100 ug / ml Kanamycin) mit abaxial Oberfläche (untere Oberfläche des Blattes) in Kontakt mit dem Medium.
   10. Platten für 2-3 Wochen in der Klimakammer Inkubation bei 25 ° C und 16 h / 8 h Tag / Nacht-Regime Triebbildung zu induzieren. Subculture alle 2 Wochen durch die Übertragung von Blatt Explantate auf frisches festen Pflanzenkulturmedium, das 1,0 ug / ml BAP, 0,1 ug / ml NAA, 500ug / ml Cefotaxim und 100 & mgr; g / ml Kanamycin.
   11. Wenn Triebe erscheinen, übergeben sie an Magenta-Boxen mit festen Kulturmedium mit 500 ug / ml Cefotaxim und 100 ug / ml Kanamycin, um die Wurzelbildung zu induzieren. Pflänzchen mit 16 Stunden am Tag / 8 h Nachtphotoperiode Inkubation bei 25 ° C für 1-2 Wochen.
   12. Wenn Wurzeln bilden, übertragen Sie die Pflanzen auf Boden im Gewächshaus.
   13. Sammeln Sie ein Blattstück für jede Anlage und Isolierung genomischer DNA mit einem kommerziellen Kit.
   14. Die Anwesenheit des Transgens durch spezifische PCR. Benutzen 30 ng genomische DNA als Matrize für die PCR-Amplifikation unter Verwendung der folgenden Transgen-spezifische Primer: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 'und 5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3', mit einer Annealingtemperatur von 58 ° C und einer Dehnung von 20 sec . Durchführung der PCR-Reaktion in einem Gesamtvolumen von 50 ul.
   15. Analysieren Sie den 220 bp-Produkt durch Elektrophorese auf 1% Agarosegel in Tris-Acetat-EDTA-Puffer (TAE) (40 mM Trist, 20 mM Essigsäure und 1 mM EDTA).
   16. Wählen transgenen Pflanzen, die das Zielgen.
   17. Sammeln einer Blattstück aus jedem der ausgewählten transgenen Pflanze und gefrier sofort in flüssigem Stickstoff.
   18. Bereiten Gesamtproteinextrakten aus Pflanzenblattgewebe (Schritt 3.1.3) und testen Sie jede Probe durch Western-Blot-Analyse, wie oben beschrieben ^2, um die besten rekombinante Protein exprimieren Tabakpflanze zu wählen.
   19. Tasche Blumen des ausgewählten leistungsstärksten Anlage vor der Blüte, um Kreuzbestäubung zu verhindern.
   20. Nach der Blüte, Fruchtreife und Samentrocknung, sammeln Taschen.
   21. Separate Samen von der Spreu und speichern sie in einem trockenen Raum bei kontrollierter Temperatur (20-24 ° C).
   22. Säen Sie die getrockneten Samen, um die zweite Generation transgener Pflanzen zu produzieren und anschließend wählen Sie die leistungsstärksten Anlage selbst bestäubt werden.
   23. Wiederholen stufen 2.4.19-2.4.21 nachfolgenden Generationen der gleichen Vorgehensweise.

3. Expression rekombinanter Proteine ​​Analysen

1. Gesamtproteinextraktion:
   1. Bakterienzellen:
      1. Resuspendieren bakterielle Zellpellet gesammelt, wie in Schritt 2.1.5 beschrieben, in der Hälfte des Kulturvolumens von Tris-gepufferter Saline (TBS - 2 mM Tris / HCl, 500 mM NaCl), pH 7,4 mit 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) ergänzt.
      2. Ultraschallbehandlung resuspendiert Zellpellet dreimal für 40 Sekunden bei halber Leistung, während Probe auf Eis.
      3. Klärung Lysat durch Zentrifugieren bei 14.000 xg für 20 min bei 4 ° C.
      4. Überstand in ein sauberes Röhrchen und lagern, Überstand und Pellet getrennt bei -80 ° C.
      5. Solubilisieren der Einschlusskörper, in dem Pellet gesammelt, in Halb Zelllysat Volumen TBS, pH 8,0, mit 6 M Harnstoff durch kräftiges Schütteln über Nacht bei Raumtemperatur ergänzt.
      6. Zentrifugieren bei 10.000 xg für 25 min bei Raumtemperatur und Sammeln Stand in ein sauberesRohr.
      7. Bewahren Sie beide Überstand und Pellet bei -80 ° C.
   2. Insektenzellen:
      1. Waschen infizierten Insektenzellpellet gesammelt, wie in Schritt 2.2.12 beschrieben, mit 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS - 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 1,8 mM KH ₂ PO _4), pH 7,4.
      2. Zellen in 200 ul Lysepuffer (20 mM Tris / HCl pH 8,0, 0,5 M NaCl, 3 mM β-Mercaptoethanol und 1% Tween-20) und Inkubieren auf Eis für 30 min.
      3. Zentrifuge solubilisiert Zellen bei 14.000 × g für 20 min bei 4 ° C.
      4. Sammeln löslichen Fraktionen und bei -80 ° C und entsorgen Sie die Pellets.
   3. Pflanzenblattgewebe:
      1. Grind N. benthamiana oder N. tabacum Gewebe zu einem feinen Pulver in flüssigem Stickstoff mit Mörser und Stößel.
      2. Homogenisieren 100 mg des Grundgewebes in 300 ul Extraktionspuffer (40 mM Hepes pH 7,9, 5 mM DTT, 1,5% CHAPS), supplmit 3 ul Proteaseinhibitorcocktail emented und Auftauen auf Eis.
         Hinweis: Das ausgewählte Verhältnis zwischen Pflanzengewebe Gewicht (g) Volumen (ml) 1-Puffer: 3.
      3. Zentrifuge Extrakt bei 30.000 xg für 30 min bei 4 ° C.
      4. Sammeln Überstand in ein sauberes Röhrchen und bei -80 ° C.
2. Coomassie-Gel-Färbung:
   1. Eine geeignete Verdünnung des Gesamtproteinextrakte (beispielsweise 2 & mgr; l Pflanzenextrakt, 5 & mgr; l der bakteriellen und Insektenextrakte) bis zu einem Endvolumen von 10 & mgr; l Extraktionspuffer und mit 5 ul 3 x Probenpuffer (1,5 M Tris / HCl pH 6,8, 3% SDS, 15% Glycerin, 4% β-Mercaptoethanol) auf eine endgültige Konzentration 1x.
   2. Kochen Sie die Proben für 10 min.
   3. Getrennte Proteine ​​durch 10% SDS-PAGE.
   4. Nach der Elektrophorese Wärme-Gel in Gegenwart von Coomassie-Lösung A (0,05% Brilliantblau R-250, 25% Isopropanol, 10% Essigsäure) in einem Mikrowellenofen für etwa 2 Minutens, bis zum Siedepunkt.
   5. Cool down Gel auf Raumtemperatur unter leichtem Schütteln.
   6. Verwerfen Coomassiefärbung Lösung A
   7. Destain Gel durch Erhitzen in Gegenwart von Coomassie-Lösung B (0,05% Brilliantblau R-250, 25% Isopropanol), C (0,002% Brilliant Blue R-250, 10% Essigsäure) und D (10% Essigsäure) jedesmal Nach dem gleichen Protokoll für die Färbung.
   8. Nach dem letzten Heizschritt mit Lösung D, lassen Gel Entfärben bis Hintergrund klar ^9.
3. Western Blot-Analyse:
   1. Nach der Elektrophorese, Transfer trennten Proteine ​​auf eine Nitrocellulosemembran unter Verwendung von Standardtechniken und Block mit 4% Milch in PBS, pH 7,4, bei Raumtemperatur 1 Std.
   2. Inkubieren des Blots über Nacht bei 4 ° C oder für 4 h bei Raumtemperatur in der Blockierungslösung, enthaltend Kaninchen primären Antikörper gegen das Zielprotein in 1 angehoben: 10.000 und mit 0,1% Tween-20 ergänzt.
   3. Nach der primären Antikörpermarkierunging, waschen Sie die Membran 3 mal 5 Minuten mit jeweils Blockierungslösung, die 0,1% Tween-20.
   4. Inkubieren mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) -Konjugat-Antikaninchen-Antikörper bei 1: 10.000 für 1,5 Std.
   5. Waschen der Membran 5 mal für jede mit PBS-T 5 min (PBS, ergänzt mit 0,1% Tween-20).
   6. Verarbeiten Western Blot unter Verwendung des chemilumineszenten Peroxidase-Substrat.
4. Radioimmunassay (RIA):
   1. Alle Reagenzien (Antiserum, Tracer und Protein A-Sepharose) auf Raumtemperatur und Pipette 20 ul Proteinextrakt Proben und Standards mit unterschiedlichen Konzentrationen (von 300-2,400 ng / ml des kommerziellen rekombinanten hGAD65) in 12 x 75 mm Polystyrolröhrchen zu erreichen.
   2. In 20 ul Antiserum, vorbereitet Verdünnung 1.30 das Serum aus Plasmapherese eines T1D Patienten.
   3. In 50 ul des Tracers (125-I-GAD65) und Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Stellen Sie ein Rohr mit Tracer nur die Gesamtaktivität schätzen.
   4. In 50 ulProtein-A-Sepharose und Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur.
   5. Können 1 ml kaltem PBS in jedes Röhrchen und zentrifugiere Puffer bei 1.500 × g bei 4 ° C für 30 min.
   6. Dekantieren der Röhrchen zu Stand zu entfernen und zu absorbieren Restflüssigkeit auf Löschpapier durch leichtes Antippen Rohr.
   7. Maßnahme immunpräzipitiert Radioaktivität in allen Röhrchen durch Zählen für 1 min in einem Gamma-Zähler.
   8. Grundstück in logarithmischen Skala die Bindungsrate (B / T%) der Kalibratoren zur Gesamtaktivität bezogen, um die Standardkurve zu etablieren und zu lesen GAD Konzentration von Proben aus der Eichkurve ^10.
      HINWEIS: Sperrflächen sollten für die Lagerung, Handhabung und Entsorgung von radioaktivem Material ausgelegt sein.

Results

Eine Versuchsanordnung für die heterologe Expression eines rekombinanten Zielproteins in verschiedenen Produktionssystemen wird hier beschrieben. Der erste Schwerpunkt war der Aufbau der verschiedenen Plattformen durch Festlegung der optimalen Bedingungen für die Expression des Zielproteins in jedem System.

Die Expression des Target-Proteins, hGAD65mut, wurde dreifach induzierten E. coli-Kulturen. Nach 3 h der Expression bei 37 ° C wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugation ges...

Discussion

Bakterienzellen, Baculovirus / Insektenzellen und Pflanzen: In dieser Studie wurden drei verschiedene Plattformen für die Expression eines rekombinanten humanen Proteins verglichen. (- MagnICON und pK7WG2 basiert - und stabile dh transient) Die Anlage-basierte Plattform wurde durch die Nutzung von drei weit verbreitete Ausdruck Technologien erforscht. Der für dieses Experiment, hGAD65mut, ausgewählten Zielproteins wurde zuvor in verschiedenen Systemen ¹³ zum Ausdruck gebracht, und seine Herstellung u...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hefeextrakt	Sigma	Y1333
Trypton	Formedium	TRP03
Agar Bakteriologische Qualität	Applichem	A0949
Sf-900 II SFM Medium	Gibco	10902-088
Grace' s Insektenmedium, unergänzt	Gibco	11595-030
Cellfectin II Reagenz	Invitrogen	10362-100
MS Medium mit Vitaminen	Duchefa Biochemie	M0222
Saccharose	Duchefa Biochemie	S0809
Pflanzenagar	Duchefa Biochemie	P1001
Ampicillin-Natrium	Duchefa Biochemie	A0104	Toxisches
Gentamycinsulfat	Duchefa Biochemie	G0124	Toxisches
Ganciclovir	Invitrogen	I2562-023
Carbenicillin-Dinatrium	Duchefa Biochemie	C0109	Toxisches
Kanamycinsulfat	Sigma	K4000	Toxisches
Rifampicin	Duchefa Biochemie	R0146	Giftig & ndash; 25 mg/ml Bestand an DMSO
Streptomycinsulfat	Duchefa Biochemie	S0148
Toxisches Spectinomycin-Dihydrochlorid	Duchefa Biochemie	S0188
IPTG (Isopropil-β-D-1-Tiogalattopiranosid)	Sigma	I5502	Toxisches
MES-Hydrat	Sigma	M8250
MgCl2	Biochemisch	436994U
Acetosyringon	Sigma	D134406	Toxisch – 0,1 M Vorrat in DMSO-Spritze
(1 ml)	Terumo
MgSO4	Fluka	63136
BAP (6-Benzylaminopurin)	Sigma	B3408	Toxisch
NAA (Naphtalinessigsäure)	Duchefa Biochemie	N0903	Reizstoff
Cefotaxim	Mylan Generika
Trizma base	Sigma	T1503	Passen Sie den pH-Wert mit 1 N HCl an, um Tris-HCl Puffer
HCl	herzustellen Sigma	H1758	Corrosive
NaCl	Sigma	S3014	1 M Lager
KCl	Sigma	P9541
Na2HPO4	Sigma	S7907
KH2PO4	Sigma	P9791
PMSF (Phenylmethansulfonylfluorid)	Sigma	P7626	Ätzender,
giftiger Harnstoff	Sigma	U5378
beta;-mercaptoethanol	Sigma	M3148	giftiges
Tween-20	Sigma	P5927
Hepes	Sigma	H3375
DTT (Dithiothreitol)	Sigma	D0632	Giftig – 1 M Lagerbestand, lagern bei -20 &de; C
CHAPS	Duchefa Biochemie	C1374	Toxischer
pflanzlicher Proteasehemmer-Cocktail	Sigma	P9599	Nicht zu oft einfrieren/auftauen
SDS (Natriumdodecylsulfat)	Sigma	L3771	Entzündlich, giftig, ätzend – 10% Lagerbestand
Glycerin	Sigma	G5516
Brillantblau R-250	Sigma	B7920
Isopropanol	Sigma	24137	Entzündliche
Essigsäure	Sigma	27221	Ätzende
Anti-Glutaminsäure-Decarboxylase 65/67	Sigma	G5163	Nicht zu oft einfrieren/auftauen
Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierter Anti-Kaninchen-Antikörper	Sigma	A6154	Nicht zu oft einfrieren/auftauen
Sf9-Zellen	Leben Technologien	11496
BL21 Kompetent E. coli	New England Biolabs	C2530H
Protein A Sepharose	Sigma	P2545
Zellkulturplatten	Sigma	CLS3516
Radio Immuno Assay Kit	Techno Genetics	12650805	Radioaktives Material