Gezielte DNA Methylierungsanalyse von Next-Generation-Sequencing

Zusammenfassung

Bisulfit-Amplikon-Sequenzierung (BSAS) ist eine Methode zur Quantifizierung der Cytosin-Methylierung in bestimmten genomischen Regionen von Interesse. Bei dieser Methode wird die Bisulfit-Umwandlung in Kombination mit der PCR-Amplifikation von Zielregionen vor der Next-Generation-Sequenzierung verwendet, um eine absolute Quantifizierung der DNA-Methylierung auf basenspezifischer Ebene zu erzielen.

Zusammenfassung

Die Rolle epigenetischer Prozesse bei der Kontrolle der Genexpression ist seit einigen Jahren bekannt. Die DNA-Methylierung an Cytosinresten ist für epigenetische Studien von besonderem Interesse, da sie sich sowohl als lang anhaltender als auch als dynamischer Regulator der Genexpression erwiesen hat. Die Bemühungen, epigenetische Veränderungen von Gesundheit und Krankheit zu untersuchen, wurden durch den Mangel an quantitativ genauen Methoden mit hohem Durchsatz behindert. Mit dem Aufkommen und der Popularisierung von Next-Generation-Sequencing-Technologien (NGS) werden diese Werkzeuge nun zusätzlich zu den bestehenden genomischen und transkriptomischen Methoden in der Epigenomik eingesetzt. Für epigenetische Untersuchungen der Cytosin-Methylierung, bei denen interessante Regionen, wie z. B. spezifische Genpromotoren oder CpG-Inseln, identifiziert wurden und eine signifikante Anzahl von Proben mit hoher quantitativer Genauigkeit untersucht werden muss, haben wir eine Methode namens Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS) entwickelt. Diese Methode kombiniert die Bisulfit-Umwandlung mit der gezielten Amplifikation von interessierenden Regionen, dem Transposomen-vermittelten Bibliotheksaufbau und Benchtop-NGS. BSAS bietet eine schnelle und effiziente Methode zur Analyse von bis zu 10 kb Zielregionen in bis zu 96 Proben gleichzeitig, die von den meisten Forschungsgruppen mit grundlegenden molekularbiologischen Kenntnissen durchgeführt werden kann. Die Ergebnisse liefern eine absolute Quantifizierung der Cytosin-Methylierung mit Basenspezifität. BSAS kann auf jede genomische Region aus jeder DNA-Quelle angewendet werden. Diese Methode ist nützlich für Hypothesenteststudien von Zielregionen von Interesse sowie für die Bestätigung von Regionen, die in genomweiten Methylierungsanalysen identifiziert wurden, wie z. B. die Bisulfit-Sequenzierung des gesamten Genoms, die Bisulfit-Sequenzierung mit reduzierter Repräsentation und die Sequenzierung methylierter DNA-Immunpräzipitation.

Einleitung

Es hat über ein halbes Jahrhundert seit dem ersten Bericht von natürlich vorkommenden DNA-Modifikationen in Form von Cytosin-Methylierung ¹ gewesen. Cytosin-Methylierung ist ein modifiziertes Cytosin Nukleotidbase wo die ^5. Kohlenstoff auf dem Basisring hat eine Methylgruppe (5-MC), die am häufigsten in dem CpG-Dinukleotid-Motiv in Säugergenomen auftritt. Die funktionale Anwesenheit von 5-mC in Gen-Promotoren in der Regel mit Transkriptionsrepression verbunden, während der Abwesenheit ist mit Transkriptionsaktivität ² verbunden.

Enorme Fortschritte in unserem Verständnis von der Rolle der DNA-Methylierung in der Entwicklung ^3. Transgeneration Ausbreitung von epigenetische Profile ^4, Krebs Pathogenese ^5,6, und eine Reihe von anderen Forschungsbereichen vorgenommen. Viele dieser Fortschritte haben in den letzten Jahren kommen, wie neue Methoden entwickelt, um die DNA-Methylierung ⁷ Profil. Mit dem Aufkommen undPopularisierung der Next-Generation-Sequencing (NGS) Techniken gibt es nun eine Reihe von Methoden zur DNA-Methylierung für einen ganzen Genoms oder große Bereiche eines Genoms ⁸ Profil. Diese Ansätze die Möglichkeit offen, Entdeckung Studien, die DNA-Methylierungsmuster und Unterschiede in der DNA-Methylierung zu quantifizieren. Zusätzlich zu diesen Hypothesen-Erzeugungs Ansätze besteht ein erheblicher Bedarf für eine gezielte / Hypothesentests DNA Methylierung Quantifizierungsverfahren.

Pyrosequenzierung methylierungsspezifischen PCR und direkte Sanger-Sequenzierung von Bisulfit umgewandelte DNA waren die am häufigsten verwendete Verfahren zur Analyse von Zielregionen (das heißt, eine Promotorregion von einem Gen oder einer CpG-Insel), ^9-12. Alle diese Verfahren beruhen auf Bisulfitumwandlung, eine chemische Reaktion, bei der Deaminierung unmethylierte Cytosin sind in Uracil umgewandelt, während methylierte Cytosin bleiben intakt ^13,14. PCR-Amplifikation von bisulfite-konvertierter DNA ergibt Ersatz von Uracil mit Thymin ¹⁵ so dass der Differenz Methylierung als Basis Differenz ausgelesen. Während sehr nützlich, die Grenzen zu diesen Verfahren sind geringe quantitative Genauigkeit, kurze Leselänge und geringen Probendurchsatz. Um diese Einschränkungen zu adressieren wir eine Methode haben wir Bisulfit-Sequenzierung Amplicon (BSAS) ¹⁶ bezeichnet wird entwickelt. Das Ziel dieser Methode ist es, in der Lage, Ziel genomischen Regionen von Interesse in einer Vielzahl von Proben mit einer hohen quantitativen Genauigkeit zu analysieren.

BSAS nutzt Elemente der bestehenden Methoden (Bisulfitumwandlung und regionsspezifische PCR-Amplifikation) und kombiniert sie mit einfachen nächsten Generation Bibliothekskonstruktion (transposome vermittelte) ¹⁷ und Tisch NGS ¹⁸ (Abbildung 1). Dieser Ansatz sorgt für eine quantitative und eine höhere Durchsatzverfahren, um die Cytosin-Methylierung in einer beliebigen Region von Interesse zu untersuchen. Hier präsentieren wir dieVerfahren im Detail und beschreibt Methoden für die Fehlersuche und die Qualität der Überprüfung der BSAS-Prozess.

Protokoll

1. Nukleinsäure-Isolierung aus Gewebe

HINWEIS: Co-Isolierung von DNA und RNA aus derselben Gewebeprobe bietet die Möglichkeit, DNA für die epigenetische Analyse und gepaarten RNA zur Genexpressionsanalyse zu sammeln. Das hier angegebene Beispiel ist eine Form der Säulenreinigung aus experimentellen Gewebe, sondern alternative Ansätze für die unterschiedlichen Probenarten oder andere Isolierungsverfahren können verwendet werden. Die Hauptanforderung ist für hoch gereinigte Nukleinsäure ohne Kontamination Protein oder organischen Lösungsmitteln.

1. Wählen Sie ein Stück frisch gefrorenen oder frischen Gewebe für mechanische Homogenisierung und setzen auf Eis. Shop oder Übertragung Gewebe bis zu einer 2,0-ml-Rundmikrozentrifugenröhrchen.
2. In einem 5 mm Edelstahl Perle in jedes Röhrchen Gewebe enthält. Dazu wird eine geeignete Menge Lysepuffer, basierend auf Hersteller Anregungen Zellenzahl oder der Gewebegewicht.
3. Homogenisieren des Gewebes mit Hilfe einer Perlmühle mechanische Homogenisierung bei30 Hz für 30 sec.
   HINWEIS: Die Frequenz und die Dauer der mechanischen Homogenisierung ist abhängig von der Gewebeart. Weichere Gewebe vollständig zu homogenisieren, mit den empfohlenen Einstellungen, während härtere Gewebe erfordern das Setzen Optimierung.
4. Führen Sie die DNA- und RNA-Isolierung unter Verwendung von Silica Spin-Säulen bei Raumtemperatur nach dem Protokoll des Herstellers.
   1. Elute RNA in 50 ul RNase-freies Wasser und auf Eis. Verwenden Sie für die RNA mRNA Expressionsanalyse von qPCR.
   2. Eluieren der DNA in 100 ul TE Puffer. Wiederholen Sie die Elution aus DNA-Säule mit dem Laufmittel, um DNA-Konzentration und Ausbeute zu erhöhen. Verwenden Sie für die gezielte DNA-Methylierungs-Quantifizierung.
5. Bewertung der Qualität der DNA und RNA unter Verwendung eines Standard-Spektrophotometers bei einer Absorption bei 230 nm, 260 nm, 280 nm und 320 nm.
   HINWEIS: A260 / A280-Verhältnis sollte ~ 1,8-2 für hochwertige DNA sein. A260 / A280-Verhältnis sollte ~ 2 für hochwertige RNA sein. Die Anwesenheit von überschüssigen Extinktion bei 230 nm indicates Verunreinigungen aus dem Isolierungsverfahren.
6. Qualität überprüfen Sie die RNA durch Verwendung einer Kapillarelektrophorese-Chip gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   HINWEIS: Hochwertige RNA wird eine RNA Integrity Number (RIN)> 8. Das Vorhandensein von zusätzlichen Peaks im Elektropherogramm neben rRNA Peaks zeigen Probenkontamination.
7. Quantifizierung von DNA und RNA durch Fluoreszenzassay nach dem Protokoll des Herstellers.
   HINWEIS: Die Verwendung eines fluorometrischen Assay ist empfindlicher und spezifischer für die Quantifizierung von Nukleinsäuren als Spektrophotometrie allein.
8. Speicher isolierte DNA und RNA bei -80 ° C.

2. Zielidentifizierung und Primer Design-

1. Bestimmen Sie die genomischen Region (en) von Interesse von BSAS analysiert werden auf der Grundlage der entsprechenden Referenzgenomsequenz. Gen-Promotoren von differentiell exprimierte Gene sind häufig Ziele der Methylierung Quantifizierung.
2. Bereiten Sie ein in silico Bisulfit-converted Bezugsgenom für spätere Ausrichtung Sequenzierung liest durch Änderung der .fasta Sequenzdatei in einem Texteditor. In der 5'-3'-Orientierung, ersetzen nicht CpG Cytosin mit Thymin (Abbildung 2).
3. Design-Primer setzt, um Bereiche von Interesse von Bisulfit-konvertierter DNA zu verstärken.
   1. Markieren und kopieren Sie den nicht umgesetzten Region von Interesse, in der 5'-3'-Orientierung, in einer Bisulfit-spezifischen PCR-Primer-Design-Programm (Abbildung 3).
      HINWEIS: Eine optimale Bisulfit-PCR-Amplikon Länge 250-400 bp pro Amplicon als Bisulfitbehandlung Fragmente DNA und es ist schwierig, große> 400 bp Regionen zu amplifizieren. Wenn beispielsweise von Interesse ist ein Bereich von 1 kb kann multiple Primerpaare entworfen, um diese Region abzudecken. Design-Amplikons zu gleicher bp Größe für das einfache Zusammenführung sein. Vermeiden Amplikonlängen <250 bp, da diese möglicherweise nicht ausreichender Länge für Bibliothek Generation. Eine optimale Primerlänge für BSAS ist>20 bp pro Primer.
   2. Wählen Sie einen T _m Bereich von 55 bis 65 ° C und einem max T _m Unterschied zwischen Vorwärts- und Rückwärtsprimer von 1-2 ° C.
   3. Wählen Primerpaare, die den interessierenden Bereich am besten zu decken. Primer, die CpG-Stellen enthalten oder direkt an CpG Wählen Sie nicht, da dies zu Verzerrungen bei den PCR-Reaktionen verursachen. Verwenden Sie Standard-PCR-Primer, die aus einer beliebigen Anzahl von wissenschaftlichen oder kommerziellen Anbietern bezogen werden können.
   4. Rekonstituieren Sie lyophilisierte Primer in RNase / DNase freies Wasser in einem Arbeitsvorrat von 100 uM.
4. Speicher PCR Primer bei -20 ° C. Verdünnen Sie 100 uM Primer Lager bis 10 uM Arbeits Lager für PCR-Reaktionen.

3. Bisulfite Spezifische PCR-Optimierung

HINWEIS: Für Bisulfitumwandlung genomische DNA, eine Reihe von verschiedenen kommerziellen Kits für die Bisulfit-Umwandlung zur Verfügung. Wählen Sie den Kit oder Protokoll, das am besten für die geplante Experiment.

1. Verwenden Sie zwischen 200 ng bis 2 ug genomischer DNA. Für Optimierungsversuche, mehrere Konvertierungs Reaktionen, um eine ausreichende Bisulfit-konvertierter DNA haben für mehrere BS-PCR-Reaktionen.
2. Verwenden Sie kleine (zB 10 ul) Elutionsvolumina von Bisulfit-konvertierter DNA hohen DNA-Konzentrationen zu erhalten.
   HINWEIS: 1-2 ul der Bisulfit-konvertierter DNA reicht für Optimierung PCR-Reaktionen, wenn 1 & mgr; g genomische DNA wurde für die Konvertierung Eingang verwendet.
3. Amplify Bisulfit-konvertierter DNA, die durch Bisulfit-spezifische PCR. BS-PCR-Reaktionen erfordern, mit einer Taq-Polymerase zur Amplifikation Bisulfit-konvertierter DNA.
   1. Setzen Sie die folgende Reaktion zur Zielverstärkungs Optimierung eines einzelnen Amplikon. Bei mehreren Proben, montieren Reaktionen in einer 96-Well-PCR-Platte.
      25 ul 2x Reaktionspuffer
      0,5 ul dNTP Mix
      5 ul 10 uM Forward Primer (Final 1 uM)
      5 ul 10 uM Reverse Primer(Final 1 uM)
      2 ul Template Bisulfit-konvertierter DNA
      0,4 & mgr; l (5 U / ul) DNA-Polymerase
      12,1 ul DNase freies Wasser (Final Reaktionsvolumen 50 ul)
   2. Siegel PCR-Platte mit dem entsprechenden Klebstoff oder Heißsiegelfolie.
   3. Zeigen Reaktion in geeigneter Thermocycler und verwenden Sie die folgenden Zyklusbedingungen mit einem beheizten Deckel:
      1. Führen eine anfängliche Denaturierung bei 95 ° C für 10 min.
      2. Denaturierung bei 95 ° C für 30 sec.
      3. Glühen für 30 sec bei der spezifischen T _m von Primern verwendet. Starten bei einer Glühtemperatur einige ° C unterhalb der T _m des Primers Optimierungsreaktionen.
         HINWEIS: Best Glühtemperaturen kann auch mit einem Gradienten-Thermocycler, um einen Bereich von Temperaturen zu testen bestimmt werden.
      4. Führen einer Verlängerung bei 72 ° C für 30 sec. Verlängern Sie die Verlängerungszeit für längere Amplikons.
      5. Wiederholen Sie die Schritte 3.3.3.2-3.3.3.4 35 Zyklen zutal für die erste Optimierung. Höhere Taktzahlen notwendig sein, sollte aber generell vermieden werden, um klonale Amplifikation, die Reaktions Artefakte schaffen zu verhindern.
      6. Durchführen einer abschließenden Extension bei 72 ° C für 7 min.
      7. Halten Reaktionen bei 4 ° C.
   4. Visualisieren Amplikons durch PAGE-Elektrophorese. Als Alternative kann ein Kapillarelektrophorese-DNA-Chips nach dem Protokoll des Herstellers.
      1. Mischungs 24 ul der PCR-Reaktion mit 6 ul 5x Ladepuffer auf Eis und Wirbel.
      2. Auffüllen auf 1 l 1x TBE Laufpuffer durch Mischen von 200 ml von 5 x TBE Laufpuffer und 800 ml ddH ₂ O. Verdünnter DNA-Leiter für eine Endkonzentration von 0,5 ug pro Vertiefung in ddH ₂ O und Ladefarbstoff.
      3. Last Wells mit 30 ul PCR-Reaktionen oder Leiter.
      4. Die Elektrophorese bei 200 V für ~ 45 min. Stoppen Sie das Gel laufen, wenn das erste Farbfront das Ende des Gels erreicht.
      5. Fleck des Gels mit 5 ug / mlEthidiumbromid, indem 5 & mgr; l von 10 mg / ml in 100 ml ddH ₂ O. Decken die gesamte Gel und lassen inkubieren ~ 5 min.
      6. Bild das Gel über eine UV-Licht-Box oder multimodaler Bildwandler bei einer Anregungswellenlänge von 482 nm.
      7. In Bezug auf die Leiter, die Größe und die PCR-Produkte bestimmen Spezifität der Reaktion mit der Suche nach anderen als der erwartete Fragment Größe mehrere Bänder (4A und C).
   5. Wenn optimale Bedingungen für die BS-PCR bestimmt worden sind, führen BS-PCR auf experimentellen Proben.
      1. Reinige Amplikons von Rest Primern und anderen Reaktionskomponenten. Führen Silikasäule Reinigung SPRI Kügelchen oder Gel-Basis clean-up und Quantifizierung.
      2. Elute Amplikons in 30 ul TE-Puffer.
      3. Quantifizieren Amplikons mit fluorimetrischen Test mit Herstellerprotokolle.
      4. Wenn es mehrere Amplikons pro Probe, sie gemeinsam in gleichen Gewicht pro VolumenMengen und bei -20 ° C.

4. NGS Bibliothek Vorbereitung und Bibliothek QC

HINWEIS: BSAS NGS Bibliothek Zubereitung verwendet eine vereinfachte transposome vermittelten Protokoll mit Dual-Indexierung (siehe Materialliste für Details über Bibliothek Vorbereitung Kit-Auswahl). Dieses Verfahren liefert eine extrem schnelle und Hochdurchsatz-Route für die Konstruktion der Bibliothek, die bestätigt hat, und zeigt wenig bis gar keine Vorspannung in Bisulfitsequenzierung Anwendungen ^16,19. Dual-Indizierung ermöglicht eine höhere Multiplex von Proben als Einzelteil. Andere Bibliothek Vorbereitung Stile möglich sein kann, aber nicht getestet wurden.

1. Bereiten NGS-Bibliotheken aus BS PCR-Produkte in einer 96-Well-PCR-Platte. Verdünne Amplikons zu 0,2 ng / & mgr; l für eine letzte Eingangsmasse von 1 ng, oder 5 ul 0,2 ng / & mgr; l Verdünnung. Führen Sie eine Bereinigung der erzeugten Bibliotheken mit SPRI Perlen. Verwenden Sie 50 bis 90 & mgr; SPRI Perlen zur Isolierung von Bibliotheken wit diesem Protokoll. Das Volumen des SPRI Perlen hängt von Zielgröße von Bibliothek und Zyklus Anzahl der gewünschten Sequenzierungsreaktionen.
   HINWEIS: Verwenden Sie ein Schüttler oder Platten Vortexer, um Perlen zu resuspendieren.
   1. Eluieren die Bibliotheken aus den Perlen und Transfer in ein neues 96-Well-Platte und die Dichtung mit der Heißklebefolie für die Lagerung bei -20 ° C.
2. Bestimmen Sie die Größe und Konzentration der Bibliotheken (4B und D).
   1. Führen Bibliotheken auf einem Kapillarelektrophorese DNA Schlichtechip nach Protokollen des Herstellers.
      1. Mit einer hohen Empfindlichkeit Kapillarelektrophorese DNA Assay, um die durchschnittliche Größe der detektierten Bibliothek Spitzen und eine Schätzung der Molarität nach Protokollen des Herstellers zu bestimmen.
   2. Quantifizierung Bibliotheken mittels qPCR unter Verwendung von Primern gegen die Adaptersequenzen in den erzeugten Bibliotheken durch Standards mit einer bekannten Konzentration bestimmt.
      1. Run qPCR WiederAktionen auf einer Echtzeit-Instrument mit den absoluten Quantifizierung Einstellungen nach Herstellerprotokolle.
      2. Verwenden der Größe der Bibliothek und das molare Quantifizierung von qPCR, um die molaren Konzentrationen der Bibliotheken zu berechnen.
3. Verdünne Bibliotheken bis 4 nM mit 10 mM Tris-Cl mit 0,1% Tween-20 bei pH 8,5. Speicher-Bibliotheken in einer 96-Well-PCR-Platte mit Heißklebefolie verschlossen und bei -20 ° C.

5. Sequencing Libraries Mit einem Benchtop Sequencer

1. Auftauen und bereiten Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers.
2. Auftauen 4 nM Bibliotheken auf Eis.
3. Auffüllen auf 1 ml 0,2 N NaOH in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
4. Pool 4 nM Bibliotheken in gleichen Volumenmengen, wenn mehrere Bibliotheken zu verwenden.
5. Verdünnen und denaturieren gebündelt Bibliotheken nach den Anweisungen des Herstellers in die gewünschte endgültige molare Konzentration.
   1. Halten verdünnt und denaturierengebündelt Bibliothek auf Eis, bis Sie sie auf Reagenzkassette laden.
6. Generieren Sie ein Musterblatt enthaltenden Probe Namen und entsprechenden Indexinformationen und geben nur erzeugen .fastq Dateien.
   1. Musterblatt laden in der entsprechenden Musterblatt-Ordner auf dem Sequenzer.
7. In insgesamt 600 ul verdünnt und denaturierte Bibliothek in die Reagenzienkartusche in den entsprechenden Schacht.
8. Führen Sie die Sequenzierungsreaktionen bis zur Fertigstellung.

6. Methylierung Quantifizierung Datenanalyse

HINWEIS: Es gibt mehrere Programme für NGS Datenanalyse einschließlich kommerziellen und Open Source zur Verfügung. Details zur Ausführung von Programmen kann mit jeder spezifischen Verpackung. Allgemeine Anweisungen an jeder Station zusammen mit den spezifischen Befehle für diese Software-Paket angegeben. (Siehe Materialliste für Details über Software im Sinne dieses Protokolls).

1. Import .fastq.gz Dateien in entsprechenden seSequenzierung Analyse Pipeline beibehalten Qualitätswerte (Qscores) für den Einsatz in Lese Trimmen. (In diesem Beispiel Programm auswählen "Import" und wählen Sie die zur Erzeugung liest Sequenzierungsmethode. Wählen Sie .fastq.gz Dateien lesen zu importieren, und zu halten Qscores von .fastq Dateien für Lese Trimmen Anwendungen durch Abwahl "Verwerfen Qualität Partituren" unter "Allgemeine Optionen ". Wählen Sie einen Speicherort für die importierten liest, und wählen Sie" Fertig stellen ".)
   1. Trim und bewahren liest mit den folgenden Einstellungen in einem NGS Datenanalyse Pipeline. (Bei diesem Programm wählen Sie "Trim Sequenzen 'unter' NGS Core Tools", und wählen Sie das liest, um beschnitten werden.)
      1. Behalten Sie nur liest, das ≥ Q30 Partituren. (Bei diesem Programm wählen Sie "Trimmen mit Qualitätswerte" und stellen Sie die Grenze bis 0.001.)
      2. Behalten Sie nur liest, die ≤ 1 mehrdeutig Nukleotid. (Bei diesem Programm wählen Sie "Trim mehrdeutig Nukleotide" und stellen Sie die"Maximale Anzahl von Mehrdeutigkeiten" zu 1. Wählen Sie einen Ort, um getrimmt speichern liest, und wählen Sie "Fertig stellen".)
   2. Karte liest getrimmt auf die In-silico-Bisulfit umgewandelt Gen Referenz von 2,2. (Für das Beispiel-Software wählen Sie "Karte Liest Referenz" unter "NGS Core Tools". Wählen getrimmt liest abgebildet werden, und wählen Sie "Weiter". Wählen Sie die konvertierten Referenzsequenz und wählen Sie "keine Maskierung 'unter' Referenz Maskierung '. Wählen Sie' als nächstes '.)
      1. Weisen Sie eine Höchststrafe für Fehlanpassungen, Insertionen und Deletionen. Eingestellten Parameter, so dass 100% der Leselänge benötigt zur Karte mit 90% Sequenzidentität. Zum Beispiel Software, weisen einen Wert von 3 für Fehlanpassungen, Insertionen und Deletionen. Weisen Sie einen Wert von 1 für die Mindestbruchteil der Leselänge Referenz abgebildet und weisen einen Wert von 0,9 für die Mindestbruchteil der Identität zwischen mapped lesen und Referenz.
      3. Zur Ausrichtung Ausgabe zu erzeugen jede Probe als unabhängige Datei. Zum Beispiel Software, wählen Sie "Create Standalone lesen Zuordnungen" unter "Ausgabeoptionen" und "Speichern" unter "Ergebnis Handling '. Wählen Sie einen Ort, um die Lese- Zuordnung speichern und wählen Sie "Fertig stellen".
   3. Führen Sie eine Variante ruft Workflow auf das zugeordnete liest. Für das Beispiel-Software, wählen Sie "probabilistische Variante Erkennung" unter "Resequenzierung Analysis", wählen Sie die Lese Mapping analysiert werden, und wählen Sie "Weiter". Wählen Sie "Ignorieren unspezifische Spielen" unter "Filter Lesen" und wählen Sie "Weiter".
      1. Sicherzustellen, dass die Sequenz an einer depth von ≥ 1000 X, indem Sie den "Mindestschutz" unter "Stellenwert", um 1000.
      2. Stellen Sie sicher, dass die Variante Anruf bei Vorwärts- und Rückwärts vorhanden ist liest. Zum Beispiel Software, wählen Sie "Require Präsenz in Vorwärts- und Rückwärts Ständen 'unter' Variant Filter" und wählen Sie "Weiter".
      3. Export ausgerichtet, Variante namens Daten als kommentierte Tabelle. Zum Beispiel Software, wählen Sie 'kommentierte Tabelle "unter" Ausgabeoptionen "und wählen Sie einen Speicherort für die Variantentabelle Datei zu speichern. Wählen Sie "Fertig stellen".
2. Berechnen Sie 5-mC Prozentsatz unter Verwendung der Variante Frequenzen kommentierte CpG-Stellen in der Region von Interesse aus der Variantentabelle Datei. Die Frequenz von Cytosin an einer Referenz C in CG ist das 5-mC Prozentsatz.
   HINWEIS: Bei Verwendung Variante ruft Algorithmen für hoch methylierte CpG aus, tauschen CpG Cytosine mit Thymin. Dies wird identify die abgebildeten Cytosin als Varianten, was zu Cytosin Frequenz bei CpG ist.
3. Bestimmen Bisulfit-Umwandlungswirkungsgrad (BSC) durch zuerst Berechnen des Prozentsatzes C ist nicht in CpG-Stellen in der Referenz (C). Multiplizieren Sie den Anteil der nicht CpG C ist durch die Anzahl der zugeordneten (T _mp) Gesamt t, und dividieren durch Gesamt-C ist bei der Bezugs Ts (C _MPT) abgebildet. 100 minus der Frequenz berechnet das Bisulfit-Umwandlungswirkungsgrad (BSC) dieser Bibliothek (Gleichung 1).



Gleichung 1 Bisulfit-Umwandlungswirkungsgrad.
HINWEIS: Während Säugergenomen enthalten sehr geringe Mengen an nicht-CpG-Cytosin-Methylierung (mit Ausnahme möglicherweise von Stammzellen ^20), enthalten Pflanzengenome eine erhebliche Menge. Um Bisulfit-Umwandlungswirkungsgrad in diesen referenc bestimmene Genomen ist ein geeigneter Weg, um einen Teil des mitochondrialen Genoms oder Chloroplastengenom oder bekannten unmethylierte Genen in Pflanzen vorliegenden sequenzieren genome ²¹ und Berechnen Umwandlungseffizienz wie oben beschrieben. Bisulfitumwandlung Effizienz ≥98% in den meisten Fällen, mit der nicht umgesetzte C die potenziell aus der Nicht CpG-Methylierung.

Ergebnisse

BSAS liest richtig umgesetzte Referenzsequenz abgeglichen werden 5 ähneln. CpG eindeutig identifiziert werden können und Methylierungszustände können durch die Beobachtung Basis Anrufe CpG-Stellen in das zugeordnete liest geschätzt werden. Zum Beispiel mit Methylierung steuert, 0% Methylierung wird in alle Lesevorgänge auf CpG-Stellen enthalten, Ts (5A) abgebildet führen. 100% Methylierung Kontrollen ergeben alle Lesevorgänge abgebildet liest CpG enthaltende C ist (5B).

Quantifizierung von Cytosin Frequenz (C / C + T) an CpG ergibt die Methylierung Frequenz in der ursprünglichen Probe. Eine repräsentative Standardkurve von Gesamtgenom Methylierung Kontrollen (n = 3 / Methylierungsverhältnis) erzeugt zeigt Linearität Methylierung Quantifizierung sowie Präzisions in Quantifizierung an jedem Methylierungsverhältnis (Abbildung 6). Als ein Beispiel für dieses Verfahren insgesamt wurden RNA und DNA co-iso rechnet aus Mauskleinhirn und Retina (n = 4 / Gruppe). Rhodopsin Ausdruck, wahlweise in Netzhautgewebe exprimiert wird, wurde mit qPCR gemessen. Expression wurde nur in der Netzhaut (7A) detektiert. Verwendung BSAS wurden CpG Methylierungsstufen in Rhodopsin Promotorregion quantifiziert. Kumulative Methylierungsstufen in der Promotor-Region waren im Cerebellum von> 80% im Vergleich zu <15% in der Netzhaut (p <0.001, t-parametrischen Test) (7B). BSAS Methylierung Quantifizierung profitiert von ortsspezifischen Methylierungs Quantifizierung und Methylierung Niveaus können auf einem CpG spezifisch in einem bestimmten Genomregion verglichen werden. Im Vergleich zu Netzhautproben (p <0.001, t-parametrischer Test bei jeder CpG-Bereichs) (7C) CpG Methylierungsstufen in Rhodopsin Promotor waren signifikant höher in Kleinhirnproben.

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Fig. 1: Schematische Darstellung der BSAS Verfahren Bei diesem Verfahren wird die genomische DNA Bisulfit umgewandelt unmethylation Cytosine zu Uracil zu modifizieren. Damit kann bei der PCR diese Uracile werden Thymin verändert. PCR-Amplifikation gegen Regionen von Interesse gerichtet und sehr bereichert nur für diesen Sequenzen. Die daraus resultierenden PCR-Produkte werden in Dual-Bibliotheken indiziert durch eine einfache tagmentation Verfahren hergestellt. Anschließend werden die Bibliotheken auf einem Benchtop nächste Generation Sequencer sequenziert und die Sequenzlesevorgänge werden auf die in silico umgewandelt Referenzsequenz und Prozent-Methylierung von Cytosin ist in einem basenspezifische Weise bestimmt abgebildet.

Abb. 2: In silico Bisulfitumwandlung der Region von Interesse Jede Region von Interesse von jedem genomischen Referenz kann Selec seinten für die in silico Bisulfitumwandlung. Non-CpG-Cytosinen mit Thymin in der Referenzsequenz ersetzt. CpG Cytosine bleiben Cytosine in der Bisulfit umgewandelt Referenz.

Abb. 3: Primer Platzierung Bisulfit-PCR-Primer gegen eine in silico Bisulfit gestaltet umgeReferenzSequenz. Primer sind so gestaltet werden, dass sie CG-Dinukleotide nicht überlappen oder CG Dinukleotide ausgelegt benachbart.

Abbildung 4: Beispiele für hohe und schlechte Qualität PCR-Produkte und Sequenzierungsbibliotheken Vertreter Elektropherogramm Spuren und Gel zeigen (A) ideal Amplikon für transposome vermittelte Bibliothek Generation mit einem einzigen hoch.Konzentration Produkt. (B) Bibliothek aus dieser Amplikons erzeugt eine hohe Konzentration und sogar Größenverteilung. (C) Schlechte Qualität PCR-Produkte können geringe Größe, Konzentration sein und enthalten mehrere Produkte und / oder Primer-Dimere. Diese schlechte Qualität Amplikons wird (D) führen gescheitert Bibliothek Generation mit geringer Konzentration und geringen Größenverteilung.

Abbildung 5: Beispiele von Sequenzierungs Ausgänge von Methylierung Kontrollen. (A) In silico umgewandelt Referenz Sequenzierung mit CpG-Stellen rot markiert. 0% Methylierung Steuerung abgebildet liest die ausgewählte Region zeigt Thymine (Gier Highlight) Mapping an CpG-Stellen. (B) 100% Methylierung Steuerung abgebildet liest zeigen Cytosin ist (blaue Markierung) Mapping an CpG-Stellen.

Abb. 6: Die Methylierung Quantifizierung in einer Reihe von Methylierung steuert ganze Genom-Methylierung Kontrollen an den Methylierungsverhältnisse (n = 3 / Ratio) von 0% bis 100% gemischt wurden mit BSAS quantifiziert. Trägt man die Quantifizierung der erwarteten quantifizierten Vergleich zeigt die Linearität der Methylierung Steuer Quantifizierung. Über alle Kontrollen gab es hohe Präzision bei der Methylierung Quantifizierung.

Abbildung 7: Beispiel der gekoppelten DNA-Methylierung und Genexpressionsanalyse von Gewebeproben. (A) Rhodopsin relativen mRNA-Expression von Maus-zerebelläre und Netzhautgewebe. (B) Rhodopsin durchschnittliche Promotormethylierung von BSAS quantifiziert zwischen cerebellar und retinale DNA (*** p <0.001, t-parametrischen Test). C) CpG ortsspezifische Methylierung Niveaus in Rhodopsin-Promotor (-244 bis 6, bezogen auf Transkriptionsstartstelle [TSS]) in der Maus Kleinhirn und Netzhaut-DNA.

Diskussion

BSAS ermöglicht konzentriert, präzise Quantifizierung der DNA-Methylierung bei hohen Durchsatzkapazitäten sowohl in Anzahl der Proben und die Anzahl der Ziele. Darüber hinaus bietet diese Bibliothek unter Anwendung transposome vermittelte tagmentation benötigt weniger Input-DNA ist schneller und enthält weniger Schritte als bei herkömmlichen Scheren und nachfolgende Adapter Ligationstechniken. Diese Verbesserungen gegenüber bestehenden Verfahren erlauben eine präzise Basis-Level-DNA-Methylierungsanalyse von jedem Ziel von Interesse. Darüber hinaus bietet BSAS eine neue Methode zur Bestätigung der interessierenden Bereiche (differentiell Methylierung Regionen (DMRs), CpG-Inseln, regulatorische Regionen) mit Hilfe des gesamten Genoms Bisulfit ²² oder ²³ zu erfassen Ansätze, die identifiziert wurden. Mit orthogonalen Bestätigung Ansätze und mehr quantitativ präzise Methoden verbessert die analytische Strenge epigenomischen Studien. Die hohe Lesetiefe mit BSAS erreicht ermöglicht eine präzise Quantifizierung in einem engen Vertrauensintervall, erneutBeratung in präzise Quantifizierung ^16. Darüber hinaus kann die Fähigkeit, viele Proben in einem einzigen Experiment führen Sie den Stichprobenumfang für Bestätigungen gesamten Genoms Methoden, die die statistische Aussagekraft erhöhen zu erhöhen; eine Schwäche vieler aktueller epigenetische Studien. Wichtig ist, bietet BSAS eine basenspezifische CpG Methylierung die Quantifizierung, die für die Erzeugung von testbaren Hypothesen für die epigenetische Forschung ermöglicht. Hypothesen wie erhöhte Methylierung an einer bestimmten Antwortelement führen zu einer verringerten Bindung eines spezifischen Transkriptionsfaktors führen. BSAS, kombiniert mit gekoppelten mRNA-Expressionsdaten, stellt ein Verfahren zur Gewinnung sowohl epigenetischen Regulation und mRNA-Expression in einem einzigen Stück Gewebe oder Zellpopulation. Doppelbestimmungen der Regulation und Expression erhöhen auch die wissenschaftliche Strenge und Auswirkungen der Ergebnisse.

Kritische Schritte in der BSAS-Protokoll umfassen Primer-Design, Amplikon Optimierung und Bibliothek Generation /QC. PCR Vorspannung eingeführt werden, wenn Primer sind nicht richtig ausgelegt und verstärken auf verschiedenen Wirkungsgraden ^8. Die Verwendung von Methylierungsstandards wie enzymatisch erzeugten 100% und 0% Cytosin methylierte Standards kann verwendet werden, um den Grad zu bestimmen, falls vorhanden, der Methylierung Quantifizierung bias, und ist eine geeignete Methodensteuerung bei der Quantifizierung Methylierungs ^16. Ebenso sollte Sorgfalt bei der Optimierung der PCR-Reaktionen zur Erzeugung eines einzelnen hochwertigen Amplikon genommen werden. Wenn kein Amplikon vorhanden ist mit den vorgeschlagenen Leitlinien im Protokoll aufgeführt, sind Optimierungsschritte erhöhen PCR-Zyklus-Nummern oder bsDNA Eingangsmenge. Wenn es mehrere PCR-Produkte, einschließlich Primer-Dimere umfassen Optimierungsschritte abnimmt bsDNA Eingangsgrße, die Verringerung der PCR Primer molaren Eingangskonzentrationen zunehmende Glühtemperaturen oder Verringern PCR Zykluszahl. Eines oder eine Kombination dieser Optimierungsverfahren ergibt zufriedenstellende Ergebnisse, um eine einzige hig erzeugenh-Qualität Amplikon. Alternativ Neugestaltung Primer ist ein guter Ansatz für die Primer-Sets, die eine einzelne Amplicon nicht nachgeben müssen. Für Regionen, in denen Redesign ist nicht geeignet oder möglich ist, degenerieren Primer-Sets einschließlich Cytosin und Thymin ist an CpG-Stellen in Vorwärtsprimer und Adenin und Guanin ist an CpG-Stellen in umgekehrter Primer können zu arbeiten. Allerdings müssen diese Primersätze weitere Optimierung keine PCR Vorspannung auftritt, ein Verfahren außerhalb des Umfangs dieses Protokolls. Qualität Bibliotheken sind für den Erfolg von großer Bedeutung. Stellen Sie sicher, dass QC Maßnahmen durchgeführt, um Größe, Qualität und Quantität der Bibliotheken, bevor Sequenzierung zu bestimmen. Sequenzierungsreaktionen sind anfällig für Fehler bei Eingabe von niedriger Qualität Bibliotheken. Bias in Methylierung Quantifizierung kann, indem sichergestellt wird, dass die Methylierung Frequenzen sowohl in Vorwärts- als vorhanden sind und Reverse-Sequenzierung liest gemildert werden. Darüber hinaus sollte die Qualität Partituren von Basen Angleichung an CpG ≥Q30 für Hoch Zusammenarbeit seinnfidence in Quantifizierung. Während andere bisher wenig bis keine Verzerrungen bei tagmentation Reaktionen von Bisulfit-konvertierter DNA ¹⁹ gezeigt, wodurch die oben beschriebenen Metriken können zur Bestätigung der niedrigen Bias-Methylierung Quantifizierung.

BSAS misst derzeit Methylierung an CpG-Stellen wird jedoch zukünftige Erweiterungen dieses Verfahrens Doppelbestimmungen von CpG 5-HMC unter Zusatz von experimentellen Schritte Unterscheiden zwischen 5-mC und 5-hmC wie die Einführung von Kalium perruthenat vor Bisulfit-Umwandlung ^{von 24} zu ermöglichen. Dies wird die Auswirkungen der BSAS-Dienstprogramm, indem für gepaarte Methylierung um Genexpression regulatorische Rolle von DNA-Methylierung bestimmen zu erhöhen, sowohl 5-mC und 5-hmC und Expressionsdaten. Transposome vermittelte Bibliothek Herstellung von PCR-Amplicons nicht verringerten Sequenzierung Tiefe an den Enden der amplifizierten Bereiche führen. Daher sollten die Regionen von hohem Interesse konstruiert werden, um in der Mitte des Amplikons befinden. Wieimmer, weil BSAS erzeugt Sequenzierung ausgelesen Tiefen> 1000 X, die quantitative Genauigkeit von 5-mC Messungen in der Nähe der Enden der amplifizierten Bereiche hoch bleibt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Agilent 2100 Bioanlyzer	Agilent	G29393AA
Agilent RNA 6000 Nano kit	Agilent	5067-1511
Agilent High Sensitivity DNA kit	Agilent	5067-4626
Typhoon 9200	Amersham/GE Healthcare Life Sciences
Agencourt AMPure XP - PCR-Aufreinigung	Beckman Coulter	A63880 5	ml
PowerPac Basic Netzteil	Bio Rad	164-5050
twin.tech PCR Platte 96	Eppendorf	951020362	mit halbem Rand
	Eppendorf	0030127838
Heißsiegelfolie	Eppendorf	0030127854
Heißsiegelgerät	Eppendorf	5390000.024
0.1-10 μ l Tipps	Eppendorf	0030073.002
2-200 μ l Tipps	Eppendorf	0030073.045
50-1.000 μ l Tipps	Eppendorf	0030073.100
MixMate	Eppendorf	5353000.014
1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen	Eppendorf	0030121.023
Zentrifuge 5424	Eppendorf	5424000.010
2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen	Eppendorf	022363352
Nextera XT DNA Probenvorbereitungskit	Illumina	FC-131-1024	24 rxn
Nextera XT Index Kit	Illumina	FC-131-1001	24 Indizes
MiSeq Desktop Sequencer	Illumina
MiSeq Reagenzienkit v2	Illumina	MS-102-2002	300 Zyklen
KAPA SYBR FAST Universal qPCR Kit	KAPA Biosystems	KK4824
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit	Life Technologies	P7589
Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit	Life Technologies	R11490
ProFlex 96-Well-PCR-System	Life Technologies	4484075
Novex 6 % TBE-DNA-Gel	Life Technologies	EC6261BOX	10-Well-Novex
TBE Running Buffer	Life Technologies	LC6675	5x (1 L)
Novex Hi-Density TBE Probenpuffer	Life Technologies	LC6678	5x (10 ml)
1 Kb Plus DNA Ladder	Life Technologies	10787-018
Xcell SureLock Mini-Cell	Life Technologies	EI0001
UltraPure 10 mg/ml Ethidiumbromid	Life Technologies	15585-011
7900HT Schnelles Real-Time-PCR-System	Life Technologies	4329001	384-Well-Block
DynaMag-96 Side Skirted	Life Technologies	12027
SpectroMax M2 Multi-Mode Microplate Reader	Molecular Devices/VWR	89429-532
AllPrep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen	80204
Edelstahlperlen	Qiagen	69989	5 mm
CLC Genomics Workbench	Qiagen		Software für Methylierungspipeline
QIAQuick PCR-Aufreinigungskit	Qiagen	28104	50 rxn
TissueLyser II	Retsch/Qiagen	85300
Nukleasefreies Wasser	Sigma	W4502
TRIS-Hydrochlorid	Sigma	PHG0002-100G
Tween-20	Sigma	P9416-50ML
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
384-Well-Platte mit vollem Rand, Standard	Thermo Scientific	AB-1384
Absolutes qPCR-Siegel	Thermo Scientific	AB-1170
EZ DNA-Methylierungs-Lightning-Kit	Zymo Research	D5030	50 rxn
ZymoTaq DNA-Polymerase	Zymo Research	E2001	50 rxn