Methodenartikel

In Situ Ca 2+ Imaging des enterischen Nervensystems

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DOI:

10.3791/52506

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29. Januar 2015

 , 
1Department of Physiology, Michigan State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das enterische Nervensystem (ENS) ist ein Netzwerk von Neuronen und Gliazellen in der Darmwand, das die Darmreflexe steuert. Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Aufzeichnung der Aktivität von enterischen Neuronen und Gliazellen in Lebendpräparaten von ENS unter Verwendung von Ca2+-Bildgebung.

Zusammenfassung

Das Reflexverhalten des Darms wird durch das enterische Nervensystem (ENS) gesteuert. Das ENS ist ein integratives Netzwerk von Neuronen und Gliazellen in zwei ganglionären Plexus, die in der Darmwand untergebracht sind. Enterische Neuronen und enterische Gliazellen sind die einzigen Zelltypen innerhalb der enterischen Ganglien. Die Aktivität von enterischen Neuronen und Gliazellen ist für die Koordination der Darmfunktionen verantwortlich. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Beobachtung der Aktivität von Neuronen und Gliazellen innerhalb des intakten ENS durch Abbildung von intrazellulären Calcium (Ca2+)-Transienten mit fluoreszierenden Indikatorfarbstoffen. Im Mittelpunkt unseres Fachgesprächs stehen Methoden zur Ca2+-Bildgebung in Ganzpräparationen des Plexus myentericus aus dem Nagetierdarm. Die Massenbeladung von ENS-Ganz-Mounts mit einem hochaffinen Ca2+-Indikator wie Fluo-4 ermöglicht Messungen der Ca2+-Reaktionen in einzelnen Neuronen oder Gliazellen. Diese Reaktionen können wiederholt und zuverlässig hervorgerufen werden, was quantitative Studien mit pharmakologischen Instrumenten ermöglicht. Die Ca2+-Reaktionen in Zellen des ENS werden mit einem Fluoreszenzmikroskop aufgezeichnet, das mit einer CCD-Kamera (Cooled Charge-Coupled Device) ausgestattet ist. Fluoreszenzmessungen, die mittels Ca2+-Bildgebung in Ganzpräparaten durchgeführt werden, bieten eine einfache Möglichkeit, die Mechanismen und potenziellen funktionellen Konsequenzen von Ca2+-Reaktionen in enterischen Neuronen und Gliazellen zu charakterisieren.

Einleitung

Das enterische Nervensystem (ENS) ist in zwei ganglionated Plexus in der Wand des Verdauungstraktes 1 eingebettet organisiert. Diese intramuskuläre neuronalen Schaltkreise, die Plexus myentericus (MP) und submuköse Plexus (SMP), werden von Neuronen und Glia magensaftresistenten (Abbildung 1) 2 zusammen. Die MP und SMP Regulierung gastrointestinale (GI) Funktionen wie Motilität und epithelialen Absorption und Sekretion bzw. 3. Magensaftresistente Gliazellen sind in unmittelbarer Nähe zu Neuronen im Ganglion aber Populationen von magensaftresistenten Glia befindet Darüber hinaus bestehen innerhalb verbindenden Faserbahnen und außerGangLien Teile der Darmwand 3,4. Magensaftresistente Gliazellen wurden ursprünglich angenommen, dass nur nutritive Unterstützung Neuronen liefern. Doch neuere Studien deuten stark darauf hin, dass Neuron-Glia Interaktionen sind für die ENS-Funktionen 5,6. Zum Beispiel Daten zeigen, dass enterische Glia "hören" neuronale Aktivität 7und Modulieren neuronaler Schaltkreise 6,8, enterischen Neuronen zu schützen vor oxidativem Stress 9 und sind in der Lage zur Erzeugung von neuen enterischen Neuronen in Reaktion auf eine Verletzung 10,11. Die in diesem Beitrag vorgestellten Protokoll bietet eine einfache und robuste Methode, um das komplexe Zusammenspiel von Neuronen und Glia enterische Verwendung von in situ intrazellulären Ca 2+ Bildgebung zu untersuchen.

Ca 2+ ist ein allgegenwärtiges Signalmolekül in erregbaren Zellen und spielt eine wesentliche Rolle bei der synaptischen Signalereignisse im Nervensystem 12. Die Anregung der Neuronen oder Gliazellen ente löst eine Erhebung in cytoplasmatischen Ca 2+ -Konzentration entweder durch Einstrom durch Ca 2+ durchlässige Kanäle oder Ca 2+ -Freisetzung aus intrazellulären Kalziumspeichern. Imaging Ca 2+ Transienten in Neuronen und Glia mit fluoreszierenden Farbstoffen ist eine etablierte und weit verbreitete Technik, um die funktionelle Organisation und Dynamik zu studierendie ENS 13-17. Ca2 + Imaging hat sich gezeigt, ein wichtiges Instrument bei der Untersuchung intakt GI Gewebesegmente, um die Ausbreitung der Erregbarkeit durch ICC Schrittmacher Netzwerke 18 und Darm der glatten Muskulatur 19,20 aufzuklären sein. Es ermöglicht es Forschern, ein breites Spektrum von physiologischen Parametern zu untersuchen und liefert Informationen über sowohl die räumliche Verteilung und zeitliche Dynamik. Die Zellen können effizient in einem minimal-invasiven Weise unter Verwendung membranpermeable Fluoreszenzindikatoren und optimierte Färbeprotokollen 21 gefärbt werden. Dies bietet die Möglichkeit, eine große Anzahl von Neuronen und Glia ente in funktionell erhaltenen Zubereitungen 14-16,22 überwachen, sowie in vivo 23. Whole-mount Gewebezubereitungen Masse mit einer hochaffinen Ca 2+ Indikatorfarbstoff beladen, wie Fluo-4, das seine Fluoreszenz steigt, wenn Ca 2+ gebunden. Veränderungen in der Fluoreszenz werden durch eine CCD-Kamera und ana zeichnetensiert digital 6. Das Aufkommen von Ca 2+ bot die Gelegenheit, Neuronen und Gliazellen Zell-Interaktionen, Reaktionsfähigkeit auf verschiedene Reize zu überwachen und die Beteiligung dieser Zelltypen im Magen-Darm-Prozesse in Echtzeit.

In situ ist Ca2 + Imaging großen Einblick in die Signalmechanismen von enterischen Neuronen und Glia ergab und besitzt mehrere deutliche Vorteile gegenüber Zellkulturmodellen 6,24. Zum einen in situ Vorbereitungen halten die native Matrix-Umgebung von Neuronen und Glia und lassen den Großteil ihrer Verbindungen zu Gewebe intakt Ziel. Zweitens werden die Genetik und die Morphologie der kultivierten ente Glia signifikant verändert im Vergleich zu in vivo 6,24. Drittens werden viele hetero Wechselwirkungen in primären Zellkultur verloren, und diese Grenzen der Beurteilung der Zell-Zell-Interaktionen. Obwohl kultivierten Zellen sind gut für die Untersuchung der fundamentalen Eigenschaften, die usefulne geeignetss für die Untersuchung komplexer Interaktionen zwischen enterischen Gliazellen und Neuronen ist begrenzt. Untersuchung von Neuron-Glia-Wechselwirkung mit einem in situ Ansatz ist physiologisch relevant wie die synaptischen Bahnen intakt 25 bleiben. Im Vergleich zu Zellkulturansätzen, eine in-situ-Ansatz bietet bessere Bedingungen für die systematische Verständnis der komplexen Wechselwirkungen zwischen Neuronen und Gliazellen ente. Darüber hinaus ist die planare Organisation der ganglionated Plexus ganz Montage Präparate ideal für Fluoreszenz-Bildgebung des intrazellulären Ca 2+ Transienten und diese Technik bietet eine einfache Methode zur Bewertung Neuron-Glia-Aktivität im ENS.

Protokoll

HINWEIS: Die folgenden Verfahren mit Gewebe von Labortieren entsprechen den AVMA Richtlinien für die Euthanasie von Tieren 2013 und wurden im Vorfeld von der Michigan State University IACUC zugelassen.

1. Gewebepräparation

  1. Anesthetize Forschungstier in einer Kammer, die 2,5% Isofluran in Sauerstoff oder indem 3-5 ml Flüssigkeit Isofluran auf ein saugfähiges Material, auf dem Boden der Kammer, so dass eine physikalische Barriere verhindert Tiere vor einem direkten Kontakt mit der Isofluran. Test für die Tiefe der Anästhesie durch Einklemmen der Fußballen.
    HINWEIS: Die Narkosetiefe wird als angemessen erachtet, wenn es keinen Rückzug Reflex der hinteren Gliedmaßen. Sobald angemessen betäubt, einschläfern die Maus durch Genickbruch
  2. Legen Sie das Tier in Rückenlage und reinigen Bauchhaut mit 70% Ethanol. Verwenden einer Pinzette, um Bauchhaut eingeklemmt an der Mittellinie und verwenden chirurgische Scheren, ein 6 cm Medien machenl Schnitt entlang der Linea alba, interne Verdauungsorgane aussetzen.
  3. Verwenden stumpfen Pinzette zu finden und setzen den Ileum in das Bauchfell. Schneiden Sie das Ileum / Doppelpunkt Gekröse mit Schere und beginnen Entschlüsselung der Darm.
  4. Sobald die Länge des Darms ausreichend aufgeklärt, schneiden den Darm distal zum Magen und proximal zum Blinddarm eine Ileum Zubereitung. Für eine Dickdarmvorbereitung, schneiden Sie den Doppelpunkt distal der Blinddarm und proximal des Mastdarms.
  5. Schnelles Entfernen des Darmsegment und legen Sie sie in ein Becherglas mit DMEM / F12-Medium mit 3 uM Nicardipinhydrochlorid und 1 uM Scopolamin-Hydrochlorid ergänzt auf Eis (im Folgenden als "Medien" bezeichnet). Die Zugabe dieser Inhibitoren erleichtert Mikrodissektion und die anschließende Bildgebung durch Lähmung der Darm glatten Muskulatur.
  6. Geschnittenen Segmentes von Interesse (zB, Jejunum, Ileum, distalen oder proximalen Kolon) basierend auf den bekannten anatomischen Markierungen. Typischerweise utilize Gewebe vom distalen Ileum oder distale Kolon. Allerdings haben das gleiche Verfahren, um in allen Darmabschnitten zu isolieren, Last und Bild myentericus Neuronen und Gliazellen.
  7. Entfernen Sie ein kleines Segment (4-6 cm) der gewünschten Darmsegment und in ein Sylgard-beschichtete Petrischale mit Kalt Medien gefüllt.
  8. Sichern Sie das proximale und distale Ende des Darmsegment mit Insekten Stifte und öffnen Sie das Darmrohr, indem Sie eine gerade, in Längsrichtung des mesenterialen Grenze geschnitten.
  9. Pin Flachgewebe unter leichter Spannung mit Schleimhautseite nach oben und sorgfältig sezieren entfernt Schleimhautschicht mit feinen Pinzetten (# 5 und # 5/45 funktionieren am besten) und sehr feine Feder Schere.
    HINWEIS: Die Entfernung der Schleimhaut kann für die ENS ziemlich traumatisch sein, wenn nicht richtig gemacht. Zur Qualitätspräparate, achten Sie darauf, abrupten Entfernung der Schleimhaut durch Schälen oder Abschaben begrenzen. Die beste Vorgehensweise ist es, die Schleimhaut zu heben und unter schneiden mit einer feinen Schere.
  10. Schneiden Sie das Gewebe in kleinere Vorbereitungs (etwa 0,5 cm 2) und der Stift in die Abbildungsschalen (4 Ecken mit kreisförmigen Muskelschicht nach oben) auf Eis mit frischen Medien platziert.
  11. Sorgfältig sezieren entfernt Ringmuskel durch Auseinander necken mit feinen Pinzette, um den Plexus myentericus aus. Vermeiden Sie übermäßige Dehnung.
  12. Zeigen Bildschale wieder auf Eis und Veränderung Lösung durch frische Medien.
  13. Planen 2 ml Enzymmischung pro Schale [Dispase 1 U / ml (4,48 mg / 8 ml), Collagenase Typ II 150 U / ml (5,45 mg / 8 ml) in Medium].
  14. Gerichte entfernen aus Eis und fügen Sie die Enzymmischung aus Schritt 1.13.
  15. Geschirr Inkubieren bei RT für 15 min mit 5% CO 2/95% Luft.
  16. Wash Gewebepräparaten mit Medien 3 Mal und wieder Stift Ecken.

2. Laden Fluo-4 Dye

HINWEIS: Vermeiden Sie Photobleichung durch die Zusammenarbeit mit begrenztem Licht beim Umgang mit Fluoreszenzfarbstoffen und Gewebe mit Indikatorfarbstoffe geladen.

  1. Bereiten Sie 4 uM Fluo-4 Beladungslösung.
    1. 1,5 ml Medium und 1,2 ul einer 250 mM Probenecid Lager in ein 1,5-ul-Aliquot von 4 mM Fluo-4 auf Lager. Bis 50 & mgr; g Fluo-4 AM; 4 mM Fluo-4 Lager wird durch Zugabe von 11,4 & mgr; l Pluronic F-127 (0,25% Cremaphor-EL ergänzt 20% DMSO) hergestellt.
  2. Minipreps Inkubieren in Fluo-4 Aufgabelösung für 45 min in einem dunklen Inkubator bei 37 ° C.
  3. Von Inkubator ausziehen und Vorbereitungen mit Medien 3 mal.
  4. Austauschmedium für Medien, enthaltend 200 uM Probenecid und Inkubation 15 min bei 37 ° C vor der Bilderzeugung.
    HINWEIS: Probenecid ist ein Medikament, das Multidrug-Resistenz-Transporter in Nervenzellen hemmt. Die Zugabe dieses Medikament hemmt die Fähigkeit der Neuronen Farbstoffe extrudieren und verbessert neuronalen Kennzeichnung. Massenladens von Ca 2+ Indikatorfarbstoffen in Abwesenheit von Probenecid produziert Gliazellen Belastung. Die Zugabe von Probenecid ermöglicht die Visualisierung der neuronalen und glialen Antworten.
  5. Bereiten Geändert Krebs Puffer.
    1. Machen eine modifizierte Krebs-Puffer, so daß die Endkonzentrationen (in mM) der Komponenten sind wie folgt: 121 NaCl, 5,9 KCl, 2,5 CaCl 2, 1,2 MgCl 2, 1,2 NaH 2 PO 4, 10 HEPES, 21,2 NaHCO 3, 1 Brenztrauben Säure und 8 Glucose (pH-Wert mit NaOH auf 7,4 eingestellt). In 3 uM Nicardipin und 1 uM Scopolamin zu Muskelkontraktionen während Ca 2+ hemmt Bildgebung und ganze-mount Dissektionen.

3. Imaging and Analysis

HINWEIS: Verwenden Sie zumindest ein grundbildgebende Anlage mit einer Leuchtstofflampe, Mikroskop, einer Qualität CCD-Kamera und entsprechende Erfassungssoftware. Variieren die Zugabe von anderen Komponenten in Abhängigkeit von der Lichtquelle und der spezifischen Anwendung. Ein Filterrad und Verschluss muss mit einem herkömmlichen Xenon-Bogenlichtquelle verwendet werden. Allerdings sind LED-Lichtquellen und Beleuchtungssysteme erfordern diese Komponenten.

  1. Positionieren Sie die recording Kammer unter dem Mikroskop und mit einem Schwerkraftfluss Perfusionssystem mit mehreren beheizten Spritze Reservoirs ein ständiger Perfusionsrate von 2-3 ml / min von 37 ° C Krebs-Puffer. Achten Sie darauf, die Luftblasenbildung sowohl in der Eingangs- und Saugleitung an eine Vakuumfalle verbunden zu verhindern.
  2. Bringen Sie die gewünschten Plexus in den Fokus unter Hellfeldbeleuchtung. Vermeiden Sie eine Überbelichtung Gewebe, das auf ein Foto, Bleich führen kann.
  3. Untersuchen Sie die Fluo-4 Belastung innerhalb Ganglien und wählen gesunden Ganglien für die Bildgebung. Ungesunde / beschädigt Ganglien wird Autofluoreszenz oder punktförmige Morphologie aufweisen und sollte nicht für die Bildgebung verwendet werden.
  4. Sobald Ganglion ausgewählt ist, abzulenken Lichtweg zur Kamera und Livebild mit Bildaufnahme-Software zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass die Ganglien ist scharf und stellen Bildaufnahmerate und Belichtungszeiten.
    HINWEIS: Bildaufnahmeraten und Zeiten je nach den Ereignissen Ermittler aufnehmen möchten variieren. Für die meisten Experimente, Bilderwerden traditionell bei 0,5-1 Hz für Gliazellen und bis erworben 2-10 Hz für Neuronen aufgrund glial Ca 2+ Reaktionen sind nicht so schnell wie Ca 2+ Transienten in Neuronen.
  5. Beginnen Sie experimentieren und zu etablieren Grundaktivität für 30 Sekunden.
  6. Anwenden vorgewärmten Drogen von Interesse, wie Agonisten und Antagonisten unter Verwendung der Schwerkraftströmung Perfusionssystem mit einer Geschwindigkeit von 2-3 ml / min. Folgen Anwendung von Agonisten / Antagonisten durch die Rückkehr zu einer normalen Perfusion von Puffer und ermöglichen eine Wäsche / Erholungszeit von mindestens 10 min.
    HINWEIS: Die Drug Application-Zeiten hängen von der einzelnen Verbindung und experimentelles Design variieren. Im Allgemeinen ist ein 20-30 sec Anwendung Agonist ausreichend G-Protein-gekoppelten Rezeptoren in Neuronen und Gliazellen aktivieren. Jedoch ligandengesteuerten Ionenkanäle (wie Nikotinacetylcholinrezeptoren) erfordern Anwendungszeiten von nicht mehr als 5-10 sec. Weitere Dauer Expositionen verursachen Liganden gesteuerte Ionenkanäle, schnell desensitize. Antagonisten sollte für ca. 3-15 Minuten angewendet werden, um eine vollständige Blockade des Rezeptors Wege zu gewährleisten. Dies ist jedoch eine grobe Verallgemeinerung und Ermittler sollten immer optimieren jede experimentelle Droge in ihrem jeweiligen Paradigma.
  7. Stoppen Sie die Aufnahme und Ansicht Zeitraffer-Film des Experiments. Sorgfältig ausgewählte Regions of Interest (ROI) mit dem entsprechenden Bildanalyse-Software.
  8. Verwenden Sie Software, um zu normalisieren und vergleichen ROI Fluoreszenzintensität gegen seine ursprüngliche Ausgangsfluoreszenzwert. Veränderungen normalisierten Fluoreszenz direkt proportional zu den Änderungen der [Ca2 +].
    1. Verwenden einer Modifikation eines Verfahrens unter Verwendung & Delta; F / F = ((F 1 - F 0) / F 0), die vorher beschrieben 26 ROI - ((F 1 - F 0) / F 0) Hintergrund, wobei F1 die Fluoreszenz bei einer gegebenen Punkt und F0 ist die Grundlinie Fluoreszenz, um die Beurteilung Genauigkeit zu verbessern. Diese Modifikation Hilfsmittelbei der Verringerung der Lärm von Fluoreszenzänderungen in Gewebepräparaten, die Bewegung zu zeigen von der Muskelschicht der Plexus myentericus zugrunde liegen.

Ergebnisse

Die richtige Anwendung dieser Technik können Forscher die genaue Messung der intrazellulären Ca 2+ [Ca2 +] i-Transienten in enterischen Neuronen und Glia ganz-mount Gewebezubereitungen. Ein repräsentatives Beispiel für einen Agonisten hervorgerufene Ca 2+ Antworten in Gliazellen in einem myentericus Ganglion von der Maus Doppelpunkt bei Video 1 gezeigt. Die folgenden Ergebnisse sind dazu gedacht, einige repräsentative Ergebnisse, die wir unter Verwendung dieses Verfahrens zu illustrieren. Erstens, Figur 2 zeigt die Ergebnisse eines Experiments Messente glial [Ca 2+] i im Ansprechen auf eine Stimulation durch ATP in Meerschweinchen colonic Längsmuskel-Plexus myentericus (LMMP) Zubereitungen. Insbesondere zeigt diese Figur die Methode für die korrekte Analyse der Versuchsprotokoll vor, einschließlich der Umriss des analysierten myentericus Ganglien und Sternchen bezeichnet die Lage des enterischen Neuronen aufgeführt. Diese Ergebnisse zeigen auch illustrate die optimale Dosis von hundert mikromolaren ATP über die Inanspruchnahme des [Ca 2+] i in Meerschweinchen myentericus Gliazellen. Diese Antwort kann verwendet werden, um enterische Glia-Stimulation zu kalibrieren und zu normalisieren Reaktionen auf Reize zu testen. Nächstes Bild 3 verdeutlicht, wie man richtig wählen Regions of Interest (ROIs) umgeben Gliazellen, mit umgebenden gelben Kreisen gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen auch die gewünschten Fluoreszenzänderungen unter basalen Bedingungen und in Reaktion auf pharmakologische Stimuli. Schließlich Abbildung 4 zeigt die räumliche Überlegungen für die Wahl enterischen Gliazellen und Neuronen für [Ca 2+] i Antworten ganz-Mount-Präparaten.

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Abbildung 1. Organisation der ENS. Die ENS enthält zwei Haupt ganglionated Plexus. Der Plexus myentericus zwischen dem l liegtongitudinal und Kreismuskelschichten. Die submuköse Plexus zwischen der Schleimhaut und der Ringmuskelschicht entfernt. Die ENS ist ausschließlich von Neuronen und Glia ente zusammen. Nervenfaserbahnen verbinden den Ganglien. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

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Abbildung 2. Enteric Glia im Meerschweinchen Kolon Plexus myentericus reagieren auf in situ ATP. (A) Fluo-4 Fluoreszenz in einem myentericus Ganglien unter basalen Bedingungen (durch eine gestrichelte Linie umrandet). Pfeile zeigen auf dicken interganglionic Faserbahnen. (B) Nach der Stimulation mit 100 mmol / L ATP, Gliazellen, aber nicht Nervenzellen, schnell zu erhöhen Fluo-4 Fluoreszenz, die eine Zunahme der [Ca 2+] i. Beachten Sie, dass reagierenden Zellen klein sind und umgeben die viel größer Neuronen (durch Sternchen markiert dunklen Räumen). (C) Magensaft Glia ATP reagieren in einer Dosis-abhängige Weise mit 1 mmol / L entlocken Maximalreaktionen 24. Bitte klicken Sie hier, um einen Blick Größere Version der Abbildung.

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Abbildung 3. Murine S-100-GFP + Zellen in der Darm Plexus myentericus reagieren auf in situ ATP. (A) S-100-GFP + Gliazellen (grün) in einem Maus Kolon myentericus Ganglien (durch eine gestrichelte Linie umrandet). Sechs Regionen von Interesse (ROIs) umgeben Gliazellen in den Ganglien werden als gelbe Kreise dargestellt. Die Pfeile zeigen die dicken Faserbahnen, die in die Ganglien. Sternchen denote Speicherort 2 enterischen Neuronen. (B) Das gleiche Ganglion zeigt Rhod-2 Fluoreszenz unter basalen Bedingungen. (C) nach Stimulation mit 100 & mgr; mol / l ATP, Gliazellen reagieren mit erhöhter [Ca 2+] i, wie durch erhöhte Rhod- gezeigten 2 Fluoreszenz. (D) Traces auf jede in A-C gezeigt ROI entspricht. (E) Mittelwert der Reaktion (Mittelwert ± SEM) der 6 in D 24 gezeigt ROIs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

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Abbildung 4. Die In-situ-Bildgebung von magensaft Neuron-to-Glia-Kommunikation. (A) Repräsentative Bilder (pseudocolored) von einem Ca 2+ Imaging Experiment, bei dem eine ganze-mountHerstellung des Plexus myentericus wurden mit der neuronalen P2X7-Rezeptor-Agonist BzATP (100 & mgr; M, 30 sec) in Frage gestellt. Man beachte, dass die neuronale Agonisten verursacht eine Erhöhung Fluo4 Fluoreszenz in dem Neuron (A ') vor der umgebenden ente glial Zellen (A "). (B) Analyse der Änderung in der Fluoreszenz mit der Zeit in der Glia (blau) und Neuronen (rote ) bei der Anwendung der neuronalen Agonist BzATP. (C), neuronale und gliale antwortet BzATP in normaler Puffer (durchgezogene Linien) und in einem Puffer mit niedrigem Ca 2+ und Mg 2+ (gestrichelte Linien), die neuronale P2X7-Rezeptoren 13 potenzieren. Bitte Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Video 1 Agonist hervorgerufene Ca 2+ Reaktion in magensaftresistenten Glia insitu. Dieses Video zeigt eine myentericus Ganglien von der Maus distalen Kolon mit dem Ca 2+ Indikatorfarbstoff Fluo-4 beladen. Die Gliazellen Agonisten, ADP, wird dem Bad zugesetzt, wenn angegeben. ADP ruft eine Erhöhung der intrazellulären Ca 2+ in enterischen Glia durch den vorübergehenden Anstieg in Fluo-4 Fluoreszenz beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen.

Diskussion

Die in diesem Manuskript beschriebenen Methoden bieten einen konsistenten Ansatz zur effektiven Untersuchung von Neuronen und enterischen Gliazellen in der ENS. Obwohl die Bildgebung von Neuronen und enterischen Gliazellen in Kultur eine Fülle von Einblicken in die Funktion einzelner Zellen geliefert hat, ist die Untersuchung dieser Zellen in ihrer nativen, mehrzelligen Umgebung entscheidend für unser Verständnis ihrer Physiologie und Pathophysiologie. Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine entscheidende Technik zur Beurteilung multidirektionaler Wechselwirkungen von Zellen im ENS. Loading-Zellen des ENS mit selektiven Fluoreszenzmarkern und Bildaufnahme mit hochauflösender Mikroskopie ermöglichen quantitative Beobachtungen der zellulären Aktivität im ENS. Die Bildgebung von lebenden Gewebeproben des ENS erfolgt relativ schnell und erzeugt große Mengen an detaillierten funktionellen und räumlichen Daten. Präparate des myenterischen und submukösen Plexus der Maus, die in diesen Experimenten verwendet werden, ermöglichen molekulare und genetische Manipulationsansätze. Die Ca2+ -Bildgebung in Ganzpräparationen bietet ein nützliches Werkzeug für die Beurteilung von Neuron-Glia-Interaktionen.

In fortschrittlichen experimentellen Paradigmen können mehrere Sonden kombiniert werden, um Informationen über verschiedene Ereignisse innerhalb der Zellen zu erhalten. Mit der Fluoreszenzmikroskopie können Bilder mit erhöhtem Kontrast bestimmter Moleküle aufgezeichnet werden, wenn eine geeignete Fluoreszenzmarkierung verwendet wird. Fluo-4 wurde gewählt, weil es einen großen Dynamikbereich besitzt. Eine ausreichende Inkubationszeit ist bei der Verwendung der AM-Farbstoffe in ENS von entscheidender Bedeutung. Die Farbstoffkonzentration und die Beladungsmethode müssen möglicherweise angepasst werden, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Ideale Präparate sollten mit ausreichend Farbstoff beladen sein, um Änderungen der Fluoreszenz sichtbar zu machen, aber nicht so sehr, dass der Farbstoff die Zielionen chelatisiert und die intrazelluläre Signalübertragung stört. Die Exposition gegenüber Fluoreszenzlicht sollte begrenzt werden, um Phototoxizität in Zellen und Photobleiche von Farbstoffen zu verhindern.

Die Untersucher müssen bei mehreren Schritten dieses Experiments vorsichtig sein, insbesondere bei der Lösungs- und Gewebevorbereitung. Bei der Verarbeitung und Dissektion von ENS-Gewebe ist besondere Vorsicht geboten, um die zellulären Funktionen zu erhalten. Der Magen-Darm-Trakt enthält mehrere Schichten und Gewebevarianten, die eine Herausforderung für die Dissektions- und Bildgebungsqualität dieser Ganzpräparate darstellen 27. Darüber hinaus sind die miteinander verbundenen Faserbahnen des MP breiter und die Ganglien größer als die des SMP 2. Die neuronale Dichte des Plexus myentericus ist höher als die des Plexus submukösus 28. Langsame und ungenaue Dissektionen wirken sich nachteilig auf die Qualität der Plexuspräparate und damit auf den Gesamterfolg der Experimente aus. Daher sind saubere/unbeschädigte Werkzeuge, Übung und handwerkliches Geschick entscheidend für dieses Verfahren.

Bei Whole-Mount-Gewebepräparaten sollte bei der Erstellung der Regionen von Interesse (ROI) sorgfältig überlegt werden, um die Kinetik und den Grad der beobachteten Änderung der Fluoreszenzintensität des gewünschten Zelltyps korrekt zu beurteilen. Da sich die Ganglien auf einer kontraktilen Muskelschicht befinden, sind Bewegungsartefakte, die durch die Darmmotilität verursacht werden, ein Hauptproblem bei der In-situ-Bildgebung . Die Unterdrückung dieser Bewegungsstörungen durch erneutes Fixieren von Gewebepräparaten nach der Inkubation mit Enzymen und die Zugabe von pharmakologischer Hemmung (Nicardipin/Scopolamin) zu den Puffern ermöglicht somit eine klare und zuverlässige Bildaufnahme. Neben der Pharmakologie und mechanischen Ansätzen zur Verhinderung von Gewebebewegungen veranschaulichen neuere Studien die Anwendung fortschrittlicher Softwaremethoden und Zelltyp-Reaktionsmerkmale, um die verbleibende Gewebebewegung in den Aufzeichnungen zu korrigieren und die Genauigkeit der Analyse zu verbessern 29. Abgesehen von diesen technischen Hürden bietet diese Methode physiologisch relevante Bedingungen, um morphologische und quantitative Eigenschaften von Neuronen und enterischen Gliazellen in der ENS zu beurteilen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Pharmaceutical Research and Manufacturers Association of America (PhRMA) Foundation (an B. Gulbransen), des Stipendiums K12 HD065879 der National Institutes of Health (Building Interdisciplinary Research Careers in Women's Health) (B. Gulbransen) und Startkapital der Michigan State University (B. Gulbransen) unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BubbleStop Spritzenheizung AutoMate Scientific10-4-35-G
CaCl2SigmaC3306
Kollagenase, Typ II, PulverGibco17101-015
DispaseSigma-Aldrich42613-33-2
PräparierwerkzeugeRoboz 
DMSOSigma-AldrichD5879
FesttischmikroskopOlympus BX51WI
Fluo-4 AM FarbstoffInvitrogenF-14201
GlucoseSigmaG8270
InsektenstifteFine Science ToolsMinutien Pins
iQ Live Cell Imaging SoftwareAndorAndor iQ3
KClSigmaP3911
MgCl2SigmaM9272
NaClSigmaS9888
NaH2PO4SigmaS8282
NaHCO3SigmaS6014
Neo sCMOS-KameraAndorNeo 5.5 sCMOS
NicardipineSigmaN7510
PerfusionskammerKundenspezifische
SchlauchpumpeHarvard ApparatModell 720
Pluronic F-127 InvitrogenP3000MP
ProbenecidMolekulare SondenP36400
ScopolaminSigmaS1013 
Sutter Lambda DG-4SutterDG-4
Sylgard Dow Corning184
TemperaturreglerWarner InstrumentsTC-344C

Referenzen

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