Imaging Lokale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signale in kultivierten Säugetierzellen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Techniken zur Abbildung lokaler IP_{3-vermittelter} Ca2⁺-Ereignisse mittels Fluoreszenzmikroskopie in intakten Säugetierzellen, die mit Ca2⁺-Indikatoren beladen sind, zusammen mit einem Algorithmus, der die Identifizierung und Analyse dieser Ereignisse automatisiert.

Zusammenfassung

Zytosolischen Ca ²⁺ -Ionen regulieren zahlreiche Aspekte der Zellaktivität in fast allen Zelltypen, Kontrollprozesse, wie vielfältig wie Gen-Transkription, elektrischen Erregbarkeit und Zellproliferation. Die Vielfalt und Besonderheit der Ca ²⁺ Signal leitet sich von Mechanismen, durch die Ca ²⁺ Signale erzeugt werden, um über verschiedene Zeit- und Raumskalen wirken, von der Zelle weiten Schwingungen und Wellen über die Perioden von Minuten, um lokale transiente Ca ²⁺ Mikrodomänen auftreten (Ca ²⁺ Hauche) anhalt Millisekunden. Jüngste Fortschritte in der Elektronen multipliziert CCD (EMCCD) Kameras jetzt Bildgebung von lokalen Ca ²⁺ Signale mit einem 128 x 128 Pixel Ortsauflösung ermöglichen mit Raten von> 500 Bilder sec ^-1 (fps). Dieser Ansatz ist sehr parallel und ermöglicht die gleichzeitige Überwachung von Hunderten von Kanälen oder Blätterteig Stellen in einem einzigen Experiment. Doch die große Datenmengen generiert (ca. 1 GB per min) machen visuelle Identifizierung und Analyse der lokalen Ca ²⁺ Ereignisse nicht praktikabel. Hier beschreiben und zeigen die Verfahren für die Erfassung, Erkennung und Analyse der lokalen IP ₃ vermittelte Ca ²⁺ Signale in intakten Säugerzellen mit Ca ²⁺ Indikatoren sowohl mit Weitfeld-Auflicht-Fluoreszenz (WF) und Totalreflexion geladen Fluoreszenz (TIRF) Mikroskopie. Darüber hinaus beschreiben wir einen Algorithmus in der Open-Source-Software-Umgebung Python, die die Identifizierung und Analyse dieser lokalen Ca ²⁺ Signale automatisiert entwickelt. Der Algorithmus lokalisiert Websites von Ca ²⁺ Freisetzung mit Subpixel-Auflösung; ermöglicht dem Benutzer Überprüfung der Daten; und gibt Zeitsequenzen der Fluoreszenzverhältnissignale mit Amplituden und kinetische Daten in einer Excel-Tabelle kompatibel.

Einleitung

Calciumionen (Ca ²⁺⁾ ubiquitär regulieren ein breites Spektrum von biologischen Prozessen, einschließlich Genexpression, Sekretion und dauerhafte Veränderungen in der synaptischen Plastizität ^1. Ein Weg, durch welche Ca ²⁺ in einer vielfältigen Art und Weise wirken, ist durch die unterschiedliche räumliche und zeitliche Muster von Ca ²⁺ signalisiert eine Zelle erzeugen kann. Zum Beispiel globale Erhebungen in zytosolischen [Ca ^2+] Trigger Kontraktion in glatten Muskulatur ² während kleinere, lokale vorübergehende Erhöhung (lokalen Ca ²⁺ Mikrodomänen) zu stimulieren Genexpression essentiell für Lernen und Gedächtnis ^3.

Freien cytosolischen [Ca ^2+] liegt bei ~ 100 nM in Ruhe gehalten wird, kann jedoch schnell zu mehreren Mikro molaren nach der Einstrom von Ca ²⁺ in das Cytosol steigen durch Ca ²⁺ durchlässige Ionen-Kanäle in der Plasmamembran und befindet die Freisetzung von Ca2 ⁺ aus intrazellulären stores. Unser Labor konzentriert sich auf den Inositol-1,4,5-triphosphat-Rezeptor (IP ₃ R), das eine Ca ^{2+ -Freisetzung} Kanal im endoplasmatischen Retikulum (ER) membran bildet. Bei der Bindung von sowohl IP ₃ und Ca ²⁺ auf die cytosolische Aktivierung Stellen des Rezeptors, öffnet das IP ₃ R-Kanal zu befreien Ca ²⁺ in das ER-Lumen sequestriert. Die Freisetzung von Ca ²⁺ räumlich auf eine kleine Gruppe von IP ₃ Rs begrenzt bleiben, um eine lokale Mikrodomäne cytosolischen Ca ²⁺ zu erzeugen (Ca ²⁺ puff ⁴⁾ oder, abhängig von der Nähe der benachbarten Clustern von IP ₃ R, kann verbreiten sich eine Zelle durch die Rekrutierung von mehreren puff Websites durch einen Prozess der Ca ²⁺ -induzierte Ca ²⁺ -Freisetzung (CICR) ^5,6.

Die Einführung von Kleinmolekül-Fluoreszenz-Ca ²⁺ Indikatorfarbstoffe von Roger Tsien entwickelte ^7, verbunden mit modernster Mikroskopie imaging Techniken hat erheblich erleichtert unser Verständnis von Ca ²⁺ Signalisierung. Jüngste Fortschritte in der Kameras für die Mikroskopie verwendet nun zur Abbildung vorübergehenden lokalen Ca ²⁺ Ereignisse wie Windbeutel mit beispielloser räumlicher und zeitlicher Auflösung zu ermöglichen. Derzeit verfügbare EMCCD-Kameras ermöglichen Bildgebung mit 128 x 128 Pixeln bei> 500 Bilder sec ^-1 (fps) und die neue Generation der komplementären Metall-Oxid-Halbleiter (CMOS) Kameras bieten eine höhere Pixel-Auflösung und sogar höhere Geschwindigkeit auf Kosten etwas höher Geräuschpegel. In Verbindung mit der Totalreflexion (TIRF) Mikroskopie ist es nun möglich, einzelne Bild Ca ²⁺ Kanalereignisse ^8,9. Dieser Ansatz ermöglicht die Abbildung von Hunderten von Kanälen / Ereignisse gleichzeitig, während die Erzeugung von großen Datenmengen (ca. 1 GB pro Minute), die manuelle Bearbeitung, visuelle Identifizierung und Analyse machen unpraktikabel und setzen Sie eine Last auf die Entwicklung von automatisierten Algorithmen.

hier, Verfahren und Protokolle zur Abbildung lokalen Ca ²⁺ Signale in intakten Säugerzellen unter Verwendung von fluoreszierenden Ca ²⁺ Indikatoren präsentieren wir. Wir zeigen ferner einen Algorithmus in der Open-Source-Umfeld Python, die Identifikation und Analyse von lokalen Ca ²⁺ Ereignisse sowohl von TIRF und konventionellen Weitfeld-Auflicht-Fluoreszenz (WF) Mikroskopie abgebildet automatisiert entwickelt. Obwohl wir beschreiben diese Ansätze im Zusammenhang mit der IP ₃ -generated Ca ²⁺ Signalen leicht zu einer lokalen Veränderung in cytosolische [Ca ^2+] aus einer Vielzahl von Ca ²⁺ ausgeh -durchlässigen Ionenkanäle entweder in der Oberfläche angeordnet zu untersuchen sind Membran oder intrazellulären Organellen ^8-10.

Protokoll

Wir stellen detaillierte Verfahren zur Abbildung lokalen Ca ²⁺ Ereignisse in menschlichen Neuroblastom-SH-SY5Y-Zellen. Diese Verfahren können zur Bild intrazellulärem Ca ²⁺ Signale in vielen Zelltypen ^8-10 anpassen.

1. Herstellung der Zellen

1. Kultur die Zellen gemäß den Anweisungen auf der Website ihren Lieferanten aufgeführt abgebildet werden.
2. Einige Tage vor der Bilderzeugung, Ernten der Zellen in einem Gewebekulturkolben unter Verwendung von 1 ml 0,25% Trypsin / EDTA (2-3 min) gezüchtet. Nach Ablösung, dasselbe Volumen der Kulturmedien, um das Trypsin zu inaktivieren.
3. Führen Sie eine Zellzahl mit einer Zählkammer und Samenzellen in Glasboden Bildgebung Schalen in einer Dichte von 3-7 × 10 ⁴ Zellen pro Schale. Wählen Sie die Zellen, die für Imaging-Experimente, wenn sie erreichen 60% Konfluenz (2-3 Tage).

2. Herstellung von Lösungen und Reagenzien

1. Bereiten Sie eine Ca ²⁺ -haltige HEPES gepuffertSalzlösung (Ca ²⁺ -HBSS) von (mM) aus: 135 NaCl, 5,4 KCl, 2 CaCl _2, 1 MgCl _2, 10 HEPES und 10 Glucose; pH = 7,4 bei Raumtemperatur (RT) mit NaOH. Bereiten Ca ²⁺ -HBSS ohne die Zugabe von Glucose und bei 4 ° C; Zugeben von Glukose zu der Lösung unmittelbar vor der Verwendung.
2. Löslich membrangängige Form des fluoreszierenden Ca ²⁺ Indikator Cal-520 (1 mM), CI-IP ₃ (200 uM) und EGTA (100 mM) in Dimethylsulfoxid (DMSO), die 20% Pluronic F-127. Aliquot dieser Reagenzien in Eppendorf-Röhrchen und lagern, vor Feuchtigkeit und Licht geschützt, bei -20 ° C.

3. Loading-Zellen mit membrangängige Cal-520, ci-IP ₃ und EGTA

1. Bereiten Sie die "Ladepuffer" durch Verdünnen Stammlösungen von membrangängige Cal-520 und ci-IP ₃ bis zu einer Endkonzentration von 5 uM und 1 & mgr; M, in Ca ²⁺ -HBSS.
2. Saugen Sie culture Medien und spülen Zellen durch Ersatz von Medien mit Ca ²⁺ -HBSS dreimal.
3. Entfernen Ca ²⁺ -HBSS inkubieren Zellen in Ladepuffer für 60 min bei RT im Dunkeln.
4. Entfernen Ladepuffer und spülen Zellen durch Ersatz von Medien mit Ca ²⁺ -HBSS dreimal.
   1. Falls gewünscht, kann in diesem Schritt, Wägezellen mit EGTA / AM durch Verdünnen der Stammlösung auf eine Endkonzentration von 5 & mgr; M Ca ²⁺ -HBSS und dann inkubieren Zellen 30-60 min bei RT im Dunkeln. Im Anschluss an diese Inkubation spülen Zellen dreimal mit Ca ²⁺ -HBSS bevor Sie mit Schritt 3.5.
5. Zellen in Ca ²⁺ -HBSS Inkubation 30 min zur Entesterung von belasteten Reagenzien ermöglichen.
6. Unmittelbar vor der Abbildungs ​​Ersetzen Ca ²⁺ -HBSS mit "frischen" Ca ²⁺ -HBSS um jeden Farbstoff, der in der letzten Inkubation in das Bad ausgetreten sind, beseitigt werden.

4. Ca ²⁺ Image Acquisition

1. Setzen Sie einen kleinen Tropfen Immersionsöl auf die 100X APO TIRF Ziel (NA 1,49).
2. Montieren Sie die Bildform auf der Bühne des inversen Mikroskop und bringen die Zellen in den Fokus im Durchlicht. Es ist wichtig, um die Abbildungsschale, um eine Bewegung während der Aufnahme zu verhindern sichern.
3. Beleuchten Zellen mit einem 488 nm Laser, um Cal-520 erregt und sammeln emittierte Fluoreszenz (λ> 510 nm) unter Verwendung eines Hochgeschwindigkeits EMCCD- Kamera.
   HINWEIS: Die Software, die das Mikroskop arbeitet erlaubt dem Benutzer, eine Fokussierlinse ermöglicht den Laserstrahl eingebracht werden, entweder an der äußersten Kante der Objektivrücköffnung (für TIRF Anregung) oder mehr in der Mitte (bei "WF" Anregung) zu übersetzen.
4. Mit der EMCCD-Software, reduzieren Sie die Bildfeld aus den vollen 512 x 512 Pixel, um Daten in der erforderlichen zeitlichen Auflösung zu sammeln, um lokalen Ca ²⁺ Ereignisse zu erfassen.
   HINWEIS: Zum Beispiel Zentrum QuadErwerb von 256 x 256 Pixel beschleunigt die Erfassungsrate bis 66 fps. Es ist auch möglich, die Bildrate des EMCCD Kamera zu 500 Bildern pro Sekunde weiter zu erhöhen mit einem Isolated Crop-Modus-Funktion.
5. Konfigurieren Sie die Software, um automatisch ein paar Sekunden der Grundaktivität, liefern einen UV-Blitz, um die Zellen und fährt mit der Aufnahme für ein weiteres 10 bis 30 sec.
   HINWEIS: Ein UV-Blitz wird mit einer durch eine UV-reflektierenden dichroitischen Spiegel in den rückseitigen Anschluss des Mikroskops eingeführt Xenon-Bogenlichtquelle geliefert. Die Dauer und Intensität der UV-Blitz wird empirisch eingestellt, um eine gewünschte Frequenz des lokalen Ca ²⁺ Ereignisse hervorrufen.
6. Speichern von Dateien als Bildstapel für die Offline-Analyse.

5. Automatische Ca ²⁺ Bildanalyse

HINWEIS: Es ist möglich, zu sehen, zu verarbeiten und zu analysieren, die erfassten Daten mit vielen kommerziellen Softwarepaketen. Jedoch haben wir einen Algorithmus, um schnell zu automatisieren Identifikations eine entwickelted Analyse der lokalen Ca2 ⁺ Signale. Eine detaillierte Beschreibung der räumlichen und zeitlichen Filter in diesem Algorithmus verwendet wird, kann die Erzeugung von & Dgr; F / F ₀ und Identifizierung / Auswerteroutinen in ¹¹ gefunden werden. Dieser Algorithmus wurde entwickelt, um auf dem Open-Source-Software-Plattform Python ausführen und erhalten werden, zusammen mit Beispiel experimentellen Daten und ausführliche Gebrauchsanweisung, per E-Mail an den entsprechenden Autor (ismith@uci.edu).

1. Konvertieren von Dateien in das speziell geschriebenen Algorithmus, um die Mehrebenen-TIFF-Datei-Format importiert werden.
2. Suchen Sie den Ordner mit der Analyse-Algorithmus und doppelklicken Sie auf die run.exe.
3. Wählen Sie das TIFF-Datei analysiert werden.
4. Wählen Sie Analyseparameter im offenen Dialog. Siehe 2A für Standardwerte für die Probendaten.
5. Bestimmen Sie den Schwarzwert aus dem Bildstapel entweder durch Bewegen des Cursors auf einen Teil des Sichtfeldes, die n tut ausgeglichen werdenot enthalten eine Zelle (siehe Abbildung 2B) oder durch manuelle Eingabe eines Schwarzwert mit dem "Schwarzpegel einstellen" prompt.
6. Beobachten vier Fenster auf dem Bildschirm folgende Analyse durch die Software (2C-F). C ist ein monochromes Bild still Fluoreszenz von Zellen analysiert. Weiße Quadrate auf diesem Bild überlagert sind Veranstaltungsorte, wie die Schwerpunktpositionen der zweidimensionalen Gauß-Funktionen ausgestattet, um Ereignisse bestimmt.
7. Klicken Sie auf jedes Veranstaltungsortes, oder drücken Sie die Cursor-Tasten, um zwischen den Veranstaltungen. Daraufhin wird der Hintergrund subtrahiert, Gaussian geglättet Fluoreszenzverhältnis ändert (AF / F ₀₎ auf jeder dieser Sites Update im Fenster D.
   HINWEIS: Rot markierte Ereignisse von "Durchschlagen" von Aktivität zu benachbarten Stellen lokalisiert entschlossen, von diesem bestimmten Ort stammt und nicht. Die untere blaue Linie zeigt an, wo das Fluoreszenzsignal an der ausgewählten Stelle über dem ErkennungsSchwelle, während die schwarze Linie kennzeichnet Events von diesem bestimmten Ort Ursprung (entspricht dem rot hervorgehoben Ereignisse).
8. Klicken Sie auf einen rot unterlegt Veranstaltung Fenster E, die die zeitliche Entwicklung der Veranstaltung zeigt, und Fenster F, zeigt das räumliche Profil der Veranstaltung, gemittelt über seine Zeit, natürlich zusammen mit der Raumprofil der angepassten Gaußfunktion aktualisieren.
9. Manuelles Überprüfen Sie die Ereignisse, die identifiziert wurden, so dass Artefakte von der Analyse abgelehnt. Löschen Sie solche Ereignisse durch Rechtsklick auf das rot markierte Veranstaltungen.
   HINWEIS: In unseren Händen, Ca ²⁺ Fluss durch einzelne IP ₃ R-Kanäle erinnert Signale mit AF / F ₀ etwa 0,11, so dass alle erkannt "Ereignisse" wesentlich kleiner als diese wahrscheinlich mit Fehlmeldungen rechnen.
10. Exportieren von Daten, indem Sie durch Ziehen um die Zelle von Interesse und Auswählen von »Save CellR" Save to Excel 'oder Exportieren von Daten auf eine Basis pro Zelle17 ;.
    HINWEIS: Die Daten werden in den gleichen Ordner wie das Originalbild Stack gespeichert.

Ergebnisse

1A zeigt eine WF Bild ruhender Cal-520-Fluoreszenz in menschlichen Neuroblastom-SH-SY5Y-Zellen ebenfalls mit ci-IP ₃ geladen. Exposition dieser Zellen in einen 100 msec UV-Blitz, um foto Freisetzung i-IP ₃ ausgelöste Ca ²⁺ Transienten Quasten an diskreten Stellen (durch die weißen Kreise in 1A angegeben). Fluoreszenz Spuren gemessen an diesen Stellen zeigten eine schnelle Anstiegsphase aufgrund transienter Öffnungen der IP ₃ R, gefolgt von ein...

Diskussion

Wir beschreiben hier Protokolle zur Abbildung lokalen Ca ²⁺ Ereignisse in kultivierte Säugerzellen unter Verwendung von fluoreszierenden Ca ²⁺ Indikatoren. Darüber hinaus beschreiben wir einen Algorithmus mit einer intuitiven Benutzeroberfläche, die Identifikation und Analyse von erfassten Daten automatisiert. Das hier beschriebene Verfahren nutzen die fluoreszierenden Ca ²⁺ Anzeige Cal-520, aber viele andere Ca ²⁺ empfindlichen Farbstoffe wie Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8 und Oregon...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Humanes Neuroblastom SH-SY5Y-Zellen	ATCC	CRL-2266
Cal-520/AM	AAT Bioquest Inc.	21130
ci-IP3 (D-23-O-Isopropyliden-6-O-(2-Nitro-4,5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 1,4,5-trisphosphat-Hexakis(propionoxymethyl)-ester	SiChem	cag-iso-2-145-10
DMSO/20% pluronic F127	Invitrogen	P-3000MP
EGTA/AM	Invitrogen	E-1219
35-mm-Bildgebungsschüsseln mit Glasboden	MatTek	P35G-1.5-14-C