Methodenartikel

Die Beurteilung Transmissible Spongiforme Enzephalopathie Artgrenzen mit ein

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DOI:

10.3791/52522

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10. März 2015

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1USGS National Wildlife Health Center, 2Department of Soil Science, University of Wisconsin–Madison, 3Laboratory of Immunology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 4Merial Veterinary Scholars Program, School of Veterinary Medicine, University of Wisconsin–Madison, 5Department of Neurology, University of British Columbia

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Messung der Barriere für die Übertragung von Prionenkrankheiten zwischen den Spezies ist eine Herausforderung und beinhaltet typischerweise tierische Herausforderungen oder biochemische Assays. Hier präsentieren wir einen in vitro Prionenprotein-Umwandlungsassay mit der Fähigkeit, Speziesbarrieren vorherzusagen.

Zusammenfassung

Studien zum Verständnis der Übertragung von transmissiblen spongiformen Enzephalopathien (TSEs, Prionenkrankheiten) zwischen Spezies sind insofern eine Herausforderung, als sie typischerweise auf langwierigen und kostspieligen in vivo Tierprovokationsstudien beruhen. Eine Reihe von In-vitro-Assays wurden entwickelt, um die Messung von Prionen-Artenbarrieren zu unterstützen, wodurch der Tierverbrauch reduziert und schnellere Ergebnisse als bei Tier-Bioassays erzielt werden. Hier stellen wir das Protokoll für einen schnellen In-vitro-Prionen-Assay vor, der als Conversion Efficiency Ratio (CER)-Assay bezeichnet wird. In diesem Assay wird zelluläres Prionprotein (PrPC) aus einem nicht infizierten Wirtsgehirn sowohl bei pH 7,4 als auch bei 3,5 denaturiert, um zwei Substrate zu produzieren. Wenn das pH 7,4-Substrat mit einem TSE-Erreger inkubiert wird, wird die Menge an PrPC, die in einen Proteinase K (PK)-resistenten Zustand umgewandelt wird, durch die Speziesbarriere des ursprünglichen Wirts gegenüber dem TSE-Erreger moduliert. Im Gegensatz dazu wird PrPC im Substrat mit einem pH 3,5 von jedem TSE-Wirkstoff falsch gefaltet. Durch den Vergleich der Menge an PK-resistentem Prionprotein in den beiden Substraten kann eine Abschätzung der Speziesbarriere des Wirts vorgenommen werden. Wir zeigen, dass der CER-Assay die bekannten Prionen-Artenbarrieren von Labormäusen korrekt vorhersagt und zeigen als Beispiel einige vorläufige Ergebnisse, die darauf hindeuten, dass Rotluchse (Lynx rufus) anfällig für den Erreger der chronischen Auszehrungskrankheit des Weißwedelhirsches (Odocoileus virginianus) sein könnten.

Einleitung

Transmissible spongiforme Enzephalopathien (TSE, Prionenerkrankungen) sind eine Gruppe von tödlichen neurodegenerativen Erkrankungen mit verlängerten Inkubationszeiten, die eine Vielzahl von Tieren und Menschen zu beeinflussen. Die mutmaßliche ätiologische Agens von TSE besteht aus einer fehlgefalteten Isomer der Host Prionprotein (PrP), die in der Lage zur Selbstausbreitung von vorlagengesteuerten Umwandlung der normalen zellulären Form PrP (PrP C) in ein infektiöses, krankheitsassoziierte ist umfasste Formular (PrP TSE), die im zentralen Nervensystem Gewebe des infizierten Wirts 1 ansammelt. Infektiöse Prionen übertragen Säugetier Allgemeinen von Host-zu-Host in einem artenspezifisch, was zu dem Begriff der "TSE Artengrenze" Begrenzung Wirtsartwechsels Ereignisse 2 gegeben hat. Die biologischen Determinanten des Prion-Spezies-Barriere sind nicht gut verstanden. Aminosäuresequenz-Ähnlichkeit zwischen der infektiösen PrP TSE und dem Host-PrP C cein stark beeinflussen, ob die Umwandlung erfolgt 3-5, bleibt aber nicht aus, um alle in vivo 6,7 beobachtet Prionenübertragung Ereignisse erklären.

Somit hat die Charakterisierung von TSE Artschranken weitgehend von Tierexpositionsstudien herangezogen: Belichten naiven Tieren aus einer bestimmten Art von Prionen von einer anderen und durch Messen der resultierenden Inkubationszeit zu Beginn der Erkrankung und Erkrankungsrate als Indikator für die Übertragungseffizienz. Mäuse, die PrP C von heterologen Spezies werden auch für diese Art von Untersuchung 8 verwendet. Die Kosten im Zusammenhang mit transgenen Maus Produktion und langwierigen Prion Biotests sowie ethischen Überlegungen der Tiernutzung verbunden sind, sind Hindernisse für die experimentelle Untersuchung von TSE Artgrenzen. Bewertung der menschlichen Spezies-Barriere auf TSE vertraut auf Mäuse entwickelt, um menschliche PrP C auszudrücken. Diese Mäuse erfordern langen Inkubationszeiten, um die menschliche TSE oder Modifikationen an t erliegener menschlichen PrP-C-Molekül für eine schnelle Krankheitsbeginn 9. Inkubationszeiten für nicht-menschlichen TSE bei diesen Mäusen kann über die normale Maus Lebensdauer machen Interpretation der negativen Ergebnissen anspruchs erweitern. Nichtmenschliche Primaten sind auch als Stellvertreter für das Studium der menschlichen Spezies Barrieren verwendet worden, aber diese Studien behaftet mit den gleichen Herausforderungen wie andere Arten von Tierversuchen und nicht-menschlichen Primaten nicht genau rekapitulieren Krankheit, wie es in den menschlichen Wirt geht.

Tier Biotests bleiben der "Goldstandard" Verfahren zur Messung der Anfälligkeit einer Spezies auf eine TSE, aber die Hürden, Kosten und Ethik dieser Live-Tierstudien Untersuchung Alternativen gezwungen. Eine Reihe von in vitro-Tests, basierend auf der Beurteilung der Umwandlung von Wirts PrP C zu einer Proteinase K (PK) beständigen Zustand (PrP res), wenn sie von PrP TSE ausgesät, wurden entwickelt und verwendet, um zu untersuchen TSE spECIES Barrieren 10-12. Beispiele für in-vitro-Tests sind zellfreie Umwandlung Assays PMCA (PMCA) und die Umwandlungseffizienz-Verhältnis (CER) Assay 10-14. Während keiner dieser Tests in Betracht periphere Faktoren Artgrenzen nach einer natürlichen Infektion beteiligt zu nehmen, kann sinnvoll sein, alle potenziell anfälligen Wirten für TSE zu identifizieren.

Hier präsentieren wir das Protokoll für die CER-Test, bei dem zwei denaturiert PrP C Substrate von normalen Hirnhomogenaten abgeleitet sind in Tisch Prion Umwandlungsreaktionen verwendet (Abbildung 1) 13. PrP C in der bei pH 7,4 denaturiert Substrat kann nur an PrP res von PrP TSE umgewandelt werden ausgesät in die Umsetzung in Abwesenheit eines Speziesbarriere 14. Demgegenüber Denaturierung von PrP C in dem anderen Substrat bei pH 3,5 erlaubt es, an PrP res nach Inkubation umgewandelt werdenmit PrP TSE von irgendeiner Spezies und dient als Kontrolle für die Konvertierung. Das Verhältnis der Umwandlung von PrP C zu PrP res in pH 7,4 Substrats relativ gegenüber der pH 3,5 Substrat liefert ein Maß für die Artenbarriere. Wir haben festgestellt, dass die CER-Test prognostiziert bekannten Arten Barrieren der Labormäuse, verschiedene TSE und haben den Test bei den Bemühungen um die Artengrenze zahlreicher Säugetierarten, einschließlich Dickhornschafe, Chronic Wasting Disease (CWD) und anderen TSE 14 vorherzusagen, 15. Ermittler an einer Werkzeug ermöglicht ein schnelles Screening von TSE Artgrenzen oder Bewertung von PrP C to-PrP res Konvertierung wird diese Methode nützlich.

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Protokoll

Tier Arbeit an der USGS National Wildlife Health Center durchgeführt wurde, in Übereinstimmung mit der NIH Office of Laboratory Animal Welfare Richtlinien und unter institutionellen Tierpflege und Verwendung Ausschussprotokoll # EP080716 geführt. Gewebe von Jäger und geerntet Tiere waren Geschenke von der Wisconsin und Michigan Abteilungen für Naturressourcen.

1. Herstellung der Lösung

HINWEIS: Die unten aufgeführten Lösungen sind für die Vorbereitung der CER-Assay-Substrat in Abschnitt 2 unten erforderlich. Planen jeder dieser Lösungen von höherer Konzentration Stammlösungen; empfohlene Konzentration für Stammlösungen werden in Klammern nach jeder jeweiligen chemischen Bezeichnung aufgeführt erhalten. Bereiten Sie alle Lösungen frisch auf Untergrundvorbereitung und bei 4 ° C bis zur Verwendung.

  1. Für Lysepuffer, bereiten eine Lösung der folgenden in 10 mM Tris, pH 7,5 (1 M Tris, pH 7,5, Stammlösung empfohlen): 100 mM sOdium Chlorid (NaCl, 1 M Stammlösung), 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, 500 mM EDTA, pH 8,0 Stammlösung), 0,5% NP-40 (10% Stammlösung), 0,5% Desoxycholat (DOC, 10% Stammlösung ).
  2. Zur Umwandlung Puffer wird eine Lösung aus 0,05% Natriumdodecylsulfat (SDS, 10% ige Stammlösung) und 0,5% Triton X-100 (10% -ige Stammlösung) in 1 phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, 10, pH 7,4 Stammlösung).
  3. Für chaotropen Lösungen, bereiten zwei 3 M Lösungen von Guanidinhydrochlorid (GdnHCl, 8 M Lager) in 1x PBS (10x Stammlösung). Der pH-Wert einer der Lösungen auf 3,5 ± 0,05 unter Verwendung von konzentrierter Salzsäure (HCl). Prüfen, ob der pH-Wert der zweiten Lösung bei pH 7,4 ± 0,05 bleibt und stellen mit konzentrierter HCl oder Natriumhydroxid (NaOH), falls erforderlich.

2. Bereiten Sie CER Assay Substrat-Paare

  1. Erhalten gesunde, nicht-TSE-infizierten Hirngewebe von Spezies von Interesse und bereiten eine 10% Gewicht pro Volumen(W / v) Homogenat in Lysepuffer mit einer der folgenden Methoden: Dounce, Kugelmühle oder Mörser und Stößel Homogenisierung. Weiter verfeinern resultierenden Homogenate indem sie einer Spritze und Nadel-Homogenisierung mit Nadeln zunehmender Spur bis Substrat abgesaugt und mit Leichtigkeit durch eine 27G-Spritzennadel ausgestoßen werden.
    1. Für Substrate aus Nagetiere und andere kleine Säugetiere hergestellt homogenisieren gesamte Gehirn (s); für Substrate von größeren Säugetieren bereit, verwenden Obex (Hirnstamm) Gewebe-Homogenate vorzubereiten. Bei der Wahl der Menge von Hirnhomogenat vorzubereiten nicht mehr als 50% der Kapazität der Zentrifuge zur Eiweißfällung in Schritt 2.6 verwendet.
    2. Wenn die Qualität der erworbenen Hirngewebe ist fraglich, bewerten PrP-C-Spiegel durch SDS-PAGE und Immunoblot 16 17 vor der Untergrundvorbereitung.
  2. Teilen Sie Hirnhomogenat in zwei gleiche Volumina in separaten gekennzeichnete Kunststoff konische Röhrchen. Fügen GdnHCl (3 M Lösung in 1 PBS) bei entweder pH 3,5 oder 7,4 zu jedem Röhrchen in einem 1: 1 Volumenverhältnis zu Hirnhomogenisat.
  3. Überprüfen Sie die pH-Werte der beiden Lösungen. Den pH-Wert der pH 3,5 Substrat auf pH ± 0,05 unter Verwendung von konzentrierter HCl. Sicherstellen, dass der pH-Wert des anderen Substrats bei pH 7,4 ± 0,05 bleibt und der pH wird, falls notwendig, mit HCl oder NaOH nach Bedarf. Vermeiden Schwingen pH-Werte durch sorgfältige Zugabe von Säure oder Base.
  4. Drehen Lösungen auf einem End-Over-End-Mixer bei Raumtemperatur (RT) für 5 Stunden.
  5. Auszufällen Protein durch Zugabe vier Volumina Methanol zu den Substratlösungen in jeden konischen Rohr, Wirbel um gut zu mischen, und Inkubation bei -20 ° C für 16-18 Std.
  6. Sedimentproben durch Zentrifugation bei 13.000 × g für 30 min bei 4 ° C. Dekantieren Sie vorsichtig und entsorgen Sie die Überstände und lassen Methanol aus den Pellets verdampfen. Verwenden Sie Wattestäbchen, um bei der Aufnahme von Methanol zu der Innenseite des Rohres klammerte unterstützen. Lassen Sie keine Pellets zu über-dry und einmal Methanol nicht mehr sichtbar ist, mit dem nächsten Schritt fortzufahren.
  7. Resuspendieren Proteinpellets in Konvertierungspuffer. Verwenden einer Menge des Umwandlungspuffers gleich der Menge Hirnhomogenat Ausgangsmaterial in Schritt 2.2 in jedem Röhrchen verteilt.
    HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Umwandlung Puffer verwendet werden, um Protein-Pellets von beiden pH 3,5 und 7,4 behandelte Substrat Vorbereitungen resuspendieren wird die in Schritt 1.2 (die geringe Reinigungsmittel und einen physiologischen pH-Wert enthält) definiert Lösung.
  8. Kurz beschallen Substratlösungen in einem cuphorn Ultraschallgerät (10 sec bei ~ 30% der maximalen Leistung), Aliquots in 0,5 bis 1,0 ml-Volumina in der Bezeichnung 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Führen Sie eine Qualitätskontrolle Immunoblot (Schritt 2.9) aus einem aliquoten Teil von jedem Substrat. Bewahren anderen Aliquots bei -80 ° C bis zum Gebrauch CER-Test (Abschnitt 4) durchzuführen.
  9. Führen Sie die Qualitätskontrolle auf CER Substrat-Paare vor der Anwendung (Abbildung 2). Diese Schritte sicherzustellen, dass CER Substrate wird provide optimale Ergebnisse bei der Umwandlung Studien.
    1. Stellen Sie sicher, vergleichbare Mengen an PrP C in den beiden Substraten. Vergleichen PrP Ebenen in 10-25 ul jedes Substrat durch SDS-PAGE und Immunoblotting 16 17. Wenn Protein-Spiegel in der pH 7,4 und 3,5 Substrate innerhalb von ~ 10% voneinander unterscheiden, sind die Substrat-Paare für die Verwendung in CER Studien geeignet.
      HINWEIS: Die PrP Immunoblots nicht Beweise für umfangreiche PrP C Abbau zeigen. Das PrP Immunreaktivität sollte vor allem> 20 kDa ist. Bands geringer als dieser Molekülmasse können Abbauprodukte sein. Bandenmuster sollte etwa gleich zwischen Substrat-Paare sein.
    2. Da die PrP C in beiden Substraten sollte PK empfindlich sein, behandeln 10-25 ul jedes Substrats mit PK in einer Endkonzentration von 100 ug / ml und verdauen Proben bei 1000 Upm bei 37 ° C für 1 Stunde in der Thermoschüttler. Beurteilen verbleibende PrP Signals durch SDS-PAGE und Immunoblotting 16 17.Substrate mit PrP res sind nicht für den Einsatz in CER Studien geeignet.

3. Bereiten Sie TSE-Agent Seeds

  1. Erhalten TSE-infizierten Hirngewebe von Spezies von Interesse und bereiten eine 10% (w / v) Homogenat in 1x PBS, pH 7,4, unter Verwendung der in Schritt 2.1 oben genannten Methoden.
    HINWEIS: Saatgut kann auch aus anderen TSE-infizierten Geweben außerhalb des zentralen Nervensystems hergestellt werden, aber die Effizienz der Umwandlung der aus dem Gehirn stamm Substraten durch Samen von TSE-infizierten peripheren Geweben abgeleitet wurde noch nicht experimentell in der Literatur untersucht.
  2. Aliquoten resultierende Homogenat (n) in 100-300 ul-Volumina in 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und bei -80 ° C, bis bereit, die CER-Test durchzuführen.

4. CER Assay

HINWEIS: Die CER Test umfasst Zugabe einer relativ kleinen Menge von PrP TSE (in der "Samen" zur Verfügung gestellt) von einer Speziesin einen relativen Überschuss von PrP C von einer anderen Spezies, das teilweise an entweder pH 3,5 oder 7,4 denaturiert (in der nicht-infizierten Hirn "Substrat", zur Verfügung gestellt). Nach einer längeren Schütteln Inkubationszeit wird vorlagengesteuerten Umwandlung von PrP C von PrP TSE in jeder Reaktion durch densitometrische Signal des PrP res übrigen nach PK-Verdau und Immunoblot-Nachweis untersucht. Vergleichen PrP res Ebenen der Substrate zuvor bei pH 3,5 vs. 7,4 denaturiert liefert ein Maß für die Artenbarriere. Eine experimentelle Übersicht dieses Testverfahrens ist in 1 bereitgestellt.

  1. Langsam tauen nicht infizierte CER Substrat-Paare (Assay erfordert gleiche Volumina Substrate zuvor sowohl auf pH 3,5 und 7,4 denaturiert) und TSE-infizierte Saatgut-Lösungen, indem sie auf einem Bett aus Eis (ca. 1 Stunde auftauen Zeit).
  2. Sobald sie vollständig aufgetaut, absaugen und dann vertreiben jedes Substratlösung durch eine27 G Injektionsnadel mehrmals neu zu homogenisieren. Kurz beschallen jeden TSE-infizierten Samen Lösung für 10 s bei ca. 30% der maximalen Leistung. Bewahren Sie alle Lösungen auf Eis während der Vorbereitung Umwandlungsreaktionen.
  3. Label 5 Einzel geringe Bindungs, dünnwandigen PCR-Röhrchen pro TSE-Erreger getestet.
  4. Bereiten Umwandlungsreaktionen in diesen Rohren durch Zugabe von 5 ul 10% TSE-infizierten Samen Lösung in 95 & mgr; l von (a) CER Substrat bei pH 7,4 und (b) CER Substrat bei pH 3,5 hergestellt.
    1. Für jede Versuchsprobe, bereiten Parallelreaktionen in CER Substrat-Paare zuvor sowohl auf pH 3,5 und 7,4 denaturiert.
    2. Optimieren Verhältnisse von TSE-Erregern Samen nicht infizierten Gehirnsubstrat durch empirische Bestimmung. Gemeinsame Samen: Substrat Verhältnissen eingesetzt pflegen eine Gesamtreaktionsvolumen von 100 ul und beinhalten 1:99 ul, 2:98 und 5:95 ul ul. Für die meisten Anwendungen, die 5:95 ul Samen: angemessen ist Substrat-Volumen-Verhältnis und ist das, was in th vorgestelltist Protokoll.
  5. Bereiten Sie drei Kontrollproben pro TSE-Erreger wird wie folgt geprüft: (a) mit 5 ul 10% TSE-infizierte Saatgut Lösung auf 95 & mgr; Konvertierungspuffer als Kontrolle für Eingabe PrP res; mit 5 ul Konvertierungspuffer 95 & mgr; l Substrat in (b) pH 3,5 und (c) pH 7,4 als Kontrollen für nicht-spezifische, nicht-gestützten Umwandlung vorbereitet.
  6. Vortexen Sie jede Probe in seiner geschlossenen PCR-Röhrchen, um Saatgut und Substrat gut mischen. Folgen Sie mit einem momentanen Impuls in einem Low-Speed-Tisch Mini-Zentrifuge, jede Volumen des Reaktionsgemisches in der PCR-Röhrchen Deckel gefangen zu entfernen.
  7. Tragen Sie die Proben in individuell-markierten PCR-Röhrchen in einer Tischthermoschüttler ausgestattet, um PCR-Röhrchen zu akzeptieren. Schütteln Proben bei 1000 Upm bei 37 ° C für 24 Stunden.
  8. Nach Umschütteln Sarcosyl in einer Endkonzentration von 2% (w / v) und PK auf eine Endkonzentration von 100 ug / ml. Digest Proben bei 1000 Upm bei 37 ° C für 1 Stunde in der Thermoschüttler.
    NHINWEIS: Die Zugabe von Sarkosyl Proben nach der Konvertierung hilft bei der PK Verdauung von PrP C. Falsch positive Signale in ungeimpften Proben (Schritt 4.5) praktisch durch Zugabe von Sarkosyl eliminiert.
  9. Hinzufügen SDS-PAGE-Probenpuffer, Wärme Proben auf 95 ° C für 5 Minuten und Lösung verbleibenden PrP res in jeder Probe durch SDS-PAGE 16 gefolgt von Immunoblotting 17.
    HINWEIS: Nach Zugabe von Probenpuffer und Heizung, Proben können sofort verarbeitet werden oder Proben können bei -20 ° C oder vor dem Immunoblotting gespeichert -80ºC. Alle hier vorgestellten Daten wurden unter Verwendung der Novex NuPAGE Gel und Transfersysteme erzeugt. Einzelne Proben aus dem CER-Test wurden mit Probenpuffer und Reduktionsmittel nach Herstellerangaben behandelt. Die Proben wurden anschließend bei 95 ° C für 5 min erhitzt und 30 ul jeder Probe wurde in eine 12% Bis-Tris Fertiggelen geladen.
  10. Berechnen des Umwandlungswirkungsgrad (CER) als MaßArtenschranke. Maßnahme Ebenen PrP res densitometrisch 17 und unterteilen die Gesamtdichte des pH 7,4 Probe durch diejenige des pH 3,5 Probe. Mit 100 multipliziert, um einen Prozentsatz zu produzieren.
  11. Kompilieren von Daten aus unabhängigen experimentellen Wiederholungen, um eine mittlere CER ± Standardabweichung für eine Spezies mit einer bestimmten TSE-Erreger zu generieren.

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Ergebnisse

Der erfolgreiche Einsatz des CER Assay hängt weitgehend von der Qualität der in Umwandlungsreaktionen verwendeten Substrat-Paaren. Aus diesem Grund folgt vor, um CER Substratpaare vorbereiten, eine Qualitätskontrolle Immunoblot sollte (Abbildung 2) durchgeführt werden. Für beide Substrate Assay 10-25 ul durch Immunoblotting. PrP C sollte in jedem Substrat leicht nachweisbar sein und PrP C Ebenen müssen etwa gleich zwischen den beiden. Immunreaktivität wird vor allem sichtbar oberha...

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Diskussion

Bei erfolgreichem Abschluss des Protokolls sollte die Aufmerksamkeit auf PrP-C-Spiegel bei nichtinfizierten zur Untergrundvorbereitung (Schritt 2.1.2) und der Samen-Verhältnis für Umwandlungsreaktionen (Schritt 4.4.2) Substrat verwendet Hirngewebe zu zahlen. Nach unserer Erfahrung können Gehirne für die Verwendung als CER-Substrat nach einem beträchtlichen Zeitraum post mortem entnommen werden, solange PrP C durch Immunoblotting (Abbildung 4) vorhanden ist. In der Tat wurden einige...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken John Olsen (Wisconsin Department of Natural Resources), Tom Cooley, Daniel O'Brien und Steve Schmitt (Michigan Department of Natural Resources) und Dr. Daniel Walsh (USGS National Wildlife Health Center) für ihre Unterstützung bei der Gewebeakquise. Wir danken auch dem Wisconsin State Laboratory of Hygiene für die diagnostischen Tests und Dr. Tonie Rocke und ihren Mitarbeitern (USGS National Wildlife Health Center) für die Nutzung der Geräte. Jegliche Verwendung von Handels-, Produkt- oder Firmennamen dient nur zu beschreibenden Zwecken und impliziert keine Billigung durch die US-Regierung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
12% Bis-Tris SDS-PAGE GeleLife TechnologiesNP0342
0,5 mm Zirkonoxid-KügelchenNext AdvanceZROB05Andere Arten von Beads sind ebenfalls wirksam
Antikörperverschiedene LieferantenWählen Sie geeignete Primär- und Sekundärantikörper für den Immunoblot-Nachweis von PrPres aus Spezies von Interesse
Bead-HomogenisatorNächster AdvanceBBY24M
ZentrifugeBeckmanCoulter 369434Hohe Geschwindigkeit mit Temperaturregelung
Konische Rohrejeder Marke
Applikator mit WattespitzeUlineS-18991
Cuphorn-UltraschallgerätHeat Systems-UltrasonicsW-380Heat Systems-Ultrasonics, Inc. ist jetzt Qsonica, LLC
Densitometry SoftwareprogrammUVPVision Works LS Software für Bilderfassung und -analyseAndere Programme, wie z. B. NIH ImageJ, funktionieren auch Dounce
HomogenisatorKimble Chase885300
End-over-End-MischerLabnet InternationalH5600
EthylendiamintetraessigsäureBoston BioproductsP-770Gefährliche Chemikalie: Augenreizung
Guanidinhydrochlorid, 8 MThermo Fisher Scientific24115Gefährliche Chemikalie: akute Toxizität, Hautreizungen, Augenreizungen
HeizblockFisher Scientific11-718
SalzsäureSigma-Aldrich435570Gefährliche Chemikalie: stark saure
Lithiumdodecylsulfat-Probenpuffer, 4xLife TechnologiesNP0008Gefährliche Chemikalie: Haut & Haut Reizung der Atemwege, schwere Augenschäden, brennbarer fester Methanol
Fisher ScientificA454-4Gefährliche Chemikalie: akute Toxizität, entzündliche Flüssigkeit
Mikrozentrifugenröhrchenjeder Marke
Mini-ZentrifugeLabnet InternationalC1301
N-Lauroyl-Sarcosin (Sarkosyl)Sigma-Aldbsp;L-5125Gefährliche Chemikalie: akute Toxizität, Hautreizung, Augenschädigung
Nonidet P-40AmrescoM158Gefährliche Chemikalie: Hautreizung, Augenschädigung
SDS-PAGE Gelsystem LifeTechnologiesNuPAGE ElektrophoresesystemAndere SDS-PAGE-Systeme funktionieren auch
PCR-Röhrchen (geringe Bindung)AxygenPCR-02-L-C
Stößel-HomogenisatorFisher Scientific03-392-106
pH-MessgerätSentronSI600
Polyvinyldifluorid-MembranMilliporeIPVH00010
Proteinase KPromegaV3021Gefährliche Chemikalie: Haut- und Augenreizungen, Sensibilisierung der Atemwege, Organtoxizität
Reduktionsmittel für SDS-PAGE-Proben, 10xLife TechnologiesNP0009
NatriumchloridFisher Scientific7647-14-5
NatriumdesoxycholatSigma-Aldrich D6750Gefährliche Chemikalie: akute Toxizität
NatriumdodecylsulfatThermo Fisher Scientific28364Gefährliche Chemikalie: akute Toxizität, Hautreizung, Augenschäden, entzündlicher Feststoff
NatriumhydroxidSigma-AldrichS5881Gefährliche Chemikalie; starke Basis
SpritzeBD BiosciencesverschiedeneVerwenden Sie die Spritzengröße, die dem Volumen des zu homogenisierenden Substrats entspricht
SpritzennadelnBD Biosciencesverschiedene
Thermoshaker (PCR-Röhrchenschüttler)Hangzhou Alle Sheng InstrumentsMS-100
Tris baseBio Basic77-86-1Gefährliche Chemikalie: Haut, Auge, Atemwegsreizungen
Triton X-100Integra Chemical CompanyT756.30.30Gefährliche Chemikalie: akute Toxizität, Augenreizung
VortexerFisher Scientific12-812

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