Ex Utero Elektroporation und Organotypischen Kultur der Maus Hippocampus-Gewebe

Sathish Venkataramanappa; Ruth Simon; Stefan Britsch

doi:10.3791/52550

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Methodenartikel

Ex Utero Elektroporation und Organotypischen Kultur der Maus Hippocampus-Gewebe

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DOI:

10.3791/52550

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4. März 2015

Sathish Venkataramanappa¹ , Ruth Simon¹ , Stefan Britsch¹

¹Institute of Molecular and Cellular Anatomy, University of Ulm

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das ein Werkzeug zur Untersuchung der Regulationsmechanismen bestimmter Gene während der Hippocampus-Entwicklung bietet. Der Einsatz von Ex-utero-Elektroporation und organotypischer Schnittkultur ermöglicht die Hoch- und Herunterregulierung der Expression von Genen von Interesse in einzelnen Zellen und die Verfolgung ihres Schicksals während der Entwicklung.

Zusammenfassung

Die Mausgenetik bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Rolle bestimmter Gene während der Entwicklung zu bestimmen. Die Analyse der resultierenden Phänotypen mit immunhistochemischen und molekularen Methoden gibt Aufschluss über mögliche Zielgene und Signalwege. Um spezifische Regulationsmechanismen weiter aufzuklären, ist ein System erforderlich, das es ermöglicht, nur eine kleine Anzahl von Zellen eines bestimmten Gewebes entweder durch Überexpression, Ablation oder Wiedereinführung spezifischer Gene zu manipulieren und deren Schicksal während der Entwicklung zu verfolgen. Um dies ex utero zu erreichen, bietet die Elektroporation von Hippocampusstrukturen, insbesondere des Gyrus dentatus, gefolgt von einer organotypischen Schnittkultur, ein solches Werkzeug. Die Verwendung dieses Systems zur Generierung von Mosaik-Deletionen ermöglicht es, zu bestimmen, ob das interessierende Gen zellautonome Entwicklungsprozesse wie die Proliferation von Vorläuferzellen oder die neuronale Differenzierung reguliert. Darüber hinaus erleichtert es die Rettung von Phänotypen, indem es das deletierte Gen oder seine Zielgene wieder einführt. Im Gegensatz zur In-utero-Elektroporation verbessert der Ex-utero-Ansatz die Rate, tiefere Schichten des Gehirns, wie z. B. den Gyrus dentus, erfolgreich zu erreichen. Insgesamt bieten die Ex-utero-Elektroporation und die organotypische Schnittkultur ein wirksames Werkzeug zur Untersuchung von Regulationsmechanismen in einer semi-nativen Umgebung, die endogene Bedingungen widerspiegelt.

Einleitung

Der Hippocampus spielt eine wichtige Rolle im Gedächtnis und Lernen sowie emotionales Verhalten. Eine Hauptfunktion besteht in der Konsolidierung des Kurzzeitgedächtnisses in das Langzeitgedächtnis, die hohe Plastizität des Nervensystems erfordert. Der Gyrus dentatus des Hippocampus wirkt als primäre Gateway für Eingabeinformation und ist auch einer der beiden Hirnregionen mit laufenden Neurogenese im Erwachsenenalter ^1,2. Die Entwicklung der hippocampalen Struktur tritt während der späten Embryogenese und insbesondere während der ersten 3 bis 4 Wochen nach der Geburt ^3. Während der frühen Entwicklung des Gyrus dentatus eine Stammzellpools herge....