Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Ex Utero Elektroporation und Organotypischen Kultur der Maus Hippocampus-Gewebe

9.3K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/52550

⸱

4. März 2015

 ,  , 
1Institute of Molecular and Cellular Anatomy, University of Ulm

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das ein Werkzeug zur Untersuchung der Regulationsmechanismen bestimmter Gene während der Hippocampus-Entwicklung bietet. Der Einsatz von Ex-utero-Elektroporation und organotypischer Schnittkultur ermöglicht die Hoch- und Herunterregulierung der Expression von Genen von Interesse in einzelnen Zellen und die Verfolgung ihres Schicksals während der Entwicklung.

Zusammenfassung

Die Mausgenetik bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Rolle bestimmter Gene während der Entwicklung zu bestimmen. Die Analyse der resultierenden Phänotypen mit immunhistochemischen und molekularen Methoden gibt Aufschluss über mögliche Zielgene und Signalwege. Um spezifische Regulationsmechanismen weiter aufzuklären, ist ein System erforderlich, das es ermöglicht, nur eine kleine Anzahl von Zellen eines bestimmten Gewebes entweder durch Überexpression, Ablation oder Wiedereinführung spezifischer Gene zu manipulieren und deren Schicksal während der Entwicklung zu verfolgen. Um dies ex utero zu erreichen, bietet die Elektroporation von Hippocampusstrukturen, insbesondere des Gyrus dentatus, gefolgt von einer organotypischen Schnittkultur, ein solches Werkzeug. Die Verwendung dieses Systems zur Generierung von Mosaik-Deletionen ermöglicht es, zu bestimmen, ob das interessierende Gen zellautonome Entwicklungsprozesse wie die Proliferation von Vorläuferzellen oder die neuronale Differenzierung reguliert. Darüber hinaus erleichtert es die Rettung von Phänotypen, indem es das deletierte Gen oder seine Zielgene wieder einführt. Im Gegensatz zur In-utero-Elektroporation verbessert der Ex-utero-Ansatz die Rate, tiefere Schichten des Gehirns, wie z. B. den Gyrus dentus, erfolgreich zu erreichen. Insgesamt bieten die Ex-utero-Elektroporation und die organotypische Schnittkultur ein wirksames Werkzeug zur Untersuchung von Regulationsmechanismen in einer semi-nativen Umgebung, die endogene Bedingungen widerspiegelt.

Einleitung

Der Hippocampus spielt eine wichtige Rolle im Gedächtnis und Lernen sowie emotionales Verhalten. Eine Hauptfunktion besteht in der Konsolidierung des Kurzzeitgedächtnisses in das Langzeitgedächtnis, die hohe Plastizität des Nervensystems erfordert. Der Gyrus dentatus des Hippocampus wirkt als primäre Gateway für Eingabeinformation und ist auch einer der beiden Hirnregionen mit laufenden Neurogenese im Erwachsenenalter 1,2. Die Entwicklung der hippocampalen Struktur tritt während der späten Embryogenese und insbesondere während der ersten 3 bis 4 Wochen nach der Geburt 3. Während der frühen Entwicklung des Gyrus dentatus eine Stammzellpools hergestellt für postnatale erforderlich sowie adulte Neurogenese 4. Entwicklung von Nervenzellen durchlaufen verschiedene Stadien, von der Stammzelle über mehrere Stufen der Vorläuferzellen in die unreifen und schließlich reifen Neuronen während der postnatalen und adulten Neurogenese. In verschiedenen Stadien der Neurogenese die Expressionspezifische Gene erforderlich ist, um die Reifung und Integration neuer Neuronen in Hippocampus-Schaltung 5,6 erlauben.

Verwendung Mausgenetik und Phänotypanalyse immunhistochemisch sowie molekulare Methoden erlaubt die Definition der Expressionsmuster und Funktion vieler dieser Gene. Neben Microarray-Analyse sowie Chromatinimmunpräzipitation (ChIP) zur Verfügung gestellten Informationen über potenzielle direkte und indirekte Zielgene 7,8. Allerdings gibt es noch viele offene Fragen über die Regulierungsmechanismen der Hippocampus-Entwicklung, insbesondere die Entwicklung des Gyrus dentatus. Um einen tieferen Einblick, wie spezifische Gene reguliert ein System erforderlich erlaubt die Manipulation von einer kleinen Anzahl von Zellen durch Down- oder Hochregulierung des Gens von Interesse und / oder seinen Zielgenen und folgen ihr Schicksal während der Entwicklung zu erhalten. In utero Elektroporation von shRNAs, cDNA der Gene von Interesse oder Cre recombinase stellt ein solches Werkzeug. Um das Vorhandensein der gewünschten DNA oder kleine RNAs Expressionsplasmide sollte für die Elektroporation verwendet werden, zu gewährleisten. Dieser Ansatz ist erfolgreich bei der Untersuchung kortikalen Entwicklung 9,10 ein herausfordernder Ansatz Untersuchung der Entwicklung des Gyrus dentatus auf Grund der Position der hippocampalen Strukturen tiefer Gehirnschichten implementiert, aber ist.

Ex utero Elektroporation gefolgt von organotypischen Kultur ist ein Ansatz, um dieses Problem zu umgehen 11,12. Im Gegensatz zu den in utero Elektroporation nicht den gesamten Embryo aber nur der Kopf verwendet ermöglicht es daher, die Elektroden in einer günstigeren Weise, die shRNA / DNA Richtung Hippocampus und Gyrus dentatus direkt auszulösen. Unsere Gruppe erfolgreich eingesetzt ex utero Elektroporation, um die Rolle des Transkriptionsfaktors BCL11B im Gyrus dentatus Entwicklung 8 studieren. BCL11B hat eine doppelte Funktion Gyrus dentatus Entwicklung regulating Vorläuferzellproliferation und Differenzierung wurde durch Immunhistochemie nachgewiesen. Um einen Mechanismus für BCL11B Einbindung in diesen Prozessen weiter zu definieren, wurden Protokolle des Polleux Gruppe 11,12 eingestellt, um den Gyrus dentatus, wie unten in dem Protokoll beschrieben untersuchen. In einem ersten Ansatz wurde die Frage angesprochen, ob BCL11B regelt neuronalen Zelldifferenzierung Zelle autonom. Ein zweiter Ansatz untersucht, ob Desmoplakin, Direkt Zielgen BCL11B, genügt, um die BCL11B Phänotyp retten.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

HINWEIS: Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem deutschen Recht durchgeführt und wurden von den Regierungsstellen in Tübingen genehmigt.

1. Herstellung der Mikropipetten, Lösungen und Membranen

  1. Herstellung von Mikropipetten
    1. Ziehen Glasmikropipetten mit einer Mikropipette Abzieher mit folgendem Programm: Wärme: 540, Ziehen: 125, Geschwindigkeit: 20 und Delay: 140. Die Nadellänge beträgt 5,5 cm.
    2. Kegel Nadeln mit einem microgrinder einen geeigneten Spitzengröße von 4 mm zu erhalten. Speichern die Nadeln in einer Box oder 15 cm Petrischale werden Beschädigungen an den Spitzen.
  2. Zubereitung der Lösungen
    1. Plasmid-DNA-Lösung
      1. Vorbereitung von Plasmid-DNA, die die gewünschte cDNA-Konstrukts unter Verwendung eines Endotoxin-freien Maxi-Prep-Kit nach Herstellerprotokoll.
      2. Einzustellen Plasmid-DNA-Lösung auf eine Endkonzentration von 3 & mgr; g / & mgr; l (ohne GFP Spike vector) oder 4 & mgr; g /ul (mit 1 ug GFP Spike Vektor) in endotoxinfreiem Tris-EDTA-Puffer, der Fast Green (Endkonzentration 0,05%).
    2. Laminin Stammlösung
      1. Man löst 1 mg Laminin in sterilem Wasser bis zu einem Endvolumen von 1 ml. Bereiten Sie 100 ul Aliquots und bei -80 ° C.
    3. Poly-L-Lysin-Stammlösung
      1. Man löst 50 mg Poly-L-Lysin in 50 ml sterilem Wasser bis zu einer Endkonzentration von 1 mg / ml. Bereiten Sie 1 ml Aliquots und lagern in -20 ° C.
    4. Füllen Hanks Balanced Salt Solution (Complete HBSS)
      1. Bereiten komplette HBSS durch Kombination von 100 ml 10x HBSS, 2,5 ml 1 M HEPES-Puffer (pH 7,4), 30 ml 1 M D-Glucose, 10 ml 100 mM CaCl 2, 10 ml von 100 mM MgSO 4 und 4 ml 1 M NaHCO 3. In sterilem Wasser bis zu 1 l und bei 4 ° C.
        HINWEIS: Autoklav alle Lösungen erwarten, 1 M HEPES-Puffer und 1 M D-Glucose, die fil sindter sterilisiert.
    5. Slice-Kultur-Medium
      1. Bereiten Scheibe Kulturmedium durch Zugabe von 35 ml von Basal Medium Eagle, 12,9 ml komplettem HBSS (1.2.4), 1,35 ml 1 M D-Glucose, 250 & mgr; l von 200 mM L-Glutamin und 500 & mgr; l Penicillin-Streptomycin erhalten ein Endvolumen von 50 ml. Hinzufügen Pferdeserum auf eine Endkonzentration von 5% und bei 4 ° C.
    6. Mit niedrigem Schmelzpunkt (LMP) Agarosegel
      1. Vorbereiten einer 4% LMP Agarose-Lösung durch Zugabe von 2 g des LMP-Agarose auf 50 ml komplettem HBSS (1.2.4), gefolgt von Erhitzen in einer Mikrowelle für 1-2 min bei hoher Leistung. Diese Lösung wird in einem Wasserbad bei 37 bis 39 ° C. Die Lösung ist bei 4 ° C und Wiederverwendung.
    7. Paraformaldehydlösung
      1. In einem Abzug bereiten eine 4% Paraformaldehyd (PFA) Lösung durch Zugabe von 4 g Paraformaldehyd in 100 ml 1x PBS. Die Lösung wird auf 60 ° C und ein paar Tropfen 1 N NaOH, bis die Lösung cLear.
    8. Permeabilisierung Lösung
      1. Man löst 9 g BSA in 300 ml 1x PBS, enthaltend 0,3% Trition X-100 und bei 4 ° C. Zugabe von 10% Natriumazid für eine Langzeitspeicherung.
  3. Beschichtung der Membraneinsätze
    1. Verdünne ein Aliquot von Laminin-Stammlösung (1.2.2) und ein Aliquot von Poly-L-Lysin-Stammlösung (1.2.3) in sterilem Wasser auf ein Endvolumen von 12 ml.
    2. Platzieren Membraneinsätze in Platten mit 6 Vertiefungen mit jeweils gut mit 2 ml sterilem Wasser. 1 ml der Beschichtungslösung auf die Oberseite der Membran und inkubieren O / N bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator.
    3. Nach Inkubation die Membraneinsätze dreimal mit 1 ml sterilem Wasser und trocken. Verwenden beschichteten Membran-Einsätze am selben Tag oder bei 4 ° C für bis zu vier Wochen in einem trockenen 6-Well-Platte.

2. DNA-Injektion und Elektroporation von E15.5 und E18.5 Embryonen

  1. Anesthetize eine Zeit gepaart weiblichen Maus, indem Sie es in eine betäubende Kammer mit 5% Isofluran gesättigten und einem Verdampfer verbunden. Zirkulieren Isofluran und Sauerstoff mit einer Rate von 1 L / min. Halten Sie das Tier in der Box für 2-4 Minuten oder bis zum Unbewussten, die durch Zusammendrücken zwischen den Pfoten der Maus getestet wird.
  2. Euthanize den bewusstlosen Maus durch Genickbruch an embryonalen Tag (E) 15,5 oder 18,5. Präparieren Sie die Gebärmutter, die die Embryonen 13 und legen Sie sie in eine Petrischale mit 15 bis 20 ml kaltem komplette HBSS.
    HINWEIS: Von diesem Punkt an, halten Sie die Embryonen und Gewebe auf Eis.
  3. Verwenden Sie eine Schere, um jeden Embryo aus dem Uterushorn und Ort in eine zweite Petrischale mit kaltem HBSS komplett zu trennen.
  4. Unter einem Binokular, trennen die Uterusmuskulatur Wand und die Plazenta mit einer feinen Pinzette (# 55) und eine Schere. Vorsichtig lösen, den Embryo aus dem Dottersack.
  5. Verwenden Sie ein Paar Bonn Schere decapitate die Embryonen gerade oberhalb der Vorderbeine bei einem Winkel von 60º. Wenn das Experiment erfordert Genotypisierung der Embryonen, sammeln eine Gewebeprobe für die Isolierung genomischer DNA (ein kleines Stück Schwanz).
  6. Übertragen Sie den Kopf, um eine saubere und trockene Petrischale. Da der Kopf war in einem Winkel von 60 ° enthauptet wurde, sollte der Kopf zur Seite neigen, wenn platziert dorsalen Seite nach oben.
  7. Platzieren einer Nadel vorsichtig in der Mitte der Halbkugel in der Nähe der Bregma (1A, B). Injizieren etwa 2-3 & mgr; l (bei 3 oder 4 ug / ul) DNA-Lösung, indem er auf das Pedal des Picospritzer III unter Verwendung von 30 Pfund Druck für die Dauer von 10-15 ms pro Impuls Aufbringen 5-8 Impulsen. Die Dauer und die Anzahl der Impulse ist abhängig vom Durchmesser des Nadelöffnung mit kleineren Öffnungen mehr Zeit erfordern. Der Abstand zwischen jedem Impuls beträgt 1 sec.
  8. Vor dem Einsetzen der Elektroden, ein paar Tropfen von kompletten HBSS auf den Kopf des embryo. Die Elektroden werden in der Weise, daß die "negative" Klemme auf der gleichen Seite wie das injizierte Herzkammer und der "positive" Elektrode, die auf der gegenüberliegenden Seite des eingespritzten Ventrikel unter dem Ohr des Embryos Kopf (1C, D). Bewerben 5 Impulse von 50 V.
    1. Verwenden Sie 3 mm Elektroden für E 15.5 und 5 mm Elektroden für E 18.5.

3. Präparation des Gehirns

  1. Nach der Elektroporation, beim Abziehen der Haut von dem Kopf mit Hilfe einer feinen Pinzette. Verwendung eines Paares von Feder Schere einen kleinen Einschnitt in der Mitte des Kleinhirns an der Mittellinie des Schädels.
  2. Setzen Sie die Feder Schere in den Einschnitt und geschnitten längs entlang der Pfeilnaht. Ziehen Sie die Schädel und lösen das Gehirn aus dem Schädel durch die Verwendung einer feinen Pinzette. Übertragen Sie das gesamte Gehirn in 15-20 ml kaltem HBSS komplette Lösung.
  3. Inzwischen pour 4% LMP-Agarose,bei 37-39 ° C in einem Wasserbad gehalten wird, in eine Abzieh-Form.
  4. Nehmen Sie das Gehirn aus dem kompletten HBSS von einer kleinen Schaufel Spachtel und Abfluss über HBSS mit Hilfe feiner Seidenpapier oder Kimwipes.
  5. Stellen Sie das gesamte Gehirn sanft in die Agarose und stellen Sie ihre Position mit einer feinen Nadel. Halten Sie die Form auf Eis, bis die Agarose verfestigte und der Block wird geschnitten (für Koronalschnitte die Riechkolben nach oben zeigen).

4. Vibratom Schnitte und Slice-Kultur-

  1. Schneiden Sie die LMP-Agarose-Blöcke und kleben sie auf dem Probentisch mit "Superkleber". Nach der Kleber trocken Übertragung der Probentisch in die Pufferwanne des Vibratom und füllen mit eiskaltem HBSS abzuschließen, bis der Block in die Lösung eingetaucht.
    HINWEIS: Sterilisieren Sie alle Instrumenten- und Geräteoberflächen mit 70% Ethanol vor dem Schneiden.
  2. Bereiten 250 um dicken Vibratom Abschnitte mit einer neuen Klinge wie folgt.
    1. Schneiden Sie die Block with folgenden Einstellungen; Frequenz - 60 Hz, Amplitude - 0,7 um, Geschwindigkeit 16-18 mm / sek. Schneiden Sie die Abschnitte, die mit den obigen Einstellungen bei niedriger Geschwindigkeit (9 mm / s) das gewünschte Gewebe. Ab der Schnitt aus dem Hinterhirn, sammeln 5-7 Abschnitte aus dem Großhirn.
    2. Übertragen Sie die Teile auf ein sauberes 6 Well-Kulturschale mit 5 ml eiskaltem HBSS mit Hilfe eines gebogenen Spatel zu vollenden und zu halten auf dem Eis, bis alle Abschnitte werden gesammelt (1E).
  3. Feuchten Sie die Membran in einem Quer Mode mit 100 ul HBSS komplette, bevor die Abschnitte auf der Membran, um die Ausrichtung der Abschnitte zu erleichtern.
  4. Übertragen Sie die Abschnitte mit einem gebogenen Spatel auf die Membran (abholen eine Ecke des Abschnitts mit einer Pinzette und ziehen auf den Spatel und dann mit der Zange, um den Abschnitt auf die Membran zu drücken). Legen Sie bis zu fünf Abschnitte auf einer Membran und vereinbaren Sie mit einer Pinzette (1F). Nicht überlappen die Abschnitte miteinander.
    1. Nehmen Sie die überschüssigen HBSS von der Membran mit einer Pipette. Die spezifischen Membranen hier sind an einem Rahmen befestigt ist und in das Gewebekulturplatte, die das Gewebe in Kontakt zu sein, aber nicht durch das Mittel bedeckt ermöglicht eingefügt.
  5. Setzen Sie die Membraneinsätze in einen 6 Well-Platte mit 1,8 ml Stück Kulturmedium (1.2.5) (Abbildung 1 G, H). Inkubieren der Kulturschale bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 11 oder 14 DIV DIV. Ändern Sie die Hälfte des Mediums (0,9 ml) jeden zweiten Tag.
    HINWEIS: In diesem Stadium hinzu Reagenzien wie Bromdesoxyuridin (BrdU; 10 & mgr; M Endkonzentration) für die Kennzeichnung von proliferierenden Zellen zu den Medien für die ersten 20 Stunden der Kulturzeit.

5. Fixierung der Sektionen durch Immunfluoreszenzfärbungen Gefolgt

  1. Verwenden Sie eine saubere und scharfe Skalpellklinge zu schneiden und trimmen die Membranen in Abhängigkeit von der Ausrichtung derdie Abschnitte.
  2. Übertragen der Abschnitte zusammen mit der Membran auf eine Platte mit 24 Vertiefungen, die 1 ml 4% PFA (1.2.7). Inkubiere die Abschnitte für 1 h bei RT, gefolgt von 3 Waschungen mit 1x PBS für je 15 min. Inkubieren der Abschnitte O / N bei Permeabilisierung Lösung bei 4 ° C unter leichtem Schütteln.
  3. Am folgenden Tag, Inkubation der Schnitte mit geeigneten primären Antikörper, in Permeabilisierung Lösung verdünnt, O / N oder für 48 Stunden bei 4 ° C unter leichtem Schütteln.
  4. 3 Mal Waschen Sie die Teile für 15 min mit 1x PBS und Inkubation O / N bei 4 ° C mit den entsprechenden Sekundärantikörper in Permeabilisierung Lösung verdünnt.
  5. Nach der Inkubation mit sekundären Antikörpern, waschen Sie die Teile einmal mit 1x PBS für 15 min, gefolgt von DAPI-Färbung für 10 min.
  6. 3 mal mit 1x PBS Waschen Sie die Teile für 15 min je und übertragen auf Objektträger. Fügen ImmunoMount und sanft legen Sie eine Deckglas Sektionen. Trocknen Sie die Dias O / N bei 4 ° C und seal mit Nagellack.
    HINWEIS: Halten Sie die Folien immer bei 4 ° C.
    1. Analysieren Sie die Schnittkulturen durch konfokale Mikroskopie (Abbildung 1E).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Ablation des Transkriptionsfaktors BCL11B verursacht die Beeinträchtigung der Vorläuferzellproliferation und neuronalen Differenzierung, was zu einer reduzierten Gyrus dentatus Größe und die Zellzahl. Darüber mutierten Neuronen nicht in die Hippocampus-Schaltung verursacht Lern- und Gedächtnisstörungen 8 zu integrieren. Um Fragen bezüglich der regulatorischen Mechanismus (n) des BCL11B in diesen Prozessen ex utero Elektroporation beschäftigt war zu beantworten.

Antworten ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Der Hippocampus hat eine wichtige Funktion bei Lernen und Gedächtnis. Gyrus dentatus ist auch einer der beiden Hirnregionen, wo die Neurogenese tritt nicht nur während der Entwicklung, sondern auch im Erwachsenenalter. Die postnatale und adulte Neurogenese erfolgt in ähnlicher Weise mit vielen Gemeinsamkeiten. Definition der Regulierungsmechanismen dieser Faktoren wird sehr hilfreich für das Verständnis neurodegenerativer Erkrankungen, die wiederum zu neuen Therapien und präventive Maßnahmen zu führen. Um diese Informat...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Deutschen Forschungsgemeinschaft an SB unterstützt (BR-2215; SFB 497/A9).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Flaming/ Brauner MikropipettenabzieherSutter Instruments Company (USA)P-97
FeinglaspipettenWarnerInstruments G100F-4
MikroschleiferNarishige, JapanEG-44
AnästhesiehalterungHarvard ApparatPY2 34-0412
Halovet VaporizerHarvard ApparatPY2 34-0398
Fluovac SystemHarvard ApparatPY2 34-0387
IMS FluosorberHarvard ApparatPY2 34-0415
AnästhesiekammerHarvard ApparatPY2 34-0460
ElektroporatorBEX CompanyCUY21 EDIT
Pinzette mit ScheibenelektrodenBEX FirmaLF650P33 mm Elektroden für E15.5
Pinzette mit ScheibenelektrodenBEX CompanyLF650P55 mm Elektroden für E18.5
Picospritzer IIIParker Hannifin CorporationP/N 052-0500-900
HM 650 V Vibrationsklingenmikrotom, 230 VThermo Scientific920120
PräpariermikroskopCarl Zeiss Microscopy GmbhStemi SV8
Inverses MikroskopLeicaLeica DM IL LED
Konfokales MikroskopLeicaSp5II
6-Well-SchaleBD Falcon#353502
6-Well-Dish-CELLSTAR#657160
Gewebekultur-EinsätzeBD Falcon#353090
Fast GreenSigmaF7252
LamininSigma
Poly-L-LysinSigma#P5899
FederschereFine Science Tools15003-08
Extra Fine Bonn SchereFine Science Tools14084-08
PinzetteDumont #5511255-20 Inox
HBSS 10xLife Technology14180-046
BMELife TechnologyArtikel-Nr.: 41010-26
#L2020

Referenzen

  1. Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).
  2. Frotscher, M., Zhao, S., Forster, E. Development of cell and fiber layers in the dentate gyrus. Prog Brain Res. 163, 133-142 (2007).
  3. Muramatsu, R., Ikegaya, Y., Matsuki, N., Koyama, R. Neonatally born granule cells numerically dominate adult mice dentate gyrus. Neuroscience. 148, 593-598 (2007).
  4. Li, G., Pleasure, S. J. Morphogenesis of the dentate gyrus: what we are learning from mouse mutants. Dev Neurosci. 27, 93-99 (2005).
  5. Hsieh, J. Orchestrating transcriptional control of adult neurogenesis. Genes Dev. 26, 1010-1021 (2012).
  6. Li, G., Pleasure, S. J. Genetic regulation of dentate gyrus morphogenesis. Prog Brain Res. 163, 143-152 (2007).
  7. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).
  8. Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. Embo J. 31, 2922-2936 (2012).
  9. Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex. J Vis Exp. (88), (2014).
  10. Pacary, E., et al. Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation. J Vis Exp. (65), (2012).
  11. Hand, R., et al. Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex. Neuron. 48, 45-62 (2005).
  12. Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development. Sci STKE. (136), 19(2002).
  13. Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. J Vis Exp. (2), (2007).
  14. Sugiyama, T., Osumi, N., Katsuyama, Y. The germinal matrices in the developing dentate gyrus are composed of neuronal progenitors at distinct differentiation stages. Dev Dyn. 242, 1442-1453 (2013).
  15. Lechler, T., Fuchs, E. Desmoplakin: an unexpected regulator of microtubule organization in the epidermis. J Cell Biol. 176, 147-154 (2007).
  16. Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development. J Vis Exp. (74), (2013).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Weitere Artikel entdecken

Gyrus dentatus-TargetingKonfokalmikroskopieimmunfluoreszenzbasierte FärbungVibratomschnitttechnikAgarose-EinbettungSchnittkulturmediumprimäre Antikörper
Ex Utero Elektroporation und Organotypischen Kultur der Maus Hippocampus-Gewebe
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.