Ein Hydrogel Konstruieren und Fibrin-basierte Kleber Umgangs Therapeutics in einem murinen Myokardinfarkt Modell liefern.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zielt darauf ab, die Einschränkung der schlechten Zelltransplantation für die Stammzellbehandlung von Myokardinfarkten durch die Verwendung eines Hydrogelsystems und eines Fibrin-basierten Klebstoffs zu mildern. Mit diesem Ansatz kann der Zell-zu-Gewebe-Kontakt nach dem Infarkt aufrechterhalten werden, wodurch das therapeutische Potenzial von nützlichen Wirkstoffen an der Verletzungsstelle erhöht wird.

Zusammenfassung

Das murine MI-Modell ist im Bereich der Herz-Kreislauf-Erkrankungen weithin anerkannt und wurde immer wieder als erster Schritt verwendet, um die Wirksamkeit von Behandlungen in vivo^{zu testen 1}. Das traditionelle, etablierte Protokoll wurde weiter verfeinert, um den Schaden für das Tier zu minimieren. Bemerkenswert ist, dass die Brustmuskelschichten weggerissen und nicht einfach durchtrennt werden, und die Thorakotomie interkostal angegangen wird, anstatt die Rippen bei einer Sternotomie zu brechen, wodurch die Integrität des Brustkorbs erhalten bleibt. Mit diesen Veränderungen wird der Gesamtstress für das Tier verringert.

Stammzelltherapien, die darauf abzielen, die durch MIs verursachten Schäden zu lindern, haben sich im Laufe der Jahre aufgrund ihrer pro-angiogenen und anti-apoptotischen Vorteile als vielversprechend erwiesen. Derzeitige Ansätze zur Abgabe von Zellen an die Herzoberfläche beinhalten typischerweise die Injektion der Zellen entweder in der Nähe der geschädigten Stelle, in einer Koronararterie oder in den peripheren Blutkreislauf^2-4. Während sich die Zellen als Heimat des geschädigten Myokards erwiesen haben, ist die Funktionalität durch ihre schlechte Transplantation an der Verletzungsstelle eingeschränkt, was zu einer Diffusion in den Blutkreislauf führt⁵. Dieses Manuskript hebt ein Verfahren hervor, das dieses Hindernis mit der Verwendung eines zellverkapselten Hydrogelpflasters überwindet. Das Pflaster wird vor dem chirurgischen Eingriff hergestellt und unmittelbar nach dem Verschluss der linken Koronararterie auf das verletzte Myokard gelegt. Um das Pflaster an Ort und Stelle zu kleben, wird biokompatibler externer Fibrinkleber direkt auf das Pflaster aufgetragen, damit er sowohl auf dem Pflaster als auch auf der Herzoberfläche trocknen kann. Dieser Ansatz bietet eine neuartige Adhäsionsmethode für die Anwendung eines empfindlichen zellverkapselnden therapeutischen Konstrukts.

Einleitung

Einen Myokardinfarkt (MI) ist als die Unterbrechung des Blut zu einem Bereich des Herzens durch den Verschluss einer Koronararterie verursacht großen definiert. Der Schaden durch eine resultierende MI ist auf die Umgestaltung der lebensfähigen Herzgewebe in nichtfunktionelle Narbengewebe, das die Fähigkeit des Herzens, oder, genauer gesagt, die linke Herzkammer, um richtig zu schlagen abnimmt. Dies führt zu einer Abnahme des Volumens an Blut, die auf den Körper mit jedem Herzschlag, wie das Hubvolumen bekannt, und der Prozentsatz von Blut, das mit jedem Herzschlag aus dem Herzen gepumpt wird, da die Auswurffraktion ⁶ bekannt geliefert werden kann. Diese, zusammen mit anderen Funktionen vermindert, erhöht sich die Belastung für den Rest des Herzens, um eine angemessene Funktion aufrecht zu erhalten. Oft kann diese erhöhte Belastung so schwerwiegend werden, dass sie einen zweiten Herzinfarkt, ein Phänomen, bei etwa 10% der Individuen ⁷ ersichtlich bewirkt.

Während Arztpraxen entwickelt haben, um zu behandeln,Unmittelbar nach einem MI hat keine Technik entwickelt, um anzuhalten, langsam, oder umgekehrt die negativen Nebenwirkungen der Gewebeumbau. Stammzelltherapien als mögliche Weg für eine solche Behandlung trotz ihrer vielversprechendes Potential sich jedoch gezeigt, wurden Stammzellen in der Klinik nicht bewährt. Eine Theorie für ihre Mängel ist die Unfähigkeit, zu gewährleisten, die positiven Zellen an der Stelle des Infarkts lang genug, um gute Ergebnisse zu erzeugen ⁵ bleibt. Es hat sich gezeigt, dass nicht mehr als 24% der Zellen, die einfach in der Stelle des Infarkts injiziert lebten und blieb an der beschädigten Stelle 1 Tag nach der Lieferung ^2. Eine mögliche Perspektive für Lösung dieses Problems der Zellrückhaltung ist es, biokompatibles Hydrogel-Systeme, die entweder Zellen oder Therapeutika, die mit dem geschädigten Ort geliefert werden kann kapseln zu entwickeln. Hydrogel nach Wahl in diesem Protokoll ist ein Poly (ethylenglycol) dimethacrylat aufgrund seiner vorherigen Verwendung in Zellverkapselung procedures jedoch jede Hydrogels fähig Verkapselung ⁸ verwendet werden. Die Lieferung der Patch direkt an der Stelle der Verletzung gewährleistet Zell-Gewebekontakt über einen längeren Zeitraum, was die Länge der Zeit, die Zellen begünstigende Faktoren an der darunterliegenden Myokard bereitzustellen.

Ein Hindernis für den Patch-Ansatz ist die Schwierigkeit des Anklebens des Pflasters auf der Herzoberfläche. Viele Gruppen haben dies durch eine Vielzahl von Techniken, die am häufigsten als eine einfache Naht, um das Konstrukt zur Herzoberfläche ^9,10 binden überwinden. Dies wurde in einer Reihe von Fällen, in denen das Konstrukt aus einem steiferen Material hergestellt als erfolgreich erwiesen, aber nicht, wenn sie auf einem Hydrogel-System versucht, aufgrund der hohen Wasserkonzentration und empfindliche Natur der Patch-Konstrukt. Um dies zu überwinden, haben wir ein Fibrinkleber äußere Klebersystem, das die Chemie der Gerinnselbildung verwendet nachahmt. Fibrinkleber wurde in zahlreichen Arztpraxen eingesetzt, including dura Tränen Bronchusfisteln und Hornhauttransplantation, Hervorhebung der Biokompatibilität des Produkts als ein Wunddichtungsmittel ^11-13. Zusätzlich hat Fibrin für eine Vielzahl von kardialen Zwecke, einschließlich der chirurgischen Behandlung der linksventrikulären Brüche und koronaren Bypass-Operationen, wird jedoch seine Verwendung als Haftklebstoff für einen Herz Patch nicht gebräuchlich ^14-17 verwendet. Eine einfache Formulierung von Thrombin und Fibrinogen Ergebnisse in einem biokompatiblen Klebstoff, der direkt auf der Außenseite einer äußeren Herz Pflaster platziert werden kann, wodurch eine lebensfähige Haftsystem Patch Herz Interaktion gewährleisten.

Protokoll

Vorgehensweise ist in die volle Kompatibilität mit IACUC Protokollnummer 13302 und wurde von der Abteilung von Tier Ressourcen genehmigt.

1. Instrumentenaufbereitung

1. Autoklaven alle Nicht-Einweginstrumente vor dem chirurgischen Verfahren verwendet werden, um Sterilität zu gewährleisten.
2. Sterilisieren Instrumente mehrfach in einer Session mit einer Glasperle Sterilisator zwischen den Anwendungen verwendet.

2. Hydrogelpräparat

1. Auftauen und Platte Stammzellen mindestens 24 Stunden vor der Erstellung des Hydrogels Konstrukt.
2. Vorbereitung Patches einen Tag vor dem chirurgischen Eingriff unter Verwendung eines Stereolithographievorrichtung (oder ein ähnliches Instrument), welches in allen Einzelheiten in früheren Publikationen ^8,18 beschrieben wurde.
3. Um das Hydrogel zu erstellen, zuerst einen Computer Aided Design (CAD) Modell des gewünschten Patches erzeugen und exportieren Sie das Design an Stereolithographie Format (STL).
4. Erstellen Sie eine pre-Gel-Lösung durch dissolving Poly (ethylenglycol) dimethacrylat (PEGDMA) in sterile 1x PBS, um eine 20% w / v-Lösung zu erhalten. Gleichzeitig lösen sich die Photoinitiator 1- [4- (2-hydroxy- ethoxy) phenyl] -2-hydroxy-2-methyl-1-propan-1-on in DMSO. Fügen den Photoinitiator zu dem PEGDMA Lösung bei einem End w / v von 0,5%. Direkt vor der Vernetzung, werden 100 ml der gewünschten Dichte der Zellen. Hinweis: eine Zelldichte zwischen 2,0 x 10 ⁵ -2.0 x 10 ⁶ Zellen / ml empfohlen.
5. Pipettieren Sie die Pre-Gel-Lösung in eine Schale in der Mitte des SLA-Plattform und führen Sie die SLA-Software mit dem zuvor hochgeladenen STL formatiert Design.
6. Entfernen Sie die Flecken aus der Vorrichtung und inkubieren der Hydrogele O / N in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 5% fötalem Rinderserum (FBS), 100 U / ml Penicillin und 100 mg / ml Streptomycin, damit für die Zellen zu justieren an die Umgebung im Pflaster.

3. Vorbereitung der Tiere und Oral intubatiauf

1. Beurteilen Sie jede Maus vor dem Verfahren, um sicherzustellen, dass das Tier in guter Gesundheit, wie aus ihrer Pflege Gewohnheiten und Interaktionen mit ihren Käfiggenossen bestimmt. Anmerkung: Weiblich 8-10 Wochen alte C57BL / 6J-Mäusen wurden für dieses Verfahren verwendet wird, jedoch jede Maus Alter oder der Art verwendet werden kann.
2. Zeigen die Tiere in einem Narkosekammer und setzen auf 5% Isofluran mit einem 1 l / min O ₂ Unterstützung. Überwachen Sie das Niveau der Anästhesie durch toe Prise Reflex.
3. Sobald das Tier richtig betäubt wird, wiegen und legen sie auf die Intubation Ständer.
4. Leiten eine Lichtquelle in Richtung Brustkorb des Tieres und verwenden Pinzette, um den Kehlkopf-Oberfläche zurückziehen und setzen die Stimmbänder. Sorgfältig führen eine 20 G Angiocath zwischen den Stimmbändern und reibungslos in die Trachea einzuführen. Erkennen die richtige Einsetzen durch eine mechanische Bewegung des Brustkorbs, wenn der Katheter mit dem Kleintierbeatmungsgerät angeschlossen.
5. Passen Beatmungseinstellungen zu the Gewicht des Tieres anhand von Richtlinien des Herstellers.
6. Sobald intubiert, legen Sie das Tier in Rückenlage auf einem Heizkissen, um Unterkühlung zu verhindern. Sicherzustellen, daß die Heizmatte nicht über 40 ° C nicht überschreiten. Falls erforderlich, stellen eine Barriere zwischen dem Tier und dem Heizkissen, um die Möglichkeit von Verbrennungen zu minimieren.
7. Entfernen Haare von der Operationsstelle durch die Verwendung einer Enthaarungscreme. Sterilisieren Sie die Website von 3 Wechsel scheuert von Betadin und 75% Ethanol, um die ordnungsgemäße Sterilisation gewährleistet. Legen Sie ein Tuch, um nur die Operationsstelle freizulegen, und legen Sie vet Salbe auf die Augen bis zur Trockenheit während des Verfahrens zu verhindern.

4. Chirurgische Verfahren

1. Der Thorakotomie auf der linken Seite des Tieres durchgeführt wird, erschweren daher einen Hautschnitt von ungefähr 1 cm auf der linken Seite des Brustbeins, die die Länge des Brustbeins verläuft.
2. Verwenden einer Pinzette, um die Muskelschicht von der darunter liegenden Brustkorb in zwei Schritten zu trennen. Beachten Sie eine delinetriebs Linie, die die großen Brustmuskulatur des Tieres darstellt. Heben Sie diesen Muskel leicht, trennen sie von der zugrunde liegenden Äußerer Schrägmuskel und zurückzuziehen medial. Dann befreien den Äußerer Schrägmuskel von der darunter liegenden Brustkorb in der gleichen Weise, und zurückzuziehen seitlich und bietet einen ungehinderten Blick von der zweiten, dritten und vierten Rippen.
3. Führen Sie die Thorakotomie zwischen der dritten und vierten Rippen. Heben Sie die vierte Rippe und verwenden Sie ein Ausbrenner, um den Brustraum zwischen der dritten und vierten Rippen zu öffnen. Zeigen Wundhaken, um den Hohlraum weiter zu öffnen und setzen die Herzen.
4. Verwenden einer Pinzette, um die dünne Perikard des Herzens brechen.
5. Ligieren der linken Koronararterie mit einem 8-0-Monofilament-Nylonnaht. Platzieren der Naht etwa 4 mm von der Spitze des Herzens, befindet sich direkt unterhalb der unteren Spitze des linken Atriums. Bestimmen richtige Nahtplatzierung durch einen Blanchieren des ventrikulären Myokards und eine Zunahme der Grße des linken Vorhofs nach Suture wurde gebunden.

5. Patch-Placement und Kleber

1. Halten Patches bei 37 ° C und 5% CO ₂ Bedingungen bis zur Verwendung.
2. Heben Sie den Patch mit einem flachen ended Spachtel und legen Sie sie vorsichtig auf der Oberfläche des Herzens, an der Stelle des Infarkts.
   Hinweis: Um ein Abrutschen der linken Herzkammer zu verhindern, kann der Patch an Ort und Stelle durch leichtes ständig in Kontakt entweder mit dem Spachtel oder die Spitze einer Pinzette gehalten werden.
3. Vorbereitung des Klebers durch Mischen eines 4: 1-Verhältnis von Fibrinogen zu Thrombin. Mische die Lösung durch wiederholtes Pipettieren, bis es zu verdicken beginnt, in der Regel innerhalb von 1 min nach dem Beginn der Zubereitung.
4. Sobald die Viskosität der Lösung das gewünschte Niveau erreicht, etwa 10 ml schnell auf die Patch-Oberfläche zu übertragen. Anmerkung: Die Gerinnungszeit des Fibrinklebers schnell ist, die eine kleine Zeitfenster für eine effiziente Übertragung des Klebers.

6. Naht

1. Führen Sie alle Schließnähte mit einem 6-0 Monofilament-Nylonnaht.
2. Schließen Sie die Rippenschicht drei bis vier Einzelknopfnähten.
3. Vor der vollständigen Schließung der Zwischenrippenschicht, legen Sie eine PE-10-Kanüle in den Einschnitt, den Brustraum zu evakuieren nach dem Schließen und Wiederherstellung abgeschlossen ist richtige intrapleural Druck.
4. Schließen Sie die Brustmuskeln drei bis vier Einzelknopfnähten.
5. Verschließen Sie die Hautschicht mit einer fortlaufenden Naht.
6. Nach Vollsperrung, legen Sie eine 1,0 ml Spritze mit dem Ende der Kanüle und es verwenden, um den Brustkorb zu evakuieren.
7. Tragen Sie eine Gewebekleber auf der Einschnittstelle, um die Naht Ort zu verstärken.

7. Post-operative Behandlung

1. Geben Mäuse eine Injektion von Buprenorphin (0,05 bis 1,0 mg / kg) und Carprofen (2,2 mg / kg) subkutan unmittelbar nach dem Koronarligatur und mindestens 20 Minuten vor der Wiederbelebung. Beide Medikamente verabreichen 6-8 Stunden nach der Operation, Und geben Sie dann zweimal täglich für bis zu drei Tage, um Schmerzen und Leiden zu kontrollieren.
2. Die Tiere bis zum bewussten und jede Stunde für den ersten 4 Stunden nach der Operation zu überwachen. Führen Sie eine zweite Überprüfung der Nacht nach der Operation (2-4 Stunden später), um eine zweite Dosis Analgetikum zu verabreichen.
3. Überwachen Sie die Tiere täglich nach dem zweiten Tag nach dem Eingriff, bis Tieren stabil erscheinen.

8. Analyse der Herzfunktion und Histologie

1. Führen Echokardiographen auf den Mäusen 4 Wochen nach dem Eingriff, um das Ausmaß der Schäden nach dem MI bestimmen.
2. Betäuben Mäusen mit 4-5% Isofluran in einer Narkose Kammer für die Induktion der Inhalationsnarkose, und dann 2% Isofluran via Gesichtsmaske zur Aufrechterhaltung der Narkose.
3. Deaktivieren Sie den Imaging-Bereich mit einer Enthaarungscreme und verwenden Sie ein kleines Tier Ultraschall, um eine 2D-M-Mode-Echokardiographie Scan des schlagenden Herzens zu erhalten, und notieren Sie die Funktionsparameter assomit ihm abgeschrieben.
4. Euthanize die Mäuse in einer Kohlendioxidkammer, dann sammeln die Herzen von den Tieren und in eine 10% Formalin-Lösung für 24 Stunden. Nach 24 Stunden übertragen, die Herzen zu 70% Ethanol und halten bei 4 ° C bis zur Gewebeverarbeitung.
5. Verarbeiten Sie die Herzen und betten sie in Paraffinblöcken.
6. 5 mm geschnitten Schnitte durch den ventrikulären Bereich des Herzens, beginnend an der Spitze beginnt und am Atrium.
7. Stain geschnittene Scheiben sowohl mit Massons Trichrom und Hämatoxylin und Eosin-Färbung unter Verwendung von Standardprotokollen.

Ergebnisse

Während des chirurgischen Eingriffs, kann die Ligation der linken Koronararterie durch eine deutliche Blanc stromab der verschlossenen Arterie identifiziert werden. Als Test vor den Bund fürs Leben, kann die Naht kurz angezogen, um zu überprüfen, ob es an der entsprechenden Stelle ist werden. Zusätzlich kann, da Okklusion der Arterie fast sofortige Abnahme der Fähigkeit des linken Atriums, um richtig zu schlagen, das linke Atrium wird in Reaktion auf einen Rückfluss des Blutes in dem System zu vergrößern.

Diskussion

Mit diesem Ansatz konnte murinen MI-Modell haben wir ein System, das die Schädigung von Nicht-Myokard Bereichen, die mit anderen murinen MI Techniken verbunden werden minimiert entwickelt. Diese Bereiche umfassen Schädigung durch eine Tracheostomie verursacht, das Schneiden der Muskelschicht, und das Brechen der Rippen, um die Brusthöhle freizulegen. Wir glauben, dass diese Änderungen zur Verbesserung der allgemeinen Operationsergebnis durch die Sorgfalt, so viel v...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Harvard Modell 687 Maus Beatmungsgerät	Harvard Apparat	55-0001
Inintech Biosciences LLC Trockener Glasperlensterilisator	Fisher Scientific	NC9531961
Leica MZ6 Operationsmikroskop	Leica
Cautery Kit	Gemini	GEM 5917
Zarte Pinzette - 0,4 mm Spitzen abgewinkelte	Feinmechanikwerkzeuge	11063-07
Agricola Retraktor - 3,5 cm Spread	Fine Science Tools	17005-04
Federschere - 2,5 mm Klingen Gerade	Fine Science Tools	15000-08
Castroviejo Nadelhalter - mit Schloss Wolframkarbid 14 cm	Fine Science Tools	12565-14
Iris Schere - Zart Gerade 10,5 cm	Fine Science Tools	14060-10
8-0 monofiles Nahtmaterial	Ethicon	8730P
6-0 Seidennaht	Ethicon	639G
Thrombin	Sigma	T7009
Fibrinogen	Sigma	F3879
Vetbond Gewebekleber	3M	1469SB