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Methodenartikel

Lymphocyte Isolierung von menschlicher Haut für phänotypische Analyse und

14.3K Ansichten

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DOI:

10.3791/52564

⸱

8. April 2016

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Medical Immunology, Department of Laboratory Medicine, Radboud University Medical Centre, 2Department of Dermatology, Radboud University Medical Centre

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll zur effizienten Isolierung von hautresidenten T-Zellen aus menschlichen Hautbiopsien. Dieses Protokoll liefert eine ausreichende Anzahl lebensfähiger Lymphozyten in der menschlichen Haut für die durchflusszytometrische Analyse und die Ex-vivo-Kultur.

Zusammenfassung

Die menschliche Haut hat eine wichtige Barrierefunktion und enthält verschiedene Immunzellen, die zu Gewebshomöostase und Schutz vor Krankheitserregern beitragen. Da die Haut für den Zugriff relativ einfach ist, bietet es eine ideale Plattform peripheren Immunregulationsmechanismen zu untersuchen. Immun-residenten Zellen in gesunde Haut Verhalten immunosurveillance, sondern spielen auch eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von entzündlichen Hauterkrankungen wie Psoriasis. Trotz Schwellen Einsichten, unser Verständnis der Biologie verschiedenen entzündlichen Hauterkrankungen zugrunde liegen noch begrenzt. Es besteht ein Bedarf für eine gute Qualität (single) Zellpopulationen aus biopsiert Hautproben isoliert. Bisher Isolierungsverfahren wurden durch einen Mangel an Erhalten einer ausreichenden Anzahl von lebensfähigen Zellen ernsthaft behindert. Isolierung und die anschließende Analyse wurden auch durch den Verlust der Immunzelllinie Marker, aufgrund der mechanischen und chemischen Beanspruchung durch die aktuellen Dissoziation Verfahren betroffen zu erhaltenEinzelzellsuspension. Hier beschreiben wir eine modifizierte Methode von T-Zellen zu isolieren, sowohl gesunde und engagierte psoriatischer menschliche Haut durch mechanische Haut Dissoziation Kombination eines automatisierten Gewebe Dissociator und Kollagenase Behandlung. Diese Methodik bewahrt Expression der meisten Immun Linie Marker wie CD4, CD8, Foxp3 und CD11c auf die Herstellung von Einzelzellsuspensionen. Beispiele für erfolgreiche CD4 + T - Zell - Isolierung und anschließende phänotypische und funktionelle Analyse gezeigt.

Einleitung

Die Haut, als primäre Schnittstelle zwischen dem Körper und der Umgebung, bietet die erste Verteidigungslinie gegen äußere physikalische, chemische und biologische Beleidigungen wie Verwundung, UV-Strahlung und Mikroorganismen. Haut besteht aus zwei Hauptfächer, die Epidermis und die Dermis, und enthält eine Vielzahl von Immunzellen einschließlich Langerhans'schen Zellen, Makrophagen, dendritischen Zellen (DCs) und etwa 20 Milliarden Gedächtnis - T - Zellen, fast doppelt so viele , die in der gesamten Blutvolumen 1 , 2. Eine wachsende Zahl von Daten unterstützt die Vorstellung, dass die Haut wesentliche immunologische Funktionen, sowohl während der Gewebehomöostase und in verschiedenen pathologischen Zuständen. Immunzellen mit Wohnsitz in normaler Haut sind gedacht immunosurveillance 3 zu leiten und haben eine Rolle bei der Entwicklung von entzündlichen Erkrankungen wie Psoriasis 4 zu spielen gezeigt. In psoriatischer läsionaler Haut, sowohl CD4 + und CD8 + T - Zellen infiltriert waren observed und es wurde gezeigt , dass das Verhältnis der CD4 und CD8 5 auf der Krankheitszustand variiert. Jedoch sind diese Populationen von Zellen schwierig zu studieren, weil bestehende Techniken, um die Isolierung von nur wenigen Zellen ermöglichen.

Die derzeit weit verbreiteten Techniken zur T-Zell-Isolierung aus der menschlichen Haut verbinden mechanische Haut Dissoziation mit enzymatische Behandlung. Menschliche Hautbiopsien werden in großem Umfang zerkleinert und inkubiert mit Enzymen wie Trypsin, Kollagenase und / oder EDTA 6-8. Bedenkt man, dass die Haut eine Barrieregewebe ist, die Zugkräfte und mechanische Disaggregation sehr widerstandsfähig ist, die etablierten Methoden der T Zellisolierung sehr wenige Zellen produziert und noch geringere Anzahl von lebensfähigen Zellen, die ex vivo Zellkultur dieser Zellpopulationen schwierig macht , und herausfordernd.

Hier berichten wir über eine modifizierte Methode zur Isolierung von Lymphozyten aus gesunden und beteiligt psoriatischer menschliche Haut durch mechan Kombinationsche Dissoziation der Haut eines automatisierten Gewebe Dissociator anstatt die etablierte Methode ausgiebig zerkleinern, zusammen mit enzymatische Verdauung mit Kollagenase verwenden. Verschiedene lebensfähige Immunzelluntergruppen einschließlich DCs und T-Zellen wurden nach der Herstellung einer Einzelzellsuspension beobachtet. Wichtig wurde die Expression der Oberflächenmarker CD3, CD4 und CD8 gut erhalten. So hergestellten Zellen, sind bereit für den Einsatz in Ex - vivo - Zellkulturen oder Durchflusszytometrie - Analyse. Dieses Protokoll wurde für die Analyse der einzelnen Hautbiopsien (4 mm), abgeleitet von fallener Haut von Psoriasis-Patienten erfolgreich eingesetzt. Die Ergebnisse zeigten , dass residente Haut Patienten T - Zellen mehr inflammatorische Zytokine wie IL-17 produziert und IFNy im Vergleich zu gesunden Probanden 9.

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Protokoll

HINWEIS: Hautbiopsien von gesunden Personen aus Bauchhaut Überbleibsel von Individuen erhalten wurden elektiven plastische Chirurgie nach mündlicher oder schriftlicher Einverständniserklärung für wissenschaftliche Zwecke. Die Verwendung menschlicher Haut wurde genehmigt und in Übereinstimmung mit den gesetzten Regeln von der medizinischen Ethikkommission für Humanforschung der Radboud University Medical Center, Nijmegen, Niederlande und Universität Essen, Deutschland.

1. Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus der menschlichen Haut (Work Sterile in einem Fluss Schrank wenn Nachfolgende Zellkultur ist erforderlich)

  1. Bereiten Zellkulturmedium: RPMI 1640 + Penicillin / Streptomycin (endgültige Konzentration 100 Einheiten / ml und 100 ug / ml, jeweils) + Pyruvat (0,02 mM) und Glutamax (0,02 mM) ohne Serum zugesetzt.
  2. Bereiten komplette Kulturmedium: Kulturmedium, hergestellt in Schritt 1.1 + 10% humanes Serumsammel (HPS); Lagerung bei 4 ° C. Bringen Medium auf 20 ° C ± 2 vor unsing.
  3. Besorgen Sie sich die Hautbiopsie eine 4mm lang Biopsie Punch Instrument und halten Sie es in RPMI1640 komplettem Kulturmedium bei 20 ° C ± 2 für bis zu 4 Stunden oder bei 4 ° C an. Verarbeiten Sie die Biopsie so schnell wie möglich bei der Ankunft im Labor.
    HINWEIS: Eine längere Lagerung der Haut wird die Zellausbeute und die Lebensfähigkeit der Zellen beeinflussen.
  4. Beschriften Sie eine blau-capped Dissoziation Rohr und mit 5 ml komplettem Kulturmedium in das markierte Rohr.
  5. 2 ml komplettem Kulturmedium in jede Vertiefung (insgesamt 3 wells) einer sterilen 6-well-Kulturplatte. Verwenden Sie sterile Werkzeuge, um die Biopsie in einem einzigen gut zu platzieren, spülen, verschieben Sie es zu einem zweiten weit über und wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal, also insgesamt drei Spülungen zu erreichen.
  6. Übertragen Sie die gut gespült Hautbiopsie in eine sterile Petrischale, 100 & mgr; l komplettem Kulturmedium auf der Oberseite der Biopsie und vorsichtig abkratzen das subkutane Fettgewebe mit einem Edelstahl-sterilen Einweg-Skalpell ab.
    HINWEIS: Thist, ist ein kritischer Schritt.
  7. Schneiden Sie jede Hautbiopsie in 4 kleinere Stücke auf einer sterilen Petrischale. Transfer-Proben (bis zu vier von 4 mm Biopsien pro Röhrchen) auf die vorbereitete Dissoziation Röhrchen mit 5 ml komplettem Kulturmedium.
  8. dicht schließen die Rohre mit der Kappe, und befestigen Sie den Kopf auf die Hülse des automatisierten Gewebe Dissociator. Stellen Sie sicher, dass alle Probenmaterial in dem Bereich des Rotors befindet.
  9. Starten Sie den Dissoziationsprozeß durch das "Programm m_spleen _01" läuft (ein vordefiniertes Programm zur Verfügung gestellt von den internen Speicher des Instruments oder durch die Begleitung Programmkarte), um die Biopsie bei der entsprechenden Drehzahl für 56 Sekunden zu distanzieren.
  10. Nach der Bearbeitung lösen sich von der Dissociator die Dissoziation Rohr und stellen Sie sicher, dass alle das dissoziierte Material am Boden des Rohres gesammelt wird.
  11. In 150 ul Kollagenase IA (80 mg / ml) in den Spaltrohr und Inkubation der Probe in einem geschüttelten Wasserbad bei 37° C für 60 min. 100 l DNase I (5 MU / ml) in thedissociation Rohr, gut mischen.
    Hinweis: Eine höhere Konzentration von Kollagenase oder längere Inkubationszeit wird die Lebensfähigkeit der Zellen zu verändern.
  12. Bringen Sie die Dissoziation Rohr an der Hülse des automatisierten Gewebe Dissociator und führen Sie das "Programm m_ Milz _01" die Biopsie ein weiteres Mal zu distanzieren.
  13. Legen Sie eine 70 & mgr; M Nylon Zelle Sieb auf der Spitze eines 50 ml-Falcon-Röhrchen. Anwenden dissoziierten Probenmaterialien auf diese Zellsieb Zellklumpen / Gewebereste zu entfernen.
  14. Waschen Zellsieb einmal mit 5 ml vollständigem Kulturmedium. Zentrifuge bei 20 ° C ± 2, 450 xg für 10 min und Überstand absaugen.
  15. Wiederholen Sie den Waschschritt ein weiteres Mal. Resuspendieren Zellpellets in 300 & mgr; l komplettem Kulturmedium. Einzelzellsuspensionen sind bereit für die weitere Analyse; weiterhin mit Protokollen für die ex vivo Zellkultur oder Zytometrie Analyse fließen.
  16. Bei weiteren intracellular Zytokinfärbung stimulieren Zellen mit PMA (12,5 ng / ml), Ionomycin (500 ng / ml) und Brefeldin A (5 ug / ml) für 4 h bei 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator für 4 Stunden vor dem Strömungsdurchführen Zytometrie Analyse.

2. polyklonalen Aktivierung der Haut-Einwohner - T - Zellen (ex vivo Zellkultur)

  1. Aliquot 100 ul Einzelzellsuspensionen (hergestellt in Schritt 1.15) in einen Rundboden-96-Well-Platte.
    HINWEIS: Für jede der 4 mm Hautbiopsie können die erfassten Einzelzellsuspensionen in mindestens zwei Vertiefungen einer 96-Well-Platte aufgeteilt.
  2. Hinzufügen anti-CD3 / anti-CD28 mAb-beschichteten Microbeads (25.000 Kügelchen pro Vertiefung), rekombinantes menschliches Cytokin rIL-2 (Endkonzentration 25 U / ml) und rIL-1β (ng / ml Konzentration 50 final).
  3. Decken Sie die Kulturplatte mit einem gut markierten Platte Deckel, Inkubation in 5% CO 2, 100% Luftfeuchtigkeit, 37 ° C Inkubator. Ändern Medium, wenn das Medium Farbe gelb wird.
    Hinweis: Eine klare Zellkolonie von Tag 8 der Zellkultur beobachtet werden können.

3. Durchflusszytometrie Analyse von Primär- / kultivierten Haut-Einwohner-T-Zellen

  1. Bereiten Sie FACS-Puffer: PBS + 0,2% BSA.
  2. Übertragen Zellen von Interesse in einer V-Boden 96-Well-Platte. Zentrifuge bei 20 ° C ± 2, 450 xg für 2 min und Überstand absaugen.
  3. Resuspendieren des Pellets in 100 ul PBS. Zentrifuge bei 20 ° C ± 2, 450 xg für 2 min und Überstand absaugen.
  4. Stain Zellen mit 100 & mgr; l präparierte eFluorescence780 konjugiert fixierbar Lebensfähigkeit Farbstoff (1: 1000 Verdünnung mit PBS) bei 4 ° C für 30 min. Füge 100 & mgr; l FACS-Puffer, Zentrifuge bei 20 ° C ± 2, 450 xg für 2 min und Überstand absaugen.
  5. Wählen Sie das gewünschte Zelloberflächenmarker mAb, zum Beispiel: CD45-BV421 (HI30, 1:20), CD3-ECD (UCHT1, 1:50), CD4-PC5.5 (1388,2, 1: 200), CD8-APC-AlexFluo700 (B9.11, 1: 400), CD14-FITC (TÜK4, 1:50), CD19-APC-AlexFluo750 (13-119, 1:50), CD56-PE (MEM-188, 1:50), CD25-PeCy7 (BC96, 1:50), CD11c-PeCy7 (BU15, 1:10), und CD1c-APC (AD5-8E7, die mAb-Mischung unter Verwendung von FACS-Puffer 1:10), bereiten nach jedem mAb Verdünnungsfaktor getestet. Definieren Gate-Einstellungen unter Verwendung von Isotyp-Kontrolle von Antikörper zusammen mit nicht-Fleck Probe.
  6. In 25 ul vorbereitet mAb-Mischung in jede Vertiefung. Inkubieren 20 min bei 20 ° C ± 2, vor Licht schützen.
  7. Füge 100 & mgr; l FACS-Puffer, Zentrifuge bei 20 ° C ± 2, 450 xg für 2 min und Überstand absaugen.
  8. Bei Proben, die nur Zeiloberflächenfärbung erfordern, weiter mit Schritt 3.16.
  9. Bei intrazellulären Foxp3-Färbung:
    1. Bereiten Fixierung und Permeabilisierung Puffer von einem Teil Konzentrat mit 3 Teilen Verdünnungsmittel zu mischen.
    2. Vorbereitung 1x Permeabilisierung Puffer: 1 Teil 10x Permeabilisierung Puffer + 9 Teile sterilisiert H 2 O.
  10. Resuspendieren Pellets in 100 ul Fixierung und Diffusionsratesation Puffer, mischen, und Inkubation bei 4 ° C für 30 min.
  11. 100 l Permeabilisierung Puffer in jede Vertiefung, Zentrifuge bei 450 × g bei RT für 2 min und absaugen Überstand.
  12. Wash-Zellen mit Permeabilisierung Puffer noch einmal.
  13. Wählen erforderlich intrazellulärem mAbs, beispielsweise Foxp3-eFluo450 (pCH101, 1:50), IL-17A-AlexFluo488 (eBio64DEC1, 1:50) und IFNy-PeCy7 (4S.B3, 1: 400). Bereiten Sie die mAbs Mischung Permeabilisierung Puffer mit 2% normalem Rattenserum nach jedem mAb Verdünnungsfaktor getestet. Definieren Gate-Einstellungen unter Verwendung von Isotyp-Kontrolle von Antikörper zusammen mit nicht-Fleck Probe.
  14. In 20 ul der vorbereiteten mAb-Mischung in jede Vertiefung. Inkubieren bei 4 ° C für 30 min, vor Licht zu schützen.
  15. Nach 30 min Inkubation in jede Vertiefung 100 ul Permeabilisierung Puffer hinzuzufügen. Zentrifuge bei 20 ° C ± 2, 450 xg für 2 min und Überstand absaugen.
  16. Wash-Zellen mit Permeabilisierung buffer ein weiteres Mal. Pellet in 110 & mgr; l FACS-Puffer und Transfer Zellsuspensionen in microFACS Rohr.
    HINWEIS: Probe ist bereit für die Messung mit 10-Farben-Durchflusszytometrie.
  17. Bei genaue Zellzahl erforderlich, fügen Sie 10 ul gut gemischten einheitliche Suspension von Fluorospheres in jeder Probe unmittelbar vor der Durchführung von Messungen mittels Durchflusszytometrie.

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Ergebnisse

Das Protokoll hier präsentiert wird Ausbeute zwischen 2200 ± 615 (Mittelwert ± SEM, Haut von gesunden Probanden) bis 178.000 ± 760 (Mittelwert ± SEM, fallener Haut von Psoriasis-Patienten) rentable Lymphozyten aus der menschlichen Haut, wenn eine einzelne 4 mm Hautbiopsie.

Verschiedene Arten von CD45 + Zellen wurden in Einzelzellsuspensionen identifiziert , die von der Haut von gesunden Personen einschließlich CD4 + T-Zellen (~ 45%), CD8 + T-Zellen (~ 30%) un...

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Diskussion

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur effizienten Haut resident T-Zellen aus menschlichen Hautbiopsien isolieren. Der Vorteil dieses Protokolls ist die Isolierung von relativ hohen Anzahl lebensfähiger Lymphozyten und relevante Oberflächenmarker exprimieren. Die Zell - Untergruppen identifiziert wurden , waren: CD11c + DCs, CD4 + und CD8 + T - Zellen und Foxp3 + CD25 + Zellen. Wichtig ist , dass Ex - vivo - Kultur der isolierten Haut resident T -...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Hautbiopsien von Patienten mit Psoriasis wurden freundlicherweise von Dr. Andreas Koerber (Dermatologie-Abteilung an der Universität Essen, Deutschland) nach mündlicher oder schriftlicher Einverständniserklärung für wissenschaftliche Zwecke zur Verfügung gestellt.

XH wird auch durch NSFC 61263039 und 11101321 NSFC unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Einweg-Biopsie-StanzeKai EuropeBP-40F4 mm
Sterile Einweg-SkalpelleDalhausen1100000510
gentleMACS C-RöhrchenMiltenyi Biotech130-093-237blauer Kappe, wird als Dissoziationsröhrchen verwendet.
gentleMACS DissoziatorMiltenyi Biotech130-093-235Automatisierter Gewebedissoziator. Verwendung des "Programms spleen_01" zur Dissoziation der Hautbiopsie.
Sieb für Zellen BD35235070 & Mikro; m Nylon
96-Well U-BodenplatteGreiner Bio-One650180
RPMI 1640Life Technologies22409-015
NatriumpyruvatLife Technologies11360-039
GlutaMAXLife Technologies35050-061
Penicillin/StreptomycinLife Technologies15140-122
Mensch Gepooltes Serum (HPS)hauseigene Herstellung
Kollagenase ISigma-AldrichC2674Typ 1-A, geeignet für Zellkulturen
DNase ICalbiochem260913
PBSB Braun3623140
BSASigma-AldrichA4503-500G
Fixierbarer Viabilitätsfarbstoff (FVD) APC-eFluo780eBioscience65-0865-18Abgestorbene Zellen vor der Zellfixierung färben; mit PBS im Verhältnis 1:1.000 verdünnen
Fixierungs-/PermeabilisierungskonzentrateBioscience00-5123-43
Fixierungs-/PermeabilisierungsverdünnungsmitteleBioscience00-5223-56
Permeabilisierungspuffer (10x)eBioscience00-8333-56
BV421 Maus Anti-Human-CD45BD563879Klon: HI30; Verdünnungsfaktor 1:50
FITC Maus anti-human CD14DakoT0844Klon: TUK4; Verdünnungsfaktor 1:50
PE Maus anti-human CD56DakoR7127Klon: MOC-1; Verdünnungsfaktor 1:50
ECD Maus anti-human CD3Beckman - CoulterA07748Klon: UCHT1; Verdünnungsfaktor 1:50 für Oberflächenfärbung; Verdünnungsfaktor 1:25 für intrazelluläre Färbung.
PC5.5 Maus anti-human CD4Beckman - CoulterB16491Klon: 13B8.2; Verdünnungsfaktor 1:200
PeCy7 Maus anti-human CD11cBeckman - CoulterA80249Klon: BU15; Verdünnungsfaktor 1:50
APC Maus anti-human CD1cMiltenyi Biotech130-090-903Klon: AD5-8E7; Verdünnungsfaktor 1:10
APC-AlexFluo700 Maus anti-human CD8Beckman - CoulterA66332Klon: B9.11; Verdünnungsfaktor 1:400
APC-AlexFluo750 Maus Anti-Mensch CD19Beckman - ScharA94681Klon: J3-119; Verdünnungsfaktor 1:50
PeCy7 Maus Anti-Mensch CD25eBioscienceAD5-8E7Klon: BC96; Verdünnungsfaktor 1:50
  PE Ratte Anti-Human-CLAMiltenyi Biotech130-091-635Klon: HECA-452; Verdünnungsfaktor 1:
eFluo450 Ratte Anti-Human-Foxp3eBIoscience48-4776-42Klon: PCH101; intrazelluläre Färbung; Verdünnungsfaktor 1:50
AlexFluo488 Maus Anti-Human-IL-17AeBioscience53-7179-42Klon: eBio64DEC17; intrazelluläre Färbung; Verdünnungsfaktor 1:50
PeCy7 Maus Anti-Human-IFNgeBioscience25-7319-41Klon: 4S. B3; intrazelluläre Färbung; Verdünnungsfaktor 1:400
Flow-Count FluorosphärenBeckman - Coulter7547053Counting beads, für die Durchflusszytometrie
Mit

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

HautbiopsieGewebedissoziationCollagenase BehandlungDurchflusszytometrieZellsiebZentrifugationFACS AnalyseEx vivo KulturImmunzellmarker
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