Methoden zur Charakterisierung des Co-Entwicklung von Biofilm und Habitat Heterogenität

Zusammenfassung

Biofilme haben komplexe Wechselwirkungen mit ihrer Umgebung. Um Biofilm-Umwelt-Wechselwirkungen umfassend zu untersuchen, stellen wir hier eine Reihe von Methoden vor, um eine heterogene chemische Umgebung für die Biofilmentwicklung zu schaffen, die lokale Strömungsgeschwindigkeit zu quantifizieren und den Stofftransport in und um Biofilmkolonien zu analysieren.

Zusammenfassung

Biofilme sind oberflächengebundenen mikrobiellen Gemeinschaften, die komplexe Strukturen aufweisen und signifikante räumliche Heterogenitäten. Biofilm Entwicklung wird stark von der umgebenden Strömung und Ernährungsumwelt geregelt. Biofilmwachstum steigt auch die Heterogenität der lokalen Mikroumgebung durch die Generierung komplexer Strömungsfelder und Stofftransport Mustern. Um die Entwicklung von Heterogenität in Biofilmen und Wechselwirkungen zwischen Biofilmen und ihre lokalen Mikrolebensraum zu untersuchen, wuchsen wir Mono-Arten Biofilme von Pseudomonas aeruginosa und Zwei-Spezies-Biofilmen von P. aeruginosa und Escherichia coli unter Ernährungs Gradienten in einer mikrofluidischen Flusszelle. Wir stellen ausführliche Protokolle für die Erstellung von Nährstoff Gradienten innerhalb der Flusszelle und zum Züchten und Visualisierung Biofilmentwicklung unter diesen Bedingungen. Wir weisen das Protokolle für eine Reihe von optischen Verfahren, um räumliche Muster in Biofilmstruktur Quantifizierung fließen distriträge über Biofilme und Massentransport um und in Biofilmkolonien. Diese Methoden unterstützen umfassende Untersuchungen der Co-Entwicklung von Biofilm und Habitatheterogenität.

Einleitung

Mikroorganismen auf Oberflächen befestigen und bilden Biofilme - Zellaggregate in einer extrazellulären-Polymermatrix ¹ umschlossen. Biofilme ganz anders verhalten als einzelne mikrobielle Zellen, da Biofilme dramatische räumliche Heterogenität aus einer Kombination von internen Stofftransportbeschränkungen und räumlichen Veränderungen im Zellstoffwechsel ^2,3 resultiert. Sauerstoff und Nährstoffkonzentration drastisch an der Grenzfläche zwischen den Biofilm und die umgebende Flüssigkeit und innerhalb der ^Biofilm-2 weiter abgereichert erhalten verringern. Räumliche Variationen Biofilm Atmung und Proteinsynthese kann auch als Reaktion auf die lokalisierten Sauerstoff und Nährstoffverfügbarkeit ² auftreten.

In Gewässern und Boden-Umgebungen, wohnen die meisten Bakterien in Biofilmen. Natürliche Biofilme die wichtigen biogeochemische Prozesse wie Radfahren Kohlenstoff und Stickstoff und reduzierende Metalle ^4,5. Klinisch ist die Bildung von Biofilmen responsIVK längere Lungen- und Harnwegsinfektionen ^6. Biofilm-assoziierten Infektionen sind sehr problematisch, weil Zellen in Biofilmen im Vergleich zu ihren Pendants Plankton ⁶ haben extrem hohe Resistenz gegen antimikrobielle Mittel. Da Biofilme sind in verschiedenen Einstellungen wichtig, ist ein wesentlicher Teil der Forschung auf das Verständnis der Umweltfaktoren, die Biofilm-Aktivitäten und die räumliche Heterogenität in Biofilmen und die umliegende Mikroumgebung steuern konzentriert.

Frühere Studien haben festgestellt, dass Biofilmentwicklung wird stark durch eine Reihe von Umweltfaktoren reguliert: Biofilme entwickeln unterschiedliche Morphologien unter unterschiedlichen Strömungsbedingungen; Sauerstoff- und Nährstoffverfügbarkeit Einfluss Biofilm Morphologie; und hydrodynamische Schubspannung wirkt sich auf die Befestigung der planktonischen Zellen auf Oberflächen und die Ablösung von Zellen von Biofilmen ^7-9. Darüber hinaus beeinflusst externen Strömungsbedingungen die Lieferung von Substraten into und in Biofilmen ^10. Das Wachstum von Biofilmen verändert auch umgebenden physikalischen und chemischen Bedingungen. Beispielsweise führt das Biofilmwachstum zu lokalen Verarmung an Sauerstoff und Nährstoffen, ^2; Biofilme akkumulieren anorganischen und organischen Verbindungen aus der Umgebung ^11; und Biofilm Cluster umleiten Flusses und Erhöhung der Oberflächenreibung ^12,13. Da Biofilme interagieren mit ihrer Umgebung auf sehr komplexe Weise, ist es entscheidend, um gleichzeitig Informationen über die Biofilmeigenschaften und Umgebungsbedingungen, und multidisziplinäre Ansätze müssen verwendet werden, um umfassend zu charakterisieren Biofilm-Umwelt-Interaktionen werden.

Hier stellen wir eine Reihe von integrierten Methoden räumliche Muster in mikrobiellen Wachstums innerhalb mono-Arten und Zwei-Spezies Biofilmen unter einem auferlegten Nahrungs Gradienten zu charakterisieren, und die resultierende Änderung der lokalen chemischen und Flüssigkeitsmikroumgebung zu beobachten. Wir Tannest beschreiben die Verwendung eines kürzlich entwickelten Doppeleinlaß mikrofluidischen Flusszelle, um die Biofilmwachstum unter definierten chemischen Gradienten zu beobachten. Dann zeigen die Verwendung dieser Mikrofluid-Durchflusszelle, um das Wachstum von zwei Arten von Bakterien, Pseudomonas aeruginosa und Escherichia coli, in Biofilmen unter verschiedenen Ernährungsbedingungen beobachten. Wir zeigen, wie in situ Visualisierung von fluoreszierenden Tracers Ausbreitung in Biofilmkolonien verwendet werden, um quantitativ zu erfassen Muster der Stofftransport in Biofilmen werden. Schließlich zeigen wir, wie Mikropartikelverfolgung Geschwindigkeitsmessung unter der konfokalen Mikroskopie durchgeführt wird, kann zur lokalen Strömungsfeld um den wachsenden Biofilmen zu erhalten.

Protokoll

1. Durchflusszelle einrichten und Inokulation

. HINWEIS: Verwenden Sie ein im Song et al Doppeleinlass mikrofluidischen Durchflusszelle, 2014 ^14, Biofilme wachsen. Diese Durchflusszelle ist in der Lage, gut definierte glatte chemische Gradienten erstellen. Die Durchflusszelle ist in Abbildung 1 unter Verwendung von P. gezeigt und Durchflusszellenherstellung wurde zuvor in Song et al., 2014 ^14. Hier werden wir ausführlich unsere Methoden aeruginosa und E. coli, Biofilme zu bilden, aber andere Arten können geeignet zu sein. Wir verwendeten P. aeruginosa PAO1- gfp, die konstitutiv exprimiert ein grün fluoreszierendes Protein (GFP), als Modellorganismus für die Biofilmentwicklung. E. Zusätzlich verwendeten wir coli DH5a zu Mischarten Biofilmen mit P. bilden aeruginosa. P. aeruginosa und E. coli-Stämme wurden auf LB-Agar-Platten gezüchtet.

1. Bereiten Sie die Durchflusszelle mit Polydimethylsiloxan (PDMS) gebunden an einDeckglas über Sauerstoffplasmabehandlung, wie in ¹⁴ beschrieben. Die Abmessungen der Strömungszellenkammer sind 23 mm × 13 mm × 0,24 mm (Länge x Breite x Tiefe).
2. Bereiten geändert FAB Wachstumsmedium ^15. Um Biofilmwachstum unter einer Nahrungsgefälle innerhalb der Durchflusszelle zu beobachten, stellen modifizierte FAB Medium ¹⁵ mit 0,6 uM Glucose in einem Einlass und FAB Medium einzuführen ohne Kohlenstoffquelle durch die andere Einlass. Filter sterilisieren (Porengröße = 0,2 um) der Glucosestammlösung (60 mM), bevor Sie die Ware in den FAB Medium. Auch Autoklavieren den FAB-Medium mit dem Zyklus 1 (Flüssigkeit, 15 min, 121 ° C, 17 psi) vor dem Gebrauch.
3. Sterilisieren Sie die Durchflusssystem. Vor der Beimpfung autoklaviert den gesamten Strömungsweg (mittel Flaschen, Schläuche, Luftblasenfallen, Durchflusszellen) mit Zyklus 1, mit Ausnahme der Kunststoffdreiwegeventile (Einweg- und vorsterilisiert) stromaufwärts von der Strömungszelle angeordnet ist. (Drei-Wege Ventile zum Einspritzen Zelle c verwendet,ultur, fluoreszierender Tracer und Mikrokügelchen.) Um eine Kontamination während der Montage zu vermeiden, decken alle Schläuche und Anschlussöffnungen mit Aluminiumfolie oder Autoklav Beutel vor dem Autoklavieren.
4. Schließen Sie das Stromsystem. Montieren Sie die Komponenten des Durchflusszellensystem sorgfältig (siehe Video zum Flusssystem Montage) und liefern Wachstumsmedium, um die Durchflusszelle über eine peristaltische Pumpe, die exakt den Durchfluss steuert.
5. Vorbereitung der Zellkultur zur Beimpfung durch Übertragen einer Kolonie von P. aeruginosa oder E. coli von LB-Platten zu 3 ml LB-Brühe, und schütteln Sie die Kultur O / N bei 225 rpm und 37 ° C. Verdünne die O / N-Zellkulturen in 1 ml sterilisiertem Wasser auf eine endgültige OD ₆₀₀ = 0,01 als Inokulum. (Kultur und verdünnen die Bakterien in einer Steril um Verunreinigungen zu vermeiden.)
6. Für die Versuche mit gemischten Spezies Biofilmen, verdünnt den zwei Bakterienkulturen mit einem Verhältnis von 1: 1 in 1 ml mit einer äquivalenten OD ₆₀₀ = 0,01 für jedes Bakterium.
7. Impfen Sie die Durchflusszelle. Injizieren 1 ml des Inokulums zu der Strömungszelleneingang von dem Dreiwegeventil. Nach der Injektion unterbrechen den Fluss für 1 Stunde, damit der Bakterienzelle an das Deckglas zu befestigen. (Stellen Sie sicher, dass die Durchflusszelle mit der Deckseite nach unten, damit suspendierten Zellen, um auf dem Deckglas absetzen gestellt.)
8. Nach 1 Stunde wieder die Strömung und die Pumpe des Wachstumsmediums, um die Durchflusszelle mit einer konstanten Geschwindigkeit von 0,03 ml / min für jeden Einlaß für 3 Tage.

2. Charakterisierung von Biofilm-Entwicklung in Reaktion auf Nährstofffarbverläufe Mit konfokale Mikroskopie

HINWEIS: P. aeruginosa mit konstitutiv exprimierten GFP abgebildet werden, aber E. coli in Mischarten Biofilme müssen durch Gegenfärbung abgebildet werden.

1. Beachten Sie die 3-Tages-Biofilmen mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. Für die repräsentative Ergebnisse, beachten Biofilmen mit einem konfokalen Mikroskop mit 63X Ziel. Vor der Bildgebung, Markedas Doppel-Einlassströmungszelle mit einem Raster auf dem Deckglas Seite. (Der Zweck dieser Gitter ist es, dass der Experimentator die Abbildungsbereiche in dem Strömungszellenkammer zu lokalisieren.)
2. Zur Gegenfärbung, verdünnte 10 ul zelldurchdringenden rot fluoreszierenden Nukleinsäurefarbstoff, wie grün fluoreszierenden Nukleinsäurefarbstoff wie STYO 62 Stammlösung (1 mM) in 990 ul sterilisiertes Wasser und dann langsam zu injizieren die verdünnte Fleck mit einer Spritze in die Durchflusszelle Kammer von dem stromaufwärts Dreiwegeventil. Halten Sie die Durchflusszelle stagniert und im Dunkeln für 30 Minuten, dann wieder den Fluss für 15 Minuten Auswaschen der ungebundenen Fleck.
3. Führen konfokale Bildgebung. Aktivieren Sie die 488-nm-Argon-Laser für die Anregung und die Emission Sammelkanäle für GFP (500-535 nm) und Nukleinsäurefarbstoff (für grün fluoreszierenden Nukleinsäurefarbstoff, 650 bis 750 nm). Passen Gewinne und Offsets für beide Kanäle zu hell und sauber Bilder haben. Wählen xyz und gleichzeitige Bildgebungsmodus. Verwenden Sie die z-Drehknopf auf idenfizieren die Unterseite und die Oberseite der Biofilm auf dem Feld. Stellen Sie die z-Schritt von 0,5 & mgr; m zur Erfassung eines 3-D-Bildstapel. (Um eine hohe Bildqualität zu gewährleisten, verwenden Sie eine Linie durchschnittlich vier für die Bildaufnahme.)
4. Um die räumlichen Muster der Biofilmentwicklung innerhalb der Flusszelle, Bild Biofilmen an drei oder mehr Längs Karte (x) Abständen entlang der Strömungszelleneingang und an drei Querrichtung (y) positioniert relativ zu dem auferlegten Nahrungs Gradienten, wie in Figur 1 gezeigt, .

3. Charakterisierung Interne Stofftransport durch Injektionen von Conservative Fluoreszierende Tracer

HINWEIS: Eine konservative fluoreszierender Tracer, wie Cy5, kann verwendet werden, um Stofftransportmuster innerhalb des Biofilms zu charakterisieren.

1. Löse Cy5 (Mono-Reactive NHS Ester) in Wasser auf eine Endkonzentration von 10 mg / ml als Stammlösung. Bewahren Sie die Cy5-Stammlösung in einem -20 ° C Tiefkühltruhe.
   HINWEIS: Wie Cy5 ist licht sensitive, speichern, zu verdünnen und injizieren Cy5-Lösungen in der Dunkelheit.
2. Vor der Injektion des fluoreszierenden Tracers, nehmen Sie ein 3-D-Bildstapel der 3-Tages-Biofilm mit der konfokalen Mikroskopie (mit einem 63X Objektiv). (Wide Regionen Biofilm Kolonien sind ideal für Zeitreihen Beobachtungen der Farbstofftransport.) Wählen, auch die Z-Ebene mit gut getrennte Kolonien zur Bildgebung (wie in 5A gezeigt).
3. Für jede Injektion Cy5 Experiment verdünnen 2 ul des Cy5-Stammlösung in 998 & mgr; l sterilisiertem Wasser, um eine Injektionslösung mit einem Cy5-Konzentration von 20 ug / ml zu ergeben.
4. Stoppen der Pumpe, um den Fluß anzuhalten, und spritzen die Cy5-Lösung in die stromaufwärts von der Durchflusszelle mit einer Spritze über das 3-Wege-Ventil. (Es ist wichtig, Luftblasen in die Strömungsbahn während der Injektion zu verhindern. Blasenfallen sollten während des Hinterspritz offen gehalten werden.)
5. Nach dem Einspritzen des Cy5-Lösung, schließen Sie die Blasenfallen, stellen Sie die 3-Wege-Ventil, und starten Sie diezu pumpen, um den eingespritzten Cy5-Lösung in die Durchflusszelle zu liefern.
6. Schalten konfokalen Abbildungsmodus zu XYT. Aktivieren Cy5 und GFP-Kanälen unter gleichzeitiger Bildmodus. Passen konfokalen Einstellungen auf Cy5 Intensität (Laserintensität, Gain und Offset), um zu vermeiden Sättigung Signale, die von entscheidender Bedeutung für die Quantifizierung. (Hohe zeitliche Auflösung zur Visualisierung Farbeindringprüfung bevorzugt. Allerdings nimmt schnelle Scan-Bildqualität.) Wählen Sie die richtige Scan-Geschwindigkeit und Rauh um die Zeitauflösung der Bildverarbeitung und der Bildqualität auszugleichen. Aus diesem Protokoll eine Linie durchschnittlich vier und eine Bildrate von 0,15 Hz.
7. Fortsetzen der Strömung zu Cy5 in die Durchflußzelle (noch bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,03 ml / min) zu liefern. Gleichzeitig beginnen Zeitreihen konfokale Bildgebung.
8. Quantifizieren Cy5 Eindringen von radial durchschnittlich Cy5 Intensität innerhalb eines 2-D-Kreisbiofilmkolonie. Zu mitteln, zuerst den Rand eines Biofilms Cluster zu identifizieren, dann ein Abstandskarte für ein 2-D-Teil des ClustersUnd schließlich durchschnittlichen radialen Muster von Cy5 Intensitäten einen Durchdringungskurve (siehe Figur 6) zu erzeugen.
   1. Um rechen realisieren Schritt 3.8, verwenden BioSPA (Biofilm Spatial Pattern Analysis) Software-Paket (unveröffentlicht, Softwarepaket und Hand auf Anfrage erhältlich) oder andere Bildanalyseprogramme.
   2. Um BioSPA verwenden, zuerst ein Bild in BioSPA gesetzt importieren. Wählen Sie dann die richtige Schwelle für GFP und Cy5 Kanäle binäre Bilder zu machen. Bei der Analyse / Berechnung Menü wählen Sie Advanced Analysis und Diffusion Analyse. Verwenden Sie das GFP-Kanal an den Rand eines Clusters definieren und das Polygon-Werkzeug, um einen Cluster als Region of Interest (ROI) zu wählen.
   3. Doppelklicken Sie auf das ausgewählte Biofilm-Cluster, um eine Diffusion Analyse durchzuführen. Speichern Sie die Diffusionsanalyseergebnisse und kalibrieren Cy5 Intensität Cy5 Konzentration anhand einer Eichkurve.
      1. Um Cy5 Konzentration Eichkurve zu erzeugen, messen Cy5 Intensitäten über einen Cy5 concentration Gradienten unter der konfokalen Mikroskopie. (Cy5 Intensität und Konzentration haben eine lineare Beziehung.)

4. Charakterisierung der Umgebung Fluss Feld von Tracking-Fluorescent Particles

HINWEIS: Fluoreszierende Teilchen, wie fluoreszierende Mikroperlen verwendet werden, um das Strömungsfeld herum Biofilmen zu charakterisieren. Strömungsfeld um Biofilme aus den Zeitreihenbeobachtungen Partikelpositionen mit Particle Tracking Velocimetry Software berechnet werden. Die hier gezeigten Ergebnisse wurden mit dem Streams 2.02 Softwarepaket ¹⁶ (Software-Download und Benutzerhandbuch finden Sie unter erhalten http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml ).

1. Verdünne die fluoreszierenden Mikrokügelchen (Durchmesser ca. 1 & mgr; m) in sterilisiertem Wasser auf ein Feststoffkonzentration von 0,2% und einem Endvolumen von 0,5 ml. Vortex, um sicherzustellen, dass die Mikroperlensind gut verteilt.
2. Einzuspritzen und den gewünschten verdünnt fluoreszierenden Mikroperlen in die Durchflußzelle folgenden Verfahren aus den Schritten 3.3 bis 3.5. Damit eine genaue Überwachung der Partikelbahn, mit einem relativ niedrigen Flussrate (0,01 ml / h für die Partikelverfolgung Ergebnisse in diesem Dokument).
3. Schalten konfokalen Einstellungen XYT Modus, um Partikelbewegung an einem z-Scheibe zu verfolgen und nehmen Sie Zeitreihen-Bildern. Wiederholen Partikelinjektion und Bild an verschiedenen Stellen Z (A Frame-Rate von 1 Hz wurde für die in dieser Veröffentlichung gezeigten repräsentativen Ergebnissen verwendet.), Um 3-D-Strömungsfeld zu erzeugen.
4. Pre-Prozess die Zeitreihen konfokale Bilder durch Subtraktion der Hintergrundfluoreszenz Signal (das Signal in der ersten aufgenommenen Bildes der Bildsatz) mit ImageJ (Software-Download und Anleitung auf http://imagej.nih.gov/ij/ ) oder andere Programme.
5. In ImageJ, öffnen Sie das erste Bild einer Bildsatz und importieren Sie die Bildmenge. Unter Prozess / Bild Calculator subtrahieren Sie das erste Bild aus dem Bild Set. Speichern Sie die vorverarbeiteten Bildmenge.
6. Zur Berechnung der Strömungsvektoren, Import Zeitreihen konfokalen Bildern in Streams 2,02. Unter "Open Prozesssicht", wählen Sie und führen Sie "Identifizieren Partikel". Verwenden Sie die richtige Schwelle, um Partikel zu identifizieren. Verwenden Sie 0,5 und 5 & mgr; m als Mindest- und Höchstdurchmesser Schwellenwerte für 1 & mgr; m-Partikel.
7. Dann unter "Open Prozesssicht", wählen Sie und führen Sie "PTV Analyse-Pipeline", um Partikelbahnen zu generieren. Überprüfen Sie die Partikelbahnen zu sehen, ob sie Partikelbewegung darstellen. Schließlich wählen Sie und führen Sie "Neues Geschwindigkeitsfeld", um einen Fluss Vektorkarte zu generieren.

Ergebnisse

Der Doppeleinlaß mikrofluidischen Flusszelle ermöglicht die Beobachtung von Biofilmwachstum unter einer gut definierten chemischen Gradienten durch Mischen von zwei Lösungen innerhalb der Durchflusskammer gebildet. Die sich ergebende chemische Gradienten wurde früher von Farbstoff Injektion beobachtet und detailliert charakterisiert von Song et al. ^14. Glatten Konzentrationsgradienten wurden in der Querrichtung ausgebildet sind, wie in 1 gezeigt. Das Konzentrationsprofil war steil na...

Diskussion

Wir haben gezeigt, eine Reihe von Methoden, um drei wichtige Biofilm-Umwelt-Interaktionen zu charakterisieren: Biofilm Reaktion auf chemische Gradienten, Auswirkungen von Biofilmwachstum auf die umliegende Flussmikroumgebung und Biofilm Heterogenität von internen Transportbeschränkungen resultieren.

Wir haben gezeigt, zuerst die Verwendung eines neuartigen Mikrofluid-Durchflusszelle, um eine gut definierte chemische Gradient für Biofilmentwicklung verhängen. Um eine gut definierte chemische ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Schlauchpumpe	Gilson	Miniplus 3	Durchflusszelleneinrichtung und Inokulation
Pumpenschlauch 0,50  mm OVC, Orange/Gelb	Gilson	F117934	Aufbau und Inokulation
Drei-Wege-Absperrhahn mit drehbarem Luer-Lock	Smiths Medical	MX9311L	Einrichtung und Inokulation von Durchflusszellen
Sylgard 184 Solarzellenverkapselung zur Herstellung von Solarmodulen	ML Solar LLC		Einrichtung und Inokulation von Durchflusszellen
Pyrex Medium Flasche, 1  L, GL45 VWR		16157-191	Einrichtung und Inokulation von Durchflusszellen
C-FLEX Schlauch	Cole-Parmer	06422-02	Einrichtung und Inokulation von Durchflusszellen
1 ml TB Spritze	BD	309659	Einrichtung und Inokulation von Durchflusszellen
Polymerschläuche	IDEX	1520G	Einrichtung und Inokulation von Durchflusszellen
Steriler Intramedic Luer Stub Adapter	Clay Adams	427564	Einrichtung und Inokulation von Durchflusszellen
PrecisionGlide Needle	BD	305195	Einrichtung und Inokulation von Durchflusszellen
Spektralphotometer	HACH		Einrichtung und Inokulation von Durchflusszellen
Spritzenfilter - steril (0,2 μ m)	Fisherbrand	09-719A	Einrichtung und Inokulation der Durchflusszelle
MAXQ Shaker	Thermo Scientific		Einrichtung und Inokulation der Durchflusszelle
Ammoniumsulfat	Sigma Aldrich	A4418	Wachstumsmedien
Natriumphosphat zweibasisch wasserfrei	Sigma Aldrich	RES20908-A7	Wachstumsmedien
Monobasisches Kaliumphosphat	Sigma Aldrich	P5655	Wachstumsmedien
Natriumchlorid	Sigma Aldrich	S7653	Wachstumsmedien
Magnisiumchlorid	Sigma Aldrich	M8266	Wachstumsmedien
Calciumchlorid	Sigma Aldrich	C5670	Wachstumssubstrate
Calciumsulfat-Dihydrat	Sigma Aldrich	C3771	Wachstumsmedien
Eisen(II)-sulfat-Heptahydrat	Sigma Aldrich	215422	Wachstumsmedien
Mangan(II)-sulfat-Monohydrat	Sigma Aldrich	M7634	Wachstumsmedien
Kupfer(II)-sulfat	Sigma Aldrich	451657	Wachstumsmedien
Zinksulfat-Heptahydrat	Sigma Aldrich	Z0251	Wachstumsmedien
Kobalt(II)-sulfat-Heptahydrat	Sigma Aldrich	C6768	Wachstumsmedien
Natriummolybdat	Sigma Aldrich	243655	Wachstumsmedien
Borsäure	Sigma Aldrich	B6768	Wachstumsmedien
Dextrose	Sigma Aldrich	D9434	Wachstumsmedien
Luria Bertani Bouillon	Sigma Aldrich	L3022	Wachstumsmedien
TCS SP2 Konfokalmikroskopie	Leica		Fluoreszenzbildgebung
SYTO 62	Life Technology	S11344	Fluoreszenzbildgebung
Cy5	GE Healthcare Life Sciences	PA15100	Fluoreszenzbildgebung
Rot fluoreszierend (580/605) FluoSphere	Life Technology	F-8801	Fluoreszenzbildgebung
BioSPA	Packman Lab		Bildverarbeitung
BildJ	NIH
Bildverarbeitung Volocity	PerkinElmer		Bildverarbeitung
Streams 2.02	Bildverarbeitung der Universität Cantebury