Biofunktionalisierten Prussian Blue Nanopartikel für Molekulare Bildgebung Multimodale Anwendungen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Synthese biofunktionalisierter preußischblauer Nanopartikel für den Einsatz von multimodalen molekularen Bildgebungsmitteln. Dies wird erreicht, indem zunächst preußisch-blaue Nanopartikel synthetisiert werden, die entweder Gadolinium- oder Mangan-Ionen enthalten, die das MRT-Signal verstärken. Der zweite Schritt besteht darin, fluoreszierendes Avadon an die Oberfläche der Nanopartikel zu binden, was die Fähigkeit zur fluoreszierenden Bildgebung verleiht.

Anschließend werden die Avadon-beschichteten Nanopartikel mit den gewünschten zellspezifischen biotinylierten Antikörpern biofunktionalisiert. Ein letzter Schritt besteht darin, eine Qualitätskontrolle der biofunktionalisierten Nanopartikel durchzuführen, indem ihre Größe, ihr Zetapotenzial und ihre zeitliche Stabilität gemessen werden. Letztendlich werden die biofunktionalisierten Nanopartikel in multimodalen molekularen Bildgebungsanwendungen verwendet, um eine bestimmte Zielpopulation von Zellen innerhalb einer Mischung mittels Fluoreszenzbildgebung und MRT sichtbar zu machen.

Aktuelle kommerzielle Bildgebungsmittel sind in der Regel Singlemode-Verfahren und bieten eine Auflösung nur auf anatomischer Ebene. Preußischblau-Nanopartikel kombinieren zwei komplementäre Bildgebungsmodi, MRT und Fluoreszenz, und ermöglichen molekulare Bildgebung und subzelluläre Ebenen. Die Anwendungen multimodaler Nanopartikel erstrecken sich auf die Diagnose von Krebs und entzündlichen Erkrankungen sowie auf die Überwachung ihres Ansprechens auf die Behandlung.

Dies liegt daran, dass biofunktionalisierte Nanopartikel auf eine Population von Zellen innerhalb einer bestimmten Körperregion abzielen und sich an diese binden können. Obwohl diese Methode Einblicke in die Diagnose von Krebs und entzündlichen Erkrankungen und das Ansprechen auf die Behandlung geben kann, kann sie auch auf andere pathologische Zustände angewendet werden, die von der Sensitivität und Spezifität der molekularen Bildgebung profitieren. Unter Verwendung von Fluoreszenz und MRT hatten wir die Idee, diese Nanopartikel herzustellen, als wir feststellten, dass preußisches Blau und ein von der FDA zugelassenes Mittel für den oralen Verzehr beim Menschen mit einem einteiligen Syntheseschema stabil synthetisiert und mit Standard-Biokonjugattechniken robust biofunktionalisiert werden können.

Bereiten Sie zu Beginn eine 5 Millionen molare Lösung von Kaliumhexasanoferrat zwei von fünf Millilitern deionisiertem Wasser vor, um Lösung A herzustellen, nächste Reparaturlösung B, die 2,5 Millimolare Eisen, drei Chlorid und 2,5 Millimolare Mangan enthält. Zwei Chloride in 10 Milliliter deionisiertem Wasser zur Synthese von Mangan-Preußischblau-Nanopartikeln. Andere Nanopartikel können, wie im Textprotokoll angegeben, synthetisiert werden, Lösung B in einen Rundkolben A übertragen und die Lösung bei 1000 U/min bei Raumtemperatur umrühren.

Mit einer Schlauchpumpe wird die Lösung mit einer Geschwindigkeit von 10 Millilitern pro Stunde tropfenweise in das Gefäß gegeben. Nachdem die Zugabe von Lösung A abgeschlossen ist, rühren Sie die Mischung weitere 30 Minuten lang bei 1000 U/min. Übertragen Sie dann einen Milliliter Aliquote der Mischung in Mikrozentrifugenröhrchen und geben Sie 0,2 Milliliter fünf Milli Natriumchlorid in jedes Röhrchen.

Zentrifugieren Sie die Röhrchen mindestens 10 Minuten lang bei 20.000 G und entfernen Sie dann vorsichtig das Supinat, wobei das Pellet aus Nanopartikeln übrig bleibt. Fügen Sie als Nächstes jedem Pellet einen Milliliter deionisiertes Wasser hinzu. Verwenden Sie eine Mikrospitze, um die Nanopartikel durch Beschallung gleichmäßig in Lösung zu suspendieren.

Waschen Sie die Nanopartikel mindestens drei weitere Male, um Komponenten der Anfangsreaktion nach dem letzten Schleudern aus der Suspension zu entfernen, suspendieren Sie die Nanopartikel erneut in einem Milliliter deionisiertem Wasser, nachdem Sie die Nanopartikel mit fluoreszierendem den beschichtet haben, wie im Textprotokoll beschrieben, und entfernen Sie die biotinylierten Antikörperstämme aus dem Kühlschrank. Hier. Verwenden Sie das Anti-Neuron-Glia-Antigen zwei und das Anti-Human-Eotaxin drei. Übertragen Sie den biotinylierten Antikörper in einen 0,2-Mikro-Nylon-Mikrofuge-Filter und zentrifugieren Sie das Röhrchen dann 10 Minuten lang bei 14.000-fachem G.

Fügen Sie dann weniger als oder gleich 0,05 Milligramm des Antikörpers pro Milligramm Aden-beschichteter Nanopartikel hinzu und decken Sie die Röhrchen mit Aluminiumfolie ab, um sie vor Licht zu schützen. Inkubieren Sie die Röhrchen unter leichtem Schütteln für zwei bis vier Stunden bei vier Grad Celsius. Nach dem Anbringen der Antikörper geben Sie 10 Mikroliter eines Milligramms pro Milliliter Nanopartikelprobe zu 990 Mikrolitern deionisiertem Wasser in eine Einweg-Plastik-Vete-Kappe, die Vete und V es zum Mischen.

Bestimmen Sie dann die durchschnittliche Größe der Nanopartikel mit Hilfe eines dynamischen Lichtstreusystems mit einem Messwinkel von 173 Grad. Beginnen Sie mit der Herstellung von 10 Milliliter Suspensionen von Zellen in PBS in einer Konzentration von etwa 100.000 Zellen pro Milliliter für Mischkulturen; Röhrchen mit unterschiedlichen Verhältnissen jeder Zelllinie sollten, wie im Textprotokoll beschrieben, bei zwei Millilitern 5 % BS, A zu jedem Röhrchen hergestellt werden, um die Zellen zu blockieren und unspezifische Bindungen zu minimieren. Geben Sie dann einen Milliliter von einem Milligramm pro Milliliter hinzu, biofunktionalisieren Sie Nanopartikel in jedes Röhrchen und inkubieren Sie die Mischung eine Stunde lang.

Als nächstes spülen Sie die Zellen von ungebundenen Nanopartikeln frei, indem Sie die Röhrchen fünf Minuten lang bei 1000 Mal G drehen und die Pellets in einem Milliliter PBS erneut biegen. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch mindestens zweimal. Fixieren Sie die Zellen mit 10% Formaldehyd in PBS und fügen Sie dann 10 Mikrogramm pro Milliliter, sieben Aminoaktin und Mycin D in PBS hinzu, um die Zellen zu färben, inkubieren Sie das Röhrchen 30 Minuten lang auf Eis und spülen Sie dann die Zellen mit PBS.

Laden Sie als Nächstes die Probe in das Durchflusszytometer und analysieren Sie 10.000 Gated Cells aus jeder Probe. Ein ähnliches Verfahren zur Abbildung von Zellen, die an fluoreszierende Nanopartikel gebunden sind, mittels konfokaler Lasermikroskopie ist im Textprotokoll beschrieben. Zu Beginn tragen Sie die Zellen in T-75-Kolben auf etwa 80 % Konfluenz und spülen Sie die Zellen dann mit fünf Millilitern PBS von Medium frei.

Fügen Sie fünf Milliliter 1%BSA in PBS hinzu und blockieren Sie die Zellen für eine Stunde. Geben Sie dann fünf Milliliter mit 0,5 Milligramm pro Milliliter Antikörper-beschichtete Nanopartikel in den Kolben und inkubieren Sie die Zellen eine Stunde lang, damit die Nanopartikel binden können. Spülen Sie die Zellen anschließend dreimal mit fünf Millilitern PBS, um ungebundene Nanopartikel zu entfernen.

Dann fügen Sie zwei Milliliter 0,25%ige Tripsin EDTA-Lösung hinzu und inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang, um die Zellen aus dem Kolben zu lösen. Fügen Sie acht Milliliter DMEM hinzu, um das Tryin zu löschen, und überführen Sie dann die Zellsuspension in Zentrifugenröhrchen. Drehen Sie sie fünf Minuten lang mit dem 1000-fachen G, um die Zellen zu pelletieren.

Als nächstes aspirieren Sie das Supinat und resuspendieren die Zellen in einem Milliliter PBS. Fügen Sie einen Milliliter 10%iges Formaldehyd in PBS hinzu, um die Zellen zu fixieren, und geben Sie dann 100 Mikroliter jeder Probe in separate Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit flachem Boden. Geben Sie 100 Mikroliter geschmolzene 1%aros in deionisiertem Wasser in jede Vertiefung und mischen Sie sie durch Auf- und Abpipettieren.

Lassen Sie das Gel 12 Stunden lang bei vier Grad Celsius erstarren, um ein Phantom zu erhalten. Nachdem das Gel erstarrt ist, platzieren Sie das Phantom in einem horizontalen klinischen Magneten mit drei T neben einem massiven 150 Zentimeter großen Würfelblock aus 2%agar. Befestigen Sie dann das Phantom und den Agarblock in der Mitte einer Achtkanal-HD-Gehirnspule, um die Relaxationszeiten zu messen: Verwenden Sie 0,5 Millimeter dicke koronale Scheiben, die auf mittlerer Höhe der 96-Well-Platte aufgenommen wurden. Dynamische Lichtstreuassays wurden verwendet, um den hydrodynamischen Durchmesser der erzeugten Nanopartikel zu bestimmen. Stabilität Studien bestätigten die Langzeitstabilität der Nanopartikel und werden sowohl in wasserbasierten als auch in zellmedienbasierten Experimenten verwendet.

Die konfokale Lasermikroskopie zeigte fluoreszierende Nanopartikel, die mit Antikörpern für EOT drei beladen waren, die spezifisch auf der Oberfläche von EOL 1-Zellen gefunden wurden. Wenn Antikörper für ein NG two verwendet werden, binden sie spezifisch an die Oberfläche von BSG-Neurosphären. Die biofunktionalisierten Nanopartikel waren in der Lage, eine Population von Zielzellen erfolgreich fluoreszierend zu markieren, wie sie mittels Durchflusszytometrie gemessen wurden.

Darüber hinaus waren die Nanopartikel in der Lage, eine bestimmte Subpopulation von Zellen in einer Mischung auch bei niedrigen Zielzellen zu kontrollieren, um die Zellverhältnisse zu kontrollieren. Schließlich erhöhten biofunktionalisierte Nanopartikel den MRT-Kontrast von Zielzellen, Zellen, die mit Nanopartikeln behandelt wurden, die mit einem nng beladen waren. Zwei Antikörper zeigten eine Hyperintensität in den T-1-gewichteten Sequenzen im Vergleich zu Zellen, die mit Kontrollpartikeln behandelt wurden.

Im Gegensatz dazu verliehen die beiden Nanopartikel A NNG in den gewichteten Sequenzen von T zwei im Vergleich zu den Kontrollpartikeln eine Hypointensität. Einmal Meister. Die Synthese von biofunktionalisierten Presionsblau-Nanopartikeln kann innerhalb von zwei Tagen abgeschlossen werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.

Ähnlich wie bei diesem Verfahren können die Nanopartikel mit verschiedenen Biopolymeren und zielgerichteten Liganden biofunktionalisiert werden, um neue Krankheiten und neue Bedingungen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man preußisch-blaue Nanopartikel für Fluoreszenz- und Bildgebungsanwendungen zur Markierung von Zellpopulationen synthetisiert. Vergessen Sie nicht, die Sicherheitsrichtlinien und Standardarbeitsanweisungen für die Durchführung der Studien mit dem klinischen MRT-Magneten strikt zu befolgen.