Biofunktionalisierten Prussian Blue Nanopartikel für Molekulare Bildgebung Multimodale Anwendungen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, biofunktionalisierte Berliner-Blau-Nanopartikel für die Verwendung als multimodale molekulare Bildgebungsmittel herzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst Berliner-Blau-Nanopartikel synthetisiert werden, die entweder Gadolinium- oder Manganionen enthalten und dadurch das MRT-Signal verstärken. Im zweiten Schritt wird Fluoreszenz-Avidin an die Oberfläche der Nanopartikel angebunden, wodurch eine fluoreszenzbasierte Bildgebung ermöglicht wird.

Anschließend werden die mit Avadon beschichteten Nanopartikel durch biotinylierte Antikörper mit der gewünschten Zellzielgerichtetheit biofunktionalisiert. Ein letzter Schritt besteht darin, eine Qualitätskontrolle der biofunktionalisierten Nanopartikel durchzuführen, indem deren Größe, Zetapotential und zeitliche Stabilität gemessen werden. Letztendlich werden die biofunktionalisierten Nanopartikel in multimodalen molekularen Bildgebungsanwendungen eingesetzt, um eine spezifische, gezielt adressierte Zellpopulation innerhalb eines Gemischs mittels Fluoreszenzbildgebung und MRT sichtbar zu machen.

Aktuelle kommerzielle Bildgebungsagenten sind typischerweise einmodig und bieten nur eine Auflösung auf anatomischer Ebene. Prussian-Blue-Nanopartikel kombinieren zwei komplementäre Bildgebungsmethoden – MRT und Fluoreszenz – und ermöglichen die molekulare Bildgebung auf subzellulärer Ebene. Die Anwendungen multimodaler Nanopartikel reichen von der Diagnose von Krebs- und entzündlichen Erkrankungen bis hin zur Überwachung ihrer Behandlungsreaktionen.

Der Grund hierfür ist, dass biofunktionalisierte Nanopartikel gezielt eine Zellpopulation in einem bestimmten Bereich des Körpers erkennen und an diese binden können. Obwohl diese Methode Einblicke in die Diagnose von Krebs- und entzündlichen Erkrankungen sowie in die Therapieantwort ermöglichen kann, lässt sie sich auch auf andere pathologische Zustände anwenden, die von der Empfindlichkeit und Spezifität der molekularen Bildgebung profitieren. Unter Verwendung von Fluoreszenz und MRT hatten wir erstmals die Idee, diese Nanopartikel herzustellen, als wir feststellten, dass sich Berliner Blau, ein von der FDA zugelassener Wirkstoff für die orale Einnahme durch den Menschen, stabil mittels eines einstufigen Syntheseschemas herstellen und mithilfe etablierter biokonjugierter Techniken zuverlässig biofunktionalisieren lässt.

Zunächst wird eine 5-Millionen-molare Lösung von Kaliumhexacyanoferrat(II) in fünf Millilitern entionisiertem Wasser hergestellt, um Lösung A zu erhalten. Danach wird Lösung B, die 2,5 Millimolar Eisen(III)-chlorid und 2,5 Millimolar Mangan(II)-chlorid in 10 Millilitern entionisiertem Wasser enthält, für die Synthese von Mangan-Preußischblau-Nanopartikeln hergestellt. Weitere Nanopartikel können gemäß dem schriftlichen Protokoll synthetisiert werden. Lösung B wird in einen Rundkolben überführt und die Lösung bei Raumtemperatur mit 1000 U/min gerührt.

Unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe wird Lösung A tropfenweise mit einer Geschwindigkeit von 10 Millilitern pro Stunde in das Gefäß gegeben. Nach dem vollständigen Zugeben von Lösung A wird das Gemisch 30 Minuten lang mit 1000 U/min gerührt. Anschließend werden jeweils ein Milliliter-Aliquot des Gemischs in Mikrozentrifugenröhrchen überführt und jedem Röhrchen 0,2 Milliliter Fünf-Milli-Natriumchlorid zugegeben.

Zentrifugieren Sie die Röhrchen mit 20.000 × g für mindestens 10 Minuten und entfernen Sie anschließend vorsichtig den Überstand, wobei das Pellet mit den Nanopartikeln zurückbleibt. Geben Sie danach je ein Milliliter entionisiertes Wasser zu jedem Pellet. Suspendieren Sie die Nanopartikel mithilfe einer Mikrospitze gleichmäßig in der Lösung durch Beschallung.

Waschen Sie die Nanopartikel mindestens dreimal erneut, um Komponenten der ursprünglichen Reaktion aus der Suspension nach der letzten Zentrifugation zu entfernen; resuspendieren Sie die Nanopartikel in einem Milliliter entionisiertem Wasser, nachdem die Nanopartikel wie im Textprotokoll beschrieben mit fluoreszierenden Dendrimeren beschichtet wurden; nehmen Sie die Lagerlösungen des biotinylierten Antikörpers aus dem Kühlschrank. Verwenden Sie Anti-Neuron-Glia-Antigen 2 und Anti-humanes Eotaxin 3. Überführen Sie den biotinylierten Antikörper in einen 0,2-Mikrometer-Nylon-Mikrozentrifugenfilter und zentrifugieren Sie das Gefäß anschließend bei 14.000 × g für 10 Minuten.

Fügen Sie anschließend weniger als oder gleich 0,05 Milligramm des Antikörpers pro Milligramm Aden-beschichteter Nanopartikel hinzu und bedecken Sie die Röhrchen mit Aluminiumfolie, um sie vor Licht zu schützen. Inkubieren Sie die Röhrchen unter leichtem Schütteln zwei bis vier Stunden bei vier Grad Celsius. Nach dem Anheften der Antikörper geben Sie 10 Mikroliter einer Nanopartikelprobe mit einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter in 990 Mikroliter entionisiertes Wasser in einem Einweg-Kunststoffvial, verschließen Sie das Vial und wirbeln Sie es, um die Lösung zu mischen.

Danach die durchschnittliche Größe der Nanopartikel mithilfe eines dynamischen Lichtstreuungssystems mit einem Messwinkel von 173 Grad bestimmen. Zunächst 10-Milliliter-Suspensionen von Zellen in PBS mit einer Konzentration von etwa 100.000 Zellen pro Milliliter herstellen; für gemischte Kulturen sollten Röhrchen mit unterschiedlichen Verhältnissen jeder Zelllinie wie im Textprotokoll beschrieben vorbereitet werden. Jeweils zwei Milliliter 5 % BSA zu jedem Röhrchen hinzufügen, um die Zellen zu blockieren und unspezifische Bindungen zu minimieren. Anschließend je ein Milliliter einer Lösung mit einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter an biofunktionalisierten Nanopartikeln zu jedem Röhrchen geben und das Gemisch eine Stunde lang inkubieren.

Als Nächstes waschen Sie die Zellen, um ungebundene Nanopartikel zu entfernen, indem Sie die Röhrchen fünf Minuten lang mit 1000 × g zentrifugieren und die Pellets in einem Milliliter PBS resuspendieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang mindestens zweimal. Fixieren Sie die Zellen mit 10 % Formaldehyd in PBS und geben Sie anschließend 10 Mikrogramm pro Milliliter 7-Amino-Aktinomycin D in PBS zu, um die Zellen zu färben. Inkubieren Sie das Röhrchen 30 Minuten auf Eis und waschen Sie die Zellen danach mit PBS.

Laden Sie anschließend die Probe in den Durchflusszytometer und analysieren Sie 10.000 gezielte Zellen aus jeder Probe. Ein ähnliches Verfahren zur Abbildung von Zellen, die an fluoreszierende Nanopartikel gebunden sind, mittels Laser-Scanning-Konfokalmikroskopie ist im Textprotokoll beschrieben. Beginnen Sie damit, die Zellen in T-75-Flaschen bis zu einer Konfluenz von etwa 80 % heranzuziehen, und spülen Sie die Zellen anschließend mit fünf Millilitern PBS vom Medium befreit.

Geben Sie fünf Milliliter 1 % BSA in PBS hinzu und blockieren Sie die Zellen eine Stunde lang. Anschließend geben Sie fünf Milliliter Antikörper-beschichtete Nanopartikel mit einer Konzentration von 0,5 Milligramm pro Milliliter zum Kolben hinzu und inkubieren die Zellen eine Stunde lang, um die Bindung der Nanopartikel zu ermöglichen. Danach spülen Sie die Zellen dreimal mit jeweils fünf Milliliter PBS, um ungebundene Nanopartikel zu entfernen.

Gegeben Sie dann zwei Milliliter einer 0,25 %igen Trypsin-EDTA-Lösung hinzu und inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang, um die Zellen vom Kolben zu lösen. Geben Sie acht Milliliter DMEM zu, um die Trypsinwirkung zu stoppen, und überführen Sie die Zellsuspension in Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie diese bei 1000 × g für fünf Minuten, um die Zellen zu pelletieren.

Als Nächstes den Überstand abziehen und die Zellen in einem Milliliter PBS resuspendieren. Ein Milliliter 10 % Formaldehyd in PBS hinzufügen, um die Zellen zu fixieren, und anschließend 100 Mikroliter jeder Probe in separate Vertiefungen einer 96-Loch-Flachbodenplatte überführen. Jeweils 100 Mikroliter geschmolzenes 1 % Agarose in entionisiertem Wasser zu jeder Vertiefung hinzufügen und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren mischen.

Lassen Sie das Gel zwölf Stunden lang bei vier Grad Celsius erstarren, um einen Phantomkörper zu erhalten. Nachdem das Gel erstarrt ist, platzieren Sie den Phantomkörper neben einem festen Würfel aus 2 % Agar mit einer Kantenlänge von 150 Zentimetern in einem horizontalen dreifachen T-Klinikmagneten. Befestigen Sie anschließend den Phantomkörper und den Agarwürfel in der Mitte einer achtkanaligen HD-Hirnspule, um die Relaxationszeiten zu messen, wobei 0,5 Millimeter dicke koronare Schnitte in der mittleren Höhe der 96-Loch-Platte verwendet werden. Dynamische Lichtstreuungsanalysen wurden verwendet, um den hydrodynamischen Durchmesser der erzeugten Nanopartikel zu bestimmen. Stabilitätsstudien bestätigten die Langzeitstabilität der Nanopartikel, die sowohl in wasserbasierten als auch in Zellkulturmedien-basierten Experimenten eingesetzt werden.

Die Laser-Scanning-Mikroskopie zeigte fluoreszierende Nanopartikel, die mit Antikörpern gegen EOT drei beladen waren und spezifisch an die Oberfläche von EOL-eins-Zellen binden. Wenn Antikörper gegen ein NG zwei verwendet werden, binden diese spezifisch an die Oberfläche von BSG-Neurosphären. Die biofunktionalisierten Nanopartikel konnten erfolgreich eine Population gezielter Zellen fluoreszenzmarkieren, wie durch Durchflusszytometrie gemessen wurde.

Außerdem konnten die Nanopartikel eine spezifische Teilpopulation von Zellen in einem Gemisch gezielt ansprechen, selbst bei niedrigen Verhältnissen von Ziel- zu Kontrollzellen. Schließlich erhöhten biofunktionalisierte Nanopartikel den MRT-Kontrast der gezielten Zellen, der mit Nanopartikeln beladene Zellen. Bei zwei Antikörpern zeigte sich eine Hyperintensität in den T1-gewichteten Sequenzen im Vergleich zu Zellen, die mit Kontrollpartikeln behandelt wurden.

Dagegen verursachten die beiden A-NNG-Nanopartikel im Vergleich zu den Kontrollpartikeln eine verminderte Intensität in den T2-gewichteten Sequenzen. Einmal Meister. Die Synthese von biofunktionalisierten Präzisions-Blau-Nanopartikeln kann innerhalb von zwei Tagen abgeschlossen werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.

Ähnlich wie bei diesem Verfahren können die Nanopartikel mit verschiedenen Biopolymeren und gezielten Liganden biofunktionalisiert werden, um neue Krankheiten und Bedingungen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Prussian-Blue-Nanopartikel für Fluoreszenz- und Bildgebungsanwendungen zur Markierung von Zellpopulationen synthetisiert. Vergessen Sie nicht, die Sicherheitsrichtlinien und Standardarbeitsanweisungen für die Durchführung von Studien im klinischen MRI-Magneten streng einzuhalten.