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Hochdurchsatz-quantitative Echtzeit-RT-PCR-Assay zur Bestimmung Expressionsprofile der Typen I und III Interferon-Formationsglieder

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DOI:

10.3791/52650

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24. März 2015

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1Center for Biologics Evaluation and Research, US Food and Drug Administration, 2Center for Drug Evaluation and Research, US Food and Drug Administration

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen Hochdurchsatz-qRT-PCR-Assay für die Analyse von Typ I und III IFN-Expressionssignaturen. Der Assay unterscheidet Unterschiede zwischen einzelnen Basenpaaren zwischen den sehr ähnlichen Transkripten dieser Gene. Durch die Chargenmontage und das robotergestützte Pipettieren sind die Assays konsistent und reproduzierbar.

Zusammenfassung

In diesem Bericht wird ein qRT-PCR-Assay für die Analyse von siebzehn humanen IFN-Subtypen in einem 384-Well-Plattenformat beschrieben, das hochspezifische Locked Nucleic Acid (LNA)- und Molecular Beacon (MB)-Sonden, Transkriptstandards, automatisiertes Mehrkanal-Pipettieren und Plattentrocknung enthält. Die Bestimmung der Expression unter den Typ-I-Interferonen (IFN), insbesondere den zwölf IFN-α-Subtypen, ist durch ihre gemeinsame Sequenzidentität begrenzt; Ebenso sind die Sequenzen des Typ-III-IFN, insbesondere IFN-λ2 und -λ3, sehr ähnlich. Dieser Assay bietet ein zuverlässiges, reproduzierbares und relativ kostengünstiges Mittel zur Analyse der Expression der siebzehn Interferon-Subtyp-Transkripte.

Einleitung

Typ I und Typ III-Interferone (IFN) sind kritisch bei der Immunantwort auf Viren und anderen pathogenen Stimuli und Zeit in allen Vertebraten 1. Immun- und Nicht-Immun-Zellen zu exprimieren und sezernieren, aber auch reagieren auf, IFN 2. Angeborenen Immunsensoren, wie Toll-like Rezeptoren (TLR), STING und RIG-I, induzieren Typ I und III IFN-Expression bei Erkennung pathogen associated molecular patterns (PAMP) 3,4. Beim Menschen Typ I IFN umfassen IFN-β, -ω, -κ und 12 Subtypen von IFN-α und binden an den IFNAR1 / IFNAR2-Rezeptorkomplex 2,5. Typ III IFN gehören IFN-λ1, -λ2 und -λ3 und auf die IL10RB / IL28RA Rezeptor-Komplex 2 zu binden. Klassisch, Typ I und III IFN binden an ihren jeweiligen Rezeptor-Komplexe, die dann rekrutieren STAT1 / STAT2 Heterodimere und die Transkription der Interferon-stimulierte Gene (ISG) 6. ISG in ein breites Spektrum von Funktionen beteiligt, von antiviralen und antiproliferative Aktivität zur Aktivierung der adaptiven Immunantwort. 7

Die zahlreichen Mechanismen Krankheitserreger entwickelt haben, um zu entgehen, unterlaufen, und die Entführung von Elementen der IFN-Signalweges zeigen die Bedeutung von IFN in der angeborenen Immunantwort 8. Zum Beispiel Vaccinia-Virus exprimiert ein Köder-Rezeptor mit IFNAR1 Homologie, die Typ-I-IFN 9 während ein Yaba-like disease virus sondert ein Glykoprotein, das Typ I und III IFN Proteine ​​hemmt 10 maskiert. Zusätzlich zu ihrer Rolle bei der Verteidigung des Wirts werden IFN auch in Krebsüberwachung und einer Reihe von Auto-entzündlichen Erkrankungen in Verbindung gebracht: Silencing von IFN-Expression in Brustkrebs-Zellen einschränkt immunosurveillance 11 ist eine Überproduktion von IFN-α ein Mechanismus in der Entwicklung von systemischer Lupus erythematodes 12 und fehlerhafte Aktivierung des STING führt zu systemischen Entzündung durch übermäßige Mengen von IFN in STING-assoziierten Vaskulopathie verursacht13. Therapeutisch IFN verwendet werden, um Multiple Sklerose zu behandeln 14, chronischen Virusinfektionen, wie HBV 15 und HCV 16,17 und Krebsarten, wie Haarzellenleukämie 18 und chronischer myeloischer Leukämie 19. Fragen über den Stellenwert von IFN in einem bestimmten physiologischen Prozess zeigen kontinuierlich die allgegenwärtige Natur dieser Zytokin-Familie.

Typ-I-IFN, insbesondere der IFN-α-Subtypen, werden häufig als eine Einheit 20-23, anstatt als eine Gruppe von eng verwandten, aber verschiedene Proteine ​​betrachtet. Die Existenz und die Persistenz von mehreren IFN-Spezies einschließlich der IFN-α-Subtypen, ganz der Wirbeltierevolution 24 wird vorgeschlagen, dass zumindest eine Teilmenge dieser Subtypen spezifische oder spezielle Funktionen. Es ist möglich, dass die Festlegung Muster IFN Ausdruck wird zu entschlüsseln und zur Charakterisierung der spezifischen Funktionen von einem oder mehreren der Subtypen 17. Die Herausforderung des Studiums ter I und III IFN Subtypen geben auf ihrer gemeinsamen Sequenzidentität zu Grunde: die zwölf IFN-α-Subtypen teilen> 50% 25 und die IFN-λ-Subtypen Aktien 81-96% 26 ihrer Aminosäuresequenzen. In der beschriebenen qRT-PCR-Assay, Molecular Beacons (MB) und die Locked Nucleic Acid (LNA) Fluoreszenzsonden unterscheiden einzigen Basenpaar Unterschiede zwischen den in hohem Maße ähnlich IFN-Subtyp-Sequenzen und ermöglichen die Charakterisierung der IFN-Expression Signatur. 384-Well-Plattenformat des Assays umfasst sowohl quantitative (transcript-Standards) und semi-quantitative (die Haushaltsgene (HKG)) Maßnahmen, was eine Analyse durch Transkript Kopienzahl und ΔCq auf. Batch Montage, durch automatisierte Mehrkanalpipetten, und die Langzeitlagerung, möglich durch das Trocknen der Primer / Probe (Pr / Pb) erleichtert setzt auf den Platten, erhöhen die Reproduzierbarkeit, Nutzen und Praxistauglichkeit des Assays.

Dieses Protokoll beschreibt den Prozesszur Herstellung von 384-Well-qRT-PCR-Platten (1) mit bis zu siebzehn verschiedenen Pr / Pb Sätze Targeting human IFN-Subtypen (Tabelle 1). Pr / Pb eingestellt Arbeits Lager Quelle Platten (Bild 2) werden verwendet, um mehrere 384-Well-Assayplatten in einem Prozess, der mit Hilfe eines Roboter-Mehrkanalpipette automatisiert werden kann vorzubereiten. Während die anfängliche Schwerpunkt lag auf der Erstellung eines Protokolls für das Studium der menschlichen IFN-Expression Signaturen hat sich diese Methode, um Rhesusaffen als auch angewendet. Obwohl die Plattenlayouts sind etwas anders und die Pr / Pb Sätze (Tabelle 2) unterscheiden, ist die Gesamtherstellungsverfahren für die Erstellung der menschlichen und Rhesus-Platten identisch. Mit minimalen Modifikationen des Protokolls kann das Verfahren ausgeführt werden, um für die Entwicklung von Assays für andere Gruppen von eng verwandten Genen zu untersuchen erlaubt.

Siehe 1 und 2 unten

Siehe Tabellen 1 und 2 Below

Protokoll

1. Vorbereitung der Standardserienverdünnungen (3A)

HINWEIS: Serienverdünnungsreihe linearisierte Plasmide, die die Sequenzen von einer Pr / Pb-Set ausgerichtet sind als quantitative Standards für die qRT-PCR-Assay verwendet. Jeder Standard-Verdünnungssatz für die IFN-Subtypen enthält genügend Volumen, um 90 Testplatten laufen. Die vier Punkte der Standardverdünnungskurve für den Assay verwendet werden ausgewählt, um Ct-Werte aus einem Bereich von 20 bis 32 (Tabelle 3).

  1. Thaw, Wirbel, und kurz zentrifugieren Sie das Standard (50 pM) und Lachssperma-DNA (ssDNA, 10 mg / ml) Stammlösungen.
  2. Bereiten Sie die ssDNA / Wasser-Gemisch für die 17 Standardverdünnungssätze durch Mischen von 51 ul von ssDNA mit 20,3 ml Wasser.
  3. Beschriften Sie eine 8er PCR-Streifen für eine Standardverdünnungssatz.
    HINWEIS: Vorbereitung der Standardverdünnungsreihen aus den Stammlösungen wird 2-3 Stunden dauern.
  4. Dispense 190 ul der ssDNA / Wasser-Gemisch in die first Rohr in dem Streifen und 180 ul von ssDNA / Wasser-Gemisch auf die verbleibenden fünf Röhrchen.
  5. Führen Sie eine 1:20 Verdünnung durch die Übertragung von 10 & mgr; l aus dem 50 pM Standard Lager mit dem Rohr mit 190 ul der ssDNA / Wasser, mischen; Wirbel und schnell Zentrifugieren Sie die PCR-Streifen.
  6. Durchführen einer 1:10 Verdünnung durch Übertragung 20 & mgr; l aus dem zuletzt verdünnt Rohr zum nächsten Rohr in der Reihe; Wirbel und schnell Zentrifugieren Sie die PCR-Streifen.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 1.6 bis zum letzten Rohr in der Verdünnungsreihe hat den Standard aufgenommen.
  8. Wiederholen Sie die Schritte 1,3-1,7 für jeden Standard.

Siehe Tabelle 3 unten

2. Herstellung der Primer / Probe (Pr / Pb) und Leerwert-Kontrolle (NTC) Funktion Stock Mixes (3B)

HINWEIS: Jede 1,7 ml Pr / Pb eingestellt Arbeits Lager und 128,6 ul Leerwert-Kontrolle (NTC) Arbeits Lager Mix 30 Assay-Platten zu machen.

  1. Bereiten Sie die Pr / Pb eingestellt Arbeitsstammmischungen.
    NICHTE: Herstellung des Pr / Pb-Set und NTC Arbeitsstammmischungen aus den Stammlösungen wird 2-3 Stunden dauern.
    1. Resuspendieren der Primer und Sonden bei 100 uM mit ultrareinem Wasser für die Herstellung von Stammlösungen.
    2. Labels bis siebzehn 2-ml-Röhrchen; eine für jede Pr / Pb-Set im Test enthalten.
    3. Thaw, Wirbel, und kurz zentrifugieren der Primer (100 uM), Sonden (100 uM) und ssDNA (10 mg / ml) Stammlösungen.
    4. Add 2 ul von ssDNA zu jedem Rohr mit dem 12,5 ul elektronischen Mehrkanalpipette. Fügen Sie den entsprechenden Forward-Primer, Reverse-Primer und die Sonde auf jede Pr / Pb eingestellt Arbeitsstammrohr. Siehe Tabelle 1 für die Pr / Pb-Sets Targeting humanen IFN-Subtypen und Tabelle 2 für die Rhesusaffen Pr / Pb-Sets. Fügen Sie Wasser, um die Lautstärke der einzelnen Pr bringen / Pb eingestellt Arbeitsstammrohr zu 200 ul.
      ANMERKUNG: Das Volumen von Primern, Sonde und Wasser hinzufügen, hängt von der erforderlichen endgültigen Reaktions Konzentration eines Pr / Pbgesetzt.
  2. Bereiten Sie die NTC Arbeitsstammmischungen.
    1. Beschriften Sie zwei 5-tube PCR-Streifen für die NTC Arbeitsvorräte mischt.
    2. Übertragen 14,3 ul jeder Pr / Pb auf die entsprechende NTC Arbeits Lager Mischrohr gesetzt. Siehe Tabelle 4 für die Pr / Pb oder Set-Kombinationen für NTC-Brunnen. Wasser In jedem der NTC Arbeits Lager mischt, um das Endvolumen auf 128,6 ul zu bringen.
    3. Vortex, kurz zentrifugieren, und legen Sie die Röhrchen im Dunkeln auf Eis oder bei -20 ° C für die langfristige Lagerung.

Siehe Tabelle 4 unten

  1. Verdünnen Sie die Pr / Pb eingestellt Arbeitsvorräte.
    1. Nach der Entnahme einer Teilmenge der Pr / Pb-Sets für den NTC arbeiten Brühmassen erforderlich, fügen Sie 1,5 ml Wasser, um das Endvolumen jeder Pr / Pb bringen eingestellt Arbeitsstammrohr auf 1,7 ml.
    2. Vortex, kurz zentrifugieren, und legen Sie die Röhrchen im Dunkeln auf Eis oder bei -20 ° C für längere Lagerung.
3. Vorbereitung der 384-Well-Assayplatten mit Hilfe der automatischen Mehrkanalpipette

  1. Bereiten Sie eine 96-Loch-Source-Platte der Pr / Pb-Sets und NTC-Mischungen für Aliquotierung auf 384er Testplatten.
    HINWEIS: Herstellung der Source-Platte von den Pr / Pb Funktionsweise Brühmassen dauert weniger als 1 Stunde. Jeder 96-Loch-Source-Platte ist genug, um sechs 384er Testplatten (3C) zu machen.
    1. Vortex und kurz zentrifugieren die Pr / Pb eingestellt Arbeitsvorräte und NTC Arbeitsstammmischungen.
    2. Legen Sie eine neue Platte mit 96 Vertiefungen in einem gekühlten 96-Loch-Kühlblock und bezeichnen die Vertiefungen für jede Pr / Pb-Set oder NTC mischen die Brunnen zu erhalten (siehe Abbildung 2).
    3. Wasser hinzu, bis der 96-Well-Platte mit einer 250 ul elektronischen Mehrkanalpipette: Dispense 66 ul Wasser zu jedem Pr / Pb gesetzt und (mit Ausnahme der 4 Vertiefungen für Ziel 17). Dispense 82,5 ul Wasser zu den 4 Ziel 17 Brunnen. Dispense 27,5 ul Wasser zu jedem NTC gut mischen.
    4. Fügen Sie die richtige Pr / Pb eingestellt Arbeits Lager an die vorgesehenen Vertiefungen der Platte mit 96 Vertiefungen: Dispense 54 ul der korrekten Pr / Pb eingestellt Arbeits Lager an die bezeichneten Pr / Pb-Set Brunnen (mit Ausnahme der 4 Vertiefungen für Ziel 17). Dispense 67,5 ul der Ziel 17 Pr / Pb eingestellt Arbeits Lager an die vorgesehenen Ziel 17 Pr / Pb-Set Brunnen. In 22,5 ul der richtigen NTC Arbeits Lager Mix auf die Kavitäten pipettieren.
    5. Verschließen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen mit einer Klebefolie Dichtung und Zentrifuge für 1 min bei 700 xg, um sicherzustellen, der Inhalt am Boden der Wells.
    6. Legen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen in der Vortex-Mischer mit einer 96-Well-Platten-Adapter und mischen Sie für 1 min bei 1000 Umdrehungen pro Minute. Zentrifuge die Platte mit 96 Vertiefungen 5 min bei 700 x g.
    7. Lagern Sie die 96-well Platte Quelle in der Dunkelheit bei 4 ° C bei Verwendung am selben Tag, sonst bei -20 ° C bis zur Verwendung zu lagern.
  2. Bereiten Sie die 384er Testplatten, indem Sie den Pr / Pb-Sets mit Hilfe der automatischen Mehrkanalpipette.
    HINWEIS: Herstellung von sechs Testplatten aus der 96-Well-Quellenplatte wird 3-4 Stunden dauern.
    1. Vor dem Herstellen von Druckplatten, vorge Kühlen der Kühlnest bis 4 ° C vorheizen den Plattenverdampfer bis 125 ° C und die untere Heizblock auf 80 ° C mit Luftstrom bläst zwischen 20-25 Litern pro Minute (LPM).
    2. Schalten Sie den automatischen Mehrkanalpipette und öffnen Sie das Protokoll für die Herstellung von IFN-Testplatten durch Doppelklick auf das Programmsymbol.
    3. Zur Einrichtung der Plattform, legen Sie einen vollständig gefüllt Pipettenspitze Box in Plattform Position 1, der 96-Loch-Source-Platte in Position 4 und eine neue 384-Well-Platte in Position 6. Starten Sie den Lauf durch Drücken der Play-Taste.
      HINWEIS: Nach Abschluss eines Durchlaufs, jede Vertiefung werden 5 ul Pr / Pb-Mix enthalten.
      HINWEIS: pro Loch der 384er Testplatte Die endgültige Höhe der ssDNA hinzugefügt 0,025 & mgr; g.
    4. Klopfen Sie leicht die 384er Testplatte auf eine ebene Fläche, um Flüssigkeiten zu gewährleisten sind am Boden der Vertiefungen und wenden einen KlebstoffPlattendichtung.
    5. Zentrifuge die Platte für 1 min bei 700 x g. Die Klebeplatte Dichtung entfernen, setzen Sie den 384er Testplatte in die Tellertrockner und positionieren Sie den 384er vielfältigen direkt über den Brunnen.
    6. Wenn der Inhalt des 384-Well-Assayplatte zu trocken ist, eine neue Klebeplatte Dichtung, in Folie wickeln, Etikett, und speichern im Dunkeln bei 4 ° C bis zur Verwendung.
      HINWEIS: Die Platten können bei 4 ° C für mindestens 6 Monate gelagert werden.
    7. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.3-3.2.6 bis 6 x 384er Testplatten werden vorbereitet oder die Flüssigkeit im 96-Well-Platte Quelle erschöpft ist.
    8. Schalten Sie die Kühlnest, schließen Sie die Software, und schalten Sie den automatischen Mehrkanalpipette. Schalten Sie den Tellertrockner.

4. Laden und Ausführen eines 384er Testplatte

  1. Bereiten Sie zwei Housekeeping-Gen (HKG) und Mischungen, die der Pr / Pb-Set für eine HKG, ssDNA, PCR-Mastermix und Wasser bestehen, zu einem getrockneten 384-Well-Assayplatte (hinzugefügt werden 3D).
    HINWEIS: Die Herstellung der Mischungen und Laden der Testplatte wird 1-2 Stunden dauern. Ausführen der Testplatte wird weniger als 2 Stunden dauern.
    1. Beschriften Sie eine 1,5-ml-Röhrchen für jeden HKG-Mix.
    2. Verdünne 2 ul ssDNA (10 mg / ml) mit 84,9 & mgr; l Wasser. Add 2 ul der verdünnten ssDNA, 11,8 ul Wasser, 23 ul des Master-Mix und 9,2 ul der richtigen 20x HKG Pr / Pr zu jedem Rohr, Wirbel, und kurz zentrifugieren gesetzt.
    3. Verwenden Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) und Ubiquitin C (UBC) als die HKG für das menschliche Assay (siehe Material Table). Verwenden GAPDH und 18S-rRNA als HKG für die Rhesus-Assay.
      HINWEIS: Die zur Durchführung des Assays HKG sind flexibel und sollte die für den Zelltyp geeigneten Genen widerspiegeln getestet GAPDH sind UBC und 18S Beispiele für häufig verwendete HKG;. andere HKG besser geeignet sein können.
  2. Probe vorbereiten und positiHab auch kontrollieren Mischungen, die von der Probe oder positive Kontrolle cDNA, Master-Mix und Wasser bestehen, zu einem getrockneten 384-Well-Assayplatte hinzugefügt werden. Probe vorbereiten und die positive Kontrolle Mischungen in genug Quantität zu 21 Plattenvertiefungen (3D) zu verzichten.
    1. Vor der cDNA-Synthese, folgen Sie den Anweisungen des Herstellers, um die RNA-Proben mit einem DNase-Verdau Schritt vorzubereiten.
    2. Vorbereitung der Proben und der positiven Kontrolle im Voraus aus der cDNA-Synthese von mindestens 500 ng RNA, gefolgt von einer Behandlung mit RNase H (Endvolumen von 24 & mgr; l für jede Probe) nach den Anweisungen des Herstellers. Bewahren Sie die vorbereitete cDNA bei -20 ° C bis zur Verwendung. Thaw, Wirbel, und kurz zentrifugieren die Probe cDNA.
    3. In 78,8 ul des Master-Mix und 54,8 ul Wasser zu jeweils 24 ul-Probe und der positiven Kontrolle Rohr.
    4. Vortex und kurz zentrifugiert werden die Rohre.
  3. Bereiten Sie die Standards und NTC gut mischt, conbestehend aus Master-Mix und Wasser zu einem getrockneten 384-well Testplatte (3D) zugesetzt werden. Für die Standards gut mischen, fügen Sie 165 ul Wasser und 275 ul der Master-Mix in einem 1,5-ml-Tube. Für die NTC gut mischen, fügen 52,5 ul Wasser auf 52,5 ul des Master-Mix in einem 1,5-ml-Tube. Vortex und kurz zentrifugiert werden die Rohre.
  4. Bereiten Sie einen getrockneten 384-Well-Assayplatte zum Laden der Mischungen und Proben.
    1. Entfernen eines getrockneten 384er Testplatte von 4 ° C und Zentrifuge für 1 min bei 700 x g.
    2. Legen Sie die Platte auf einer gekühlten 384-Well-Kühlblock, der Klebeplatte Dichtung zu entfernen und einen Überblick über die Vertiefungen der Platte zu bestimmen, wo die verschiedenen Mischungen und Proben pipettiert werden (Abbildung 1).
  5. Laden Sie die 384er Testplatte mit Standard-Mischung gut, Normen, NTC gut mischen, Muster, Positivkontrolle und HKG-Mix (3E). Vortex und kurz zentrifugieren alle Lösungen vor der Abgabe an die Platte.
    1. Dispense 6 ul der Standards auch zu jedem Standard-mischen Sie gut mit dem 30 ul elektronischen Mehrkanalpipette. Dispense 1,5 ul der richtigen Standardverdünnungsreihen, gut mit dem 12,5 ul elektronischen Mehrkanalpipette die bezeichnet.
    2. Dispense 7,5 ul des NTC gut aufeinander NTC mischen gut mit dem 30 ul elektronischen Mehrkanalpipette. Verzichtet werden 7,5 ul der Probe auf die Kavitäten mit 30 ul elektronischen Mehrkanalpipette. Dispense 2,5 ul der HKG Pr / Pb oder vermischt, um die Kavitäten mit 12,5 ul elektronischen Mehrkanalpipette.
    3. Füllen Sie alle leeren Wells mit 7,5 ul der übrig gebliebenen Wasser und Master-Mix Mischung mit dem 30 ul elektronischen Mehrkanalpipette; 7,5 ul Wasser allein wird auch funktionieren.
    4. Dichten den 384er Assay-Platte mit dem optischen Klebefolie und Zentrifuge für 1 min bei 700 x g. Mischen Sie den verschlossenen 384-Well-Platte in den Wirbelmischer für 2 Minuten bei 2600 Umdrehungen pro Minuteund Zentrifugieren für 5 min bei 700 x g.
    5. Das verschlossene 384er Testplatte in der qRT-PCR-Maschine, öffnen Sie die Vorlage für den Test-Layout und beginnt den Lauf.
      HINWEIS: Die Ergebnisse können als Tabelle oder als Text-Datei zur Analyse exportiert werden.
    6. Mit den folgenden optimalen Thermocycler Reaktionsbedingungen für den Test: i) 50 ° C für 2 min, ii) 95 ° C für 10 min, iii) 95 ° C für 25 s, iv) 59 ° C für 1 min. Wiederholen Sie die Schritte III und IV für 40 Zyklen.
    7. Exportieren Sie die Rohdaten von der qRT-PCR-Plattform in ein Tabellenkalkulationsanwendungssoftware. Zeichnen Sie jedes 4-Punkt-Standard als Standardkurve, um die Linearität zu beobachten gesetzt. Führen Analyse durch Berechnung der ΔCq oder Kopienzahl auf der Grundlage der vier Punkt Standardkurven 27.

Siehe Abbildung 3 unten

Ergebnisse

Die qRT-PCR-Assay beschrieben implementiert werden, um die Expressionsmuster der Typen I und III IFN in einer Vielzahl von Zelltypen und Kontexte zu analysieren. So wurden beispielsweise menschlichen Typ I und III IFN Expression Signaturen in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) von 6 Spendern stimuliert mit TLR-Liganden untersucht; Poly I: C (25 ug / ml), LPS (10 ng / ml), Imiquimod (10 uM) und CpG-Oligonukleotide (1 uM) (Figur 4). Die Daten wurden unter Verwendung eines Tabellenkalkulationsanwendungsprogramm analysiert und als Netzdiagramme mit den IFN-α-Subtypen gemß dem phylogenetischen Baum ihrer Proteinsequenz 27 im Uhrzeigersinn angeordnet dargestellt. Die Radardiagramme des menschlichen IFN-Expression in einer Berechnung mit den zwei verschiedenen Analyseverfahren in das Assaydesign integriert logarithmischen Skala dargestellt: absolute Cq Wert HKG (ΔCq) normalisiert, und die Kopienzahl der Vorlage pro Mikrogramm (ug) der Gesamt-RNA . Kopienzahl-Werte werden von der Ergebnisse o berechnet Standardkurve fa Transkript ist. Die Daten zeigen, dass das menschliche IFN-Expression Signaturen von TLR-Agonisten hervorgerufen sind Liganden spezifisch.

Siehe Abbildung 4 unten

Was die menschliche IFN-Expression Signaturen gezeigt, Ausdruck Unterschriften von Typ I und III IFN in Rhesusaffen waren ebenfalls TLR-Liganden spezifisch. C (50 ug / ml), LPS (10 ug / ml), Imiquimod (10 ug / ml) für 3 Stunden (Figur 5): PBMC von 3 Spendern wurden mit Poly I stimuliert. IFN-Subtyp Ausdruck in unstimulierten Zellen zu Beginn der Studie war gering. C: Eine begrenzte Anzahl von IFN- Subtypen wurden als Reaktion auf LPS und Poly I ausgedrückt. Im Gegensatz dazu IFN-Expression in Reaktion auf Imiquimod war hoch und der Subtyp Ausdruck war breit. Die Expression von IFN-β und IFN-λ1 wurde verbessert, indem alle drei TLR-Agonisten 28.

Siehe Abbildung 5 unten

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Abb. 1: Das Layout für eine 384-Well-Testplatte mit siebzehn Pr / Pb-Sets Zielzahl bezieht sich auf eine Pr / Pb-Set. Die Vierpunkt-Standardkurven (dunkelgrau Dreieck) werden die Spalten 1-5 aufgenommen. Die HKG Pr / Pb Sätze (weißer Hintergrund) werden den Spalten 6 und 7. Die verbleibenden Spalten 8-24 aufgenommen, sind spezifisch für eine der siebzehn Pr / Pb-Sets. Die Proben werden auf Zeilen AP aus den Spalten 6-24 (schwarze Pfeile) zugegeben. Die beiden Bohrungen (O5, P5) am unteren Rand des Spalte 5 erhalten nur Wasser und Master-Mix. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

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Abb. 2: Das Layout für ein 96-Loch-Source-Platte mit siebzehn Pr / Pb-Sets Zielzahl bezieht sich auf eine Pr / Pbgesetzt. Schwarze Pfeile zeigen, wenn ein Pr / Pb-Set ist mit mehreren Vertiefungen gegeben. NTC-Mischungen in die Kavitäten pipettieren (dunkelgrau Hintergrund) aufgenommen. Die beiden Bohrungen (F3, G3) mit diagonalen Linien werden nicht verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

figure-results-3
Abbildung 3: Schematische Darstellung der einzelnen Schritte in der qRT-PCR Assay-Protokoll AE Diagramm wählen Teile des Protokolls.. (A) Schritt 1: Herstellung der Standardverdünnungsreihen. (B) Schritt 2: Herstellung von Pr / Pb und NTC Arbeitsstammmischungen. (C) Schritt 3.1: Herstellung einer 96-Well-Platte Arbeitsvorräte der Pr / Pb-Sets und NTC Mischungen. (D) Schritt 4.1-3: Herstellung der Mischungen für das Laden der 384-Well-Testplatte. (Estep 4.5: Laden des 384-Well-Assayplatte. Zeichnungen sind von links oben nach rechts unten zu lesen. Reagenzien für die Interferon (IFN) Assay bei -20 ° C gelagert und sind in der linken Spalte aufgelistet ist; Linien separate Aktionen im Protokoll. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

figure-results-4
Abbildung 4: Das IFN-Expression Signatur in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) menschliche unterscheidet sich in Abhängigkeit von den für die Stimulation verwendeten PBMCs wurden mit TLR-Liganden stimuliert, und RNA wurde nach qRT-PCR-Analyse geerntet TLR-Liganden.. Die geometrischen Mittel der Peak-Antworten zu Poly I: C (25 ug / ml) auf 8 h (rote Quadrate), LPS (10 ng / ml) bei 4 h (grüne Dreiecke), Imiquimod (10 uM) bei 16 h ( lila Diamanten), CpG (1 uM) an16 Stunden (schwarze Kreise), und nicht-stimulierten Kontrolle bei 16 Stunden (blaue Kreise) von 6 Spendern werden in log 10 Skala als Funktion der Ausdruck der HKG UBC ΔCq (links) gezeigt, oder als Kopienzahl pro ug RNA (rechts) . IFN-α-Subtypen werden nach der phylogenetischen Plot der Aminosäuresequenzähnlichkeit geordnet. Diese Zahl wurde ursprünglich in Immunologie und Zellbiologie 27 veröffentlicht.

figure-results-5
Abb. 5: Die Rhesusaffen IFN-Expression Signatur in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) unterscheidet sich in Abhängigkeit von den für die Stimulation von PBMC drei Rhesusaffen (durch das Quadrat, Diamant und Dreieck bezeichnet) verwendet TLR-Liganden wurden aus Vollblut isoliert und C (50 ug / ml) oder Imiquimod (10 ug / ml): mit Lipopolysaccharid (LPS) (10 ug / ml), Poly-I stimuliert. Die Zellen wurden bei 0 h geerntet (open Formen) oder nach 3 h von TLR-Stimulation (geschlossene Form) zur Messung der IFN-Expression. Transcript Ebenen des Typs I, II, und III IFN in log 10 Skala als Funktion der Ausdruck der HKG GAPDH ΔCq (links) oder als Kopiernummer / ug RNA (rechts) angezeigt. Diese Zahl wurde ursprünglich in der Zeitschrift der Interferon und Zytokin-Forschung 28 veröffentlicht.

figure-results-6
Tabelle 1:. Menschen IFN Primer / Sonden-Set Sequenzen und Reaktionsinformationen Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.

figure-results-7
Tabelle 2:. Rhesusaffe IFN Primer / Sonden-Set Sequenzen und Reaktionsinformationen Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.

Plasmid-Konzentration (fM)
A B C D
IFN-α1 25 2.5 0,25 0,025
IFN-α2 25 2.5 0,25 0,025
IFN-α4 2500 250 25 2.5
IFN-α5 25 2.5 0,25 0,025
IFN-α6 250 25 2.5 0,25
IFN-α7 250 25 2.5 0,25
IFN-α8 250 25 2.5 0,25
IFN-α10 25 2.5 0,25 0,025
IFN-α14 25 2.5 0,25 0,025
IFN-α16 250 25 2.5 0,25
IFN-α17 25 2.5 0,25 0,025
IFN-α21 25 2.5 0,25 0,025
IFN-λ1 25 2.5 0,25 0,025
IFN-λ2 25 2.5 0,25 0,025
IFN-λ3 250 25 2.5 0,25
IFN-β 25 2.5 0,25 0,025
IFN-ω 250 25 2.5 0,25

Tabelle 3: Standardverdünnung Satz Konzentration Informationen.

IFN Pr / Pb-Sets hinzugefügt Wassermenge aufgenommen (ml)
NTC 1 IFN-β, -ω, -λ3 85,7
NTC 2 IFN-α1, -α5 100,0
NTC 3 IFN-α2 114,3
NTC 4 IFN-α4 114,3
NTC 5 IFN-α7 114,3
NTC 6 IFN-α6, -α8, -α10 85,7
NTC 7 IFN-α14, -α16 100,0
NTC 8 IFN-α17 114,3
NTC 9 IFN-α21, -λ1 100,0
NTC 10 IFN-λ2 114,3

Tabelle 4: NTC Arbeits Lager mischt Informationen.

Diskussion

Dieser Bericht beschreibt Design, Chargenproduktion, und einen Ansatz zur Analyse eines Assays, um die Transkription einer Reihe von sehr ähnlichen Genen in einer Forschungslaborumgebung zu messen. Die Hochdurchsatz-qRT-PCR Assay die hier berichtet misst die IFN- und - λ-Subtypen mit hoher Spezifität. Bei diesem Verfahren werden zwei wichtige Aspekte, die Gestaltung von Pr / Pb-Sets, die zwischen den Mitgliedern einer homologen Genfamilie und der Entwicklung einer Produktionsplattform für die Erstellung von zuverlässigen und konsistenten 384er Testplatten mit den Pr / Pb-Sets vorinstalliert diskriminieren. Die qRT-PCR-Sonden enthalten einen strukturellen (MB) oder chemische (LNA) Ansatz zur Verbesserung ihrer Spezifität 29. Für zwei der Primersätze in Rhesus Assay (Tabelle 2) wurde die Amplifikation Refractory Mutation System (ARMS) in die Primersequenzen enthalten, um die Spezifität weiter zu verbessern 30. Zwar ist es in der Regel am besten, Exon-Exon-Verbindungen zu ENHA Zielnz Spezifität eines qRT-PCR-Reaktion war das nicht möglich, weil der Typ I IFN-Gene fehlen Introns. Daher wird genomische DNA in die PCR-Reaktion amplifiziert werden, und müssen von einer DNase-Behandlung nach der RNA-Extraktion beeinträchtigt werden.

Die Zielregion für die Pr / Pb Sets wurde zu den codierenden Regionen der reifen Peptids für jede IFN beschränkt. Aufgrund der hohen Sequenzähnlichkeit zwischen den IFN-α-Subtypen, insbesondere der reifen Peptidregion, war es manchmal erforderlich, um die Empfindlichkeit zu beeinträchtigen, um die Spezifität sicherzustellen. Dies war insbesondere der Fall bei IFN-α17, wo das reife Peptid Transkript hat nur vier einzigartigen Basen, wenn gegen die anderen IFN-α-Subtypen verglichen. Targeting IFN-α17 erforderlich Primern, die Transkripte mehrerer Subtypen binden, Einschränkung Spezifität der Sonde. Als Folge davon wird die PCR-Reaktion anderen Subtypen als IFN-α17 verstärken, wodurch ein wesentlicher Prozentsatz der PCR-Reagenzien und loweri aufwendigng die Amplitude des Fluoreszenzsignals aus der spezifischen Sonde für IFN-α17. Eine zusätzliche Herausforderung zur Gestaltung von sensitiven und spezifischen Pr / Pb-Sets für sehr ähnliche Gene wie dem IFN ist die Möglichkeit, dass die annotierte Sequenzen in der GenBank-Datenbank möglicherweise nicht vollständig oder Informationen zum Zeitpunkt der Konstruktion. Auch dies war eine Herausforderung für die IFN-α17, in denen neu kommentierte Sequenzen nicht perfekt mit der Version der Sequenz in der Datenbank zum Zeitpunkt der Konstruktion anzupassen. Daher bei der Gestaltung Pr / Pb-Sets für Gene, die nicht intensiv untersucht haben, ist es ratsam, regelmäßig die neuesten kommentierte Sequenz eines Zielgens. Schließlich ist es notwendig, sicherzustellen, dass die Pr / Pb Sätze nicht Pseudogene, die transkribiert werden kann, aber nicht umge amplifizieren.

Nach der Entwicklung der Pr / Pb-Sets, ist die nächste Herausforderung Optimierung der PCR-Bedingungen von siebzehn verschiedenen Pr / Pb oder setzt auf einer 384-Well-Platte. Transcript Standards sind wich-tant bei der Prüfung der Spezifität eines Pr / Pb-Set und eine wesentliche Rolle bei der Harmonisierung der qRT-PCR-Bedingungen der zahlreichen verschiedenen PCR-Reaktionen. Testen eines Pr / Pb-Set gegen die Niederschrift Standards stellt seine Effizienz und Empfindlichkeit; Plasmide, die sehr ähnliche Pseudo ausdrücken kann notwendig sein, um sicherzustellen, dass die Pr / Pb gesetzt misst selektiv die Transkription des funktionalen Gens. Die Niederschrift Standards bieten auch ein quantitatives Mittel der Analyse (Zahl der Transkripte), zusätzlich zu den semi-quantitative Analyse relativ zu einem Housekeeping-Gen (ΔCq).

Roboterkanalpipetten aus einer 96-well Quellenplatte in mehrfache 384-well-Assayplatten verbessert die Genauigkeit und Konsistenz der Plattenzwischenergebnisse. Lachssperma-DNA (ssDNA) als Träger, die stabilisiert und bewahrt die Pr / Pb-Sets für die Langzeitlagerung verwendet, ebenso wie das Trocknen der Reagenzien in den Platten entfallen. Trocknen der Platten verringert auch das Volumen des Reaktionserforderlich für reproduzierbare Ergebnisse, was wiederum bewahrt wertvollen Proben und verringert die Verwendung von teuren Reagenzien. Durch diese Schritte werden Chargen von Platten montiert, die Präzision und Konsistenz für mehr als sechs Monate ist.

Nach Plattenherstellung, sind Maßnahmen zur Qualitätskontrolle entscheidend für die Konsistenz einer Charge von Platten zu überprüfen. Zu diesem Zweck sind vier zusätzliche Sätze von Standards auf einer Platte laufen. Die "5-fach Standard" Platte verfolgt Leistung und erzeugt eine Datenmenge, auf die Standards eines Individuums Schild verglichen. Während zehn 10-fache Verdünnungen jeder Standard in Assay-Design verwendet werden, erfordern Platzgründen, dass vier Punkte für die Standardkurve auf jeder Testplatte für die 5-fach Standard-Platte verwendet, und. Zusätzlich sollte eine positive Kontrolle auf jeder Platte enthalten sein, um die Gültigkeit der Platte zu gewährleisten.

In der Regel dauert es 3-4 Stunden bis sechs Testplatten von einer Pr / Pb s vorbereitenource Platte; es ist möglich, zwölf Platten an einem einzigen Tag in einem Forschungslabor vorzubereiten. Da jeder humanen IFN-Subtyp Assayplatte untersucht siebzehn Pr / Pb-Sets und kann fünfzehn experimentellen Proben unterzubringen, ein Tag der Montage entsteht ein Stapel von Platten mit einer Kapazität bis zu 3.060 experimentellen Datenpunkte generieren. Rohdaten aus der qRT-PCR-Plattform bearbeitet werden können und mit der Programmierung Skripte in einem Tabellenkalkulationsprogramm-Software, um eine vordefinierte Analysevorlage automatisch füllen montiert. Diese Methode minimiert praktische Dateneingabe, wodurch verhindert wird, Kopierfehler und erlaubt es dem Forscher, auf die Datenanalyse, anstatt Daten Montage konzentrieren. Wie hier beschrieben, kann diese Hochdurch qRT-PCR-Assay verwendet, um die Expression von Interferon-Subtypen in der Human- oder Rhesusaffe Proben zu messen und könnte angepasst werden, dass andere Arten oder homologe Gene-Sets verwendet werden. Die Flexibilität des Plattenlayout kann der Benutzer ändern Primer / Sonde setzt, um die Gene von SchneiderInteresse zu einem bestimmten Zelltyp oder Modellsystem. Dieser Assay kann verwendet werden, um IFN-Expression Signaturen in Zellkulturmodellen studiert Pathogenen oder in Patientenproben im Rahmen des Erkrankungsmodellen gemessen, um die Signalmechanismen, die an der Immunantwort beteiligt aufzuklären.

Offenlegungen

VPM und RLR sind Miterfinder der Technologie zur Messung der Expression von IFN- und IFN-Subtypen und zur Ableitung von Lizenzeinnahmen. Die übrigen Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom CBER / FDA-NIAID / NIH Interagency Vereinbarung YI-AI-6153-01, FDA / CBER intra-Fonds und der FDA Medical Gegen Initiative unterstützt. TCT, MNB, VPM, LMS und KDK wurden von einer Berufung in die Forschung Beteiligungsprogramm in der Mitte für Biologics Evaluation und Forschung durch den Oak Ridge Institut für Pädagogik der Naturwissenschaften durch eine Interagency Abkommen zwischen den USA Departmen für Energie und den USA verwaltet unterstützt Food and Drug Administration.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,2 ml PCR-Röhrchenstreifen Eppendorf (Westbury, NY, USA)E0030 124 286
12-Kanal 384 Equalizer Elektronische Pipette, 0,5-12,5 ulThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)14-387-139*Eingestellt
12-Kanal 384 Equalizer Elektronische Pipette, 1-30 ulThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)14-387-137*Eingestellte
12-Kanal Elektronische Pipette, 5-250 ulThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)14-387-118*Abgekündigtes
2,0-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, sterilCelltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA)229446
Elektronische 8-Kanal-Pipette, 15-1250 ulThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)14-387-115*Abgekündigte
Einweg-Reagenzreservoire VWR International (Radnor, PA, USA)89094-66825-ml-Reservoire mit 2 Teilern
E-ZentrifugeWealtec Corp. (Sparks, NV, USA)1090003
Eukaryotische 18S rRNA (18S)Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)Hs99999901_s1Rhesus HKG Primer/Sonden-Set
Mini-VortexerThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)02-215-360
Gasdurchlässige selbstklebende PlattendichtungThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)AB-0580Einweg-Plattendichtung, die während des Plattenvorbereitungsprozesses verwendet wird 
Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH)FBR (Silver Spring, MD, USA)Sonderanfertigunghumaner HKG Primer/Sonde Set
Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH)Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)Rh02621745_g1Rhesus HKG Primer/Sonde Set
Hudson Solo automatisierter Mehrkanal-Pipettierer Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)800200Modifiziert mit einem 384-Well-Kühlnest
Linearisierte Plasmide (IFN-Gene)Aldevron (Fargo, ND, USA)SonderanfertigungArtikel 3000, 3580; wird für Assay-Standards verwendet 
LNA-InhibitorenExiqon (Woburn, MA, USA)Sonderanfertigungsartikel500100
LNA-SondenSigma-Proligo (St. Louis, MO, USA)SonderanfertigungMaterialnummer VC00023
Matrixfiltrierte Pipettenspitzen, 12,5 ulThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)14-387-193
Matrixfiltrierte Pipettenspitzen, 30 μlThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)14-387-196
Matrix TallTip Pipettenspitzen mit verlängerter Länge, 1.250 μlThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)14-387-160
Matrix TallTip Pipettenspitzen mit verlängerter Länge, 250 μlThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)14-387-152
MicroAmp Optische 384-Well-Reaktionsplatte mit Barcodevon Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)4309849
MicroAmp Optical 96-Well-Reaktionsplattefür angewandte Biosysteme (Foster City, CA, USA)N8010560
MicroAmp Optical Adhesive FilmApplied Biosystems (Foster City, CA, USA)4311971Klebefolie, die zum Versiegeln der Platte vor dem qRT-PCR-Lauf verwendet wird 
Microsoft Excel 2010 TabellenkalkulationMicrosoft (Redmond, WA, USA) Office 2010Visual Basic-Programmiersprache
MixMate Vortex MixerEppendorf (Westbury, NY, USA)5353 000.0142-dimensionales Platten-Vortex-Gerät
Molecular Beacon ProbesFBR (Silver Spring, MD, USA)Sonderanfertigung
PCR-Kühler, eisloses Kühlsystem für 96-Well-Platten und PCR-RöhrchenEppendorf (Westbury, NY, USA)Z606634-1EA
Plattentrockner (Verteiler)Mechanical and Electrical Design Fabrications, NIH Office of Research Services (Bethesda, MD, USA)Sonderanfertigung
Primer-SetsFBR (Silver Spring, MD, USA)Sonderanfertigung
pUC57 Plasmid DNAGenescript (Piscataway, NJ, USA)SD1176
Rnase-freie 1,5 ml Mikrofuge-RöhrchenLife Technologies (Grand Island, NY, USA)AM12400
RNase-freie DNase Set (50)Qiagen (Valencia, CA, USA)79254
RNase HNew England Biolabs (Ipswitch, MA, USA)M0297L
RNeasy Mini Kit (250)Qiagen (Valencia, CA, USA)74106
Roboterspitzen (durchsichtige Spitze, vorsterilisierte Pipettenspitzen)Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)800350-S
Lachsspermien-DNA-LösungInvitrogen (Carlsbad, CA, USA)15632-011
SoftLinx Version VHudson Robotics (Springfield, NJ, USA)SonderanfertigungSoftware zur Programmierung von Pipettierschritten
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), ohne AmpErase UNGLife Technologies (Grand Island, NY, USA)4352042
ABgene Klebeplattendichtungen   Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)AB0580
Ubiquitin C (UBC)Angewandte Biosysteme (Foster City, CA, USA)Hs01871556_s1Humanes HKG Primer/Sonden-Set
Verso cDNA-Synthese-KitThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)AB1453B
ViiA 7 Real-Time PCR SystemApplied Biosystems (Foster City, CA, USA)4453536
Water-Ultra PureQuality Biological, INC. (Gaithersburg, MD, USA)351-029-101
Zipvap 384 (Heizelement für Plattentrockner)Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, USA)384-109APlattentrockner

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