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Methodenartikel

Bewertung der Tumor-infiltrierenden Leukozyten-Untergruppen in einer subkutanen Tumormodell

20K Ansichten

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DOI:

10.3791/52657

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13. April 2015

 ,  ,  ,  , 
1Division of Oncology, Department of Medicine, Washington University School of Medicine, 2Palo Alto Institute for Research and Education, Veterans Affairs Palo Alto Health Care System, 3Laboratory of Immunology and Vascular Biology, Department of Pathology, Stanford University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur detaillierten Bewertung von Leukozyten-Untergruppen innerhalb der Tumormikroumgebung in einem Maustumormodell. Chemerin-exprimierende B16-Melanomzellen wurden subkutan in syngene Mäuse implantiert. Zellen aus der Tumormikroumgebung wurden dann gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert, was eine detaillierte Analyse der Leukozyten-Untergruppe ermöglichte.

Zusammenfassung

Spezialisierten Immunzellen, die Tumorumgebung infiltrieren regulieren das Wachstum und Überleben von Neoplasie. Maligne Zellen müssen entziehen oder zu untergraben Anti-Tumor-Immunantwort, um zu überleben und zu gedeihen. Tumoren profitieren Sie von einer Reihe von verschiedenen Mechanismen der Immun "Escape", einschließlich der Rekrutierung von tolerogenen DC, immunsuppressive regulatorischen T-Zellen (Tregs) und myeloische abgeleitete Suppressorzellen (MDSC), die zytotoxische Antitumor-Reaktionen hemmen. Umgekehrt können Anti-Tumor-Effektor Immunzellen das Wachstum und die Ausdehnung von malignen Erkrankungen verlangsamen: immunstimulatorische dendritische Zellen, natürliche Killerzellen, die angeborenen Tumorimmunität beherbergen, und zytotoxischen T-Zellen alle in der Tumorsuppression beteiligt. Die Balance zwischen pro- und anti-Tumor-Leukozyten letztlich bestimmt das Verhalten und das Schicksal der transformierten Zellen; eine Vielzahl von klinischen Studien am Menschen haben dies getragen heraus. Somit detaillierte Analyse Leukozytenuntergruppen innerhalbder Tumor-Mikroumgebung ist zunehmend wichtig geworden. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Analyse infiltrierenden Leukozyten im Tumormikromilieu in einem Maus-Tumormodell vorhandenen Teilmengen. Maus-B16-Melanomtumorzellen wurden subkutan in C57BL / 6-Mäuse inokuliert. Zu einem bestimmten Zeitpunkt, wurden Tumoren und der umgebenden Haut en bloc reseziert und in Einzelzellsuspensionen, die dann für die Multi-Farb wurden Durchflusszytometrie verarbeitet. Mit einer Vielzahl von Leukozyten-Untergruppe Marker, konnten wir die relativen Prozentsätze der zu infiltrieren Leukozyten-Untergruppen zwischen Kontrolle und Chemerin-exprimierenden Tumoren zu vergleichen. Forscher kann ein solches Werkzeug zu verwenden, um die Immun Anwesenheit im Tumor-Mikroumgebung und als mit herkömmlichen Sattelgrößenmessungen von Tumorwachstum in Verbindung, wird möglicherweise damit sie die Auswirkungen von Veränderungen der Immunzusammensetzung auf das Tumorwachstum zu erhellen studieren. Eine solche Technik kann auf jede Tumormodell angewendet werden, in dem der Tumor und seiner Mikro cein reseziert und verarbeitet werden.

Einleitung

Die Balance zwischen Tumorwachstum und die Förderung und Regression ist, teilweise abhängig von der Balance zwischen pro- und anti-Tumor-infiltrierenden in der Mikroumgebung 1,2 vorhanden Leukozyten. Um die Tumorumgebung zu studieren (TME) und spezifisch identifizieren infiltrierenden Leukozyten-Subpopulationen, ein Verfahren zur Auswertung von subkutanen Tumoren entwickelten wir in einem Mäusetumormodell. Die Bedeutung der Untersuchung der Tumor-Mikroumgebung ist gut bekannt und in der Literatur gestützt. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass das Gleichgewicht von pro- und anti-Tumor-infiltrierenden Immunzellen können die Ergebnisse der das Tumorwachstum nicht nur in der Maus, sondern auch Studien am Menschen (in 3,4 prüft) auswirken. B. Curiel et al. Zeigten, dass verschlechterten klinischen Ergebnisse bei Eierstockkrebspatienten wurden mit der Anwesenheit von steigenden Prozent tumorinfiltrierender regulatorischen CD4 + T-Zellen (Treg) 5 korreliert. Unsere eigene Arbeit zeigte auch die Wirkung eines nichtvel Leukozyten Chemolockstoff auf dem Verhältnis der Leukozyten-Untergruppen in einem Maus-Melanom-Modell 6, die ebenfalls korreliert mit verringerten Tumorwachstum. Somit werden die detaillierten Analysen der Leukozyten-Untergruppen innerhalb eines Tumors nun allgemein anerkannt und mehr an Bedeutung.

Es gibt viele Möglichkeiten, um die Tumor-Mikroumgebung für das infiltrierende Leukozyten zu bewerten; zB Gruppen transgenen Mäusen entwickelt, um verschiedene fluoreszierende Proteine, um Bild die TME 7, klassische Immunhistochemie und Immunfluoreszenz der erhaltenen Abschnitte 8, einschließlich der verschiedenen bildgebenden Verfahren wie MRI, PET, konfokale Mikroskopie 9-11 Ausdruck bringen - einige mit der Möglichkeit, intravital 10,12 überwachen. Diese können mit verschiedenen molekularen Bildgebungsmittel, wie Nanopartikel 13 oder neuartige Kontrastmittel 14, die Immunzellen Etikett verwendet werden. Unsere Methode ist eine Durchflusszytometrie-basierten Ansatz und hat mehrere Vorteile.Erstens kann der gesamte Tumor-Mikro abgetastet werden; bei der Analyse wird das gesamte subkutane Tumor und dem umgebenden Peripherie operativ zum Verarbeiten reseziert. Dies beseitigt jegliche potentiell Abtasten Bias innerhalb eines einzigen Tumor und gibt eine "globale" Analyse des Tumors als Ganzes. Zweitens, mit mehrfarbigen Durchflusszytometrie, um die Leukozyten-Untergruppen analysieren, ermöglicht es uns, genauer zu messen den Phänotyp infiltrieren Leukozyten. Abhängig von der Anzahl der verwendeten Farben können sehr spezifische Untergruppen identifiziert werden. Dies ist wichtig, da es mehrere Leukozyten-Untergruppen in einem bestimmten Zelltyp - oder gar in einem allgemeinen Untertyp Klassifizierung - die unterschiedlichen Funktionen, die bei der Bestimmung des Schicksals des Tumors potenziell signifikante sind zu haben. Zum Beispiel haben plasmacytoid dendritischen Zellen (PDC) in Tumorimmunität 15 in Verbindung gebracht. Jedoch ist die CCR9 + Untergruppe von pDCs wurde gezeigt tolerogenen 16 sein, und Verschieben des baLanze einer solchen Untergruppe kann einen Einfluss auf das Tumorwachstum.

Unsere Methode ist für die subkutane oder andere Tumoren, die en bloc reseziert werden können, geeignet. In unseren Händen, wurden Tumoren einheitlich zum Zeitpunkt der Euthanasie reseziert. Jedoch ist es denkbar, wie in einigen Studien durchgeführt worden, daß eine subkutane Tumor konnte vollständig Verschluss der umgebenden Haut in einem Überlebens Operation 17 reseziert werden, was eine zusätzliche Auswertung des Tieres. Die Analyse wird dann an der resezierten Tumorgeführt. So sind die Ergebnisse stellen einen einzigen Zeitpunkt in der Entwicklung des Tumors. Während dies ermöglicht einen detaillierten Einblick in die Mikroumgebung, es ist auch ein statisches Bild von dem, was ist ohne Zweifel ein dynamischer Prozess. Jedoch isolierten Leukozyten (zB über magnetische Trennung oder Dichtegradientenzentrifugation) können dann separat von der Tumor Epithel und Stroma analysiert werden, oder in anderen, funktionelle Assays verwendet werden, um ihr Erscheinungsbild weiter zu definieren, wie bereits Previ hatlaufend beschrieben 18. Dieses Verfahren wäre dann nützlich irgendeinem Forscher interessiert die Analyse der Zusammensetzung der Leukozyten innerhalb der Tumormikroumgebung zu einem gegebenen Zeitpunkt zu sein, ob die Einstellung des natürlichen Krankheitsverlaufs oder nach einer bestimmten therapeutischen Störung. Obwohl nicht von uns durchgeführt, könnte Variationen dieses Verfahrens möglicherweise auch verwendet, um bestimmte Abschnitte eines Tumors in Isolation zu analysieren. Beispielsweise in Anbetracht der Größe des Tumors, die Randzone (n) kann von der zentralen, ggf. nekrotischen Kern des Tumors präpariert eine räumlich getrennte Ansicht der Tumor-Mikroumgebung, die Forscher zu ergeben.

In dem aufstrebenden Gebiet der Tumorimmunologie, gibt es keinen Zweifel, eine exponentiell wachsende Anzahl von Studien zur Bewertung neuartiger immunmodulatorischer Wirkstoffe in murinen Tumormodellen sein. Mehrere Berichte haben die Unterschiede in bestimmten Leukozyten-Funktion innerhalb des Tumors gegenüber dem peripheren en hervorgehobenUmwelt. Beispielsweise Shafer-Weaver et al. Zeigten, in einem Mausmodell, das Antigen-spezifischen T-Effektorzellen CD8 + Zellen, während in der Peripherie aktiv, wurden in CD8 + T-Suppressor-Zellen umgewandelt werden, wenn sie in die Tumorumgebung 19 verschleppt. Dies war teilweise auf TGFß, aber andere Faktoren sind wahrscheinlich ebenso beteiligt. Somit Auswerten Leukozytenuntergruppen - Zahlen und Verhältnisse sowie Funktionszustand - im Tumor selbst wird eine genauere Darstellung der Wirkung eines bestimmten Immunmodulation auf Tumor Schicksal.

Unsere Technik erlaubt eine detaillierte Analyse des Tumors und stellt dem Forscher die Möglichkeit, Veränderungen in der Leukozyten-Populationen als frühere Ansätze genauer identifizieren.

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Protokoll

HINWEIS: Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit genehmigten Stanford, Palo Alto VA HCS und National Institutes of Health Institutional Animal und Verwenden Ausschuss Leitlinien.

1. Vorbereiten der Probengewinnung und Verarbeitung (Zeitaufwand: ~ 10-15 min)

  1. Inokulieren murine B16F0-Melanomzellen (0,5-1 x 10 6) subkutan an oder nahe der Mittellinie des Bauches in weibliche C57BL / 6-Mäusen, wie zuvor 6 beschrieben. Alternativ inokulieren Tumorzellen an zusätzlichen anatomischen Stellen (zB Flanke Brustfettpolster, etc.).
    HINWEIS: Eine beliebige Anzahl von Tumoren (implantiert oder spontane) verwendet und ausgewertet werden mit diesem Protokoll. Beispielsweise können andere häufig verwendete syngenen Tumoren in C57BL / 6 sind die Doppelpunkt Linie MC38, Lewis-Lungenkarzinom (LLC) und die Prostata TRAMP-C2 Linie. Während menschlichen Xenotransplantaten in immundefiziente Mäuse inokuliert können auch auf diese Weise ausgewertet werden, sei darauf hingewiesen, dass die profiles der Tumor-infiltrierenden Leukozyten wird notwendigerweise gemß der immundefiziente Zustand des Host-Maus verändert werden.
    1. Verwenden Sie Vollmedien (zB RPMI mit 10% FBS und Additive) oder einem anderen geeigneten Protein-Puffer (zB HBSS oder PBS + 1% FBS oder 1% BCS). Chill-Medien oder Puffer auf 4 ° C vor der Euthanasie.
  2. Up Sammelröhrchen und Filter für resezierten Tumoren gesetzt; legen diese auf Eis.
    1. Verwenden Sie eine 50 ml konischen Röhrchen pro Tumor reseziert werden. Legen Sie eine 40-70 um Zellsuspension Filter in jedem. Alternativ können Sie auch 15 ml konische Röhrchen mit Metallfiltergewebe. Verwenden Sie ein 5 ml Spritzenkolben oder dicken Stift, um einen becherförmigen Filter an der Spitze der 15-ml-Tube erstellen.
  3. Bereiten Instrumente zur Resektion und Tumor Verarbeitung; benutzen chirurgische Pinzette und einer feinen Schere zu resezieren und Prozess Tumoren. Verwenden Sie 70% Ethanol zu reinigen Instrumente zwischen Resektionen / Tumorproben. Für größere Zahl of Proben (zB> 10), empfehlen wir die gleichzeitige Verarbeitung von Proben, die von mehreren Forschern, signifikante Unterschiede in der Verarbeitungszeit zwischen Tumorproben zu vermeiden.

2. Tumorentfernung (Zeitaufwand: ca. 5 min / Tumor)

  1. Euthanize B16 tumortragenden Mäusen einzeln mit Kohlendioxid oder einem anderen zugelassenen Verfahren.
  2. Sichern Sie die Maus auf eine chirurgische Bühne. Sprühen Sie den Tumorbereich mit 70% Ethanol und wischen Sie überschüssiges aus; dies hilft, die Verbreitung von gegenwärtigen Haare zu verhindern. Für Nicht-Nacktmäusen, Rasur die Haut Gebiet rund um den Tumor vor der Resektion nach Bedarf.
  3. Mit einer Pinzette und Schere, Resektion des subkutanen Tumor en bloc, einschließlich darüber liegenden und der umgebenden Haut. Die Höhe der "margin" Haut aufgenommen variiert werden kann, aber in der Regel 2-3 mm reseziert der Haut um den Tumor.
    1. Wiegen resezierten Tumoren (+/- umgebende Haut) an dieser Stelle. Legen Sie die reseziert Haut / Tumorbereich im Filter im pl gesichertastic konischen Rohr.

3. Vorbereitung einer einzelnen Zelle Tumor Suspension (Zeitaufwand: ~ 5-7 min / Tumor)

  1. Verwenden einer Pinzette und Schere, um Tumor und darüberliegenden / umgebende Haut Blatt vor den Mund. Mince die Probe mit einer Schere, bis alle großen Teilen von Gewebe werden in 1-2 mm Abschnitte verarbeitet.
    Hinweis: In der Regel ganze Tumoren verarbeitet werden; Alternativ kann für größere Tumore, repräsentativen Schnitten von Tumoren konnte zerkleinert und verarbeitet werden.
  2. Verwendung eines Kolbens aus einem Wegwerf 5 oder 10 ml-Spritze, mechanisch disaggregiert des zerkleinerten Tumorgewebe gegenüber dem gesicherten Filter.
  3. Mit einer Pipette, waschen Sie die verarbeitet Tumorgewebe mit 5-10 ml kaltem Medium oder Puffer. Dadurch werden die einzelnen Zellen durch den Filter zu spülen.
  4. Wiederholen der obigen zwei Schritte mehrmals, so dass die Gesamtanzahl und die Mengen der Wasch etwa gleich sind für ähnlich großen Tumoren.
    1. Nach dem Waschen der verarbeiteten Tumorgewebe beobachtenkleine Fragmente von Haut und / oder anderes Bindegewebe, sollte bei dem Filter verbleiben.
    2. Alternativ für Tumore, bei denen mechanische Disaggregation allein nicht ausreichend sein, die Verdauung mit Collagenase und / oder andere Enzyme können vor dem Zerkleinerungsverfahren durchgeführt werden. Dies wird für eine gründlichere Einzelzellsuspension zu ermöglichen. Es sollte jedoch angemerkt, dass derartige Verdauung Protokolle können Oberflächenantigen-Expression 20 beeinflussen, so dass Vorsicht ist bei der Interpretation dieser Ergebnisse gemacht werden kann.
  5. Waschen und Pellet die Zellen durch Zugabe von Medien / Puffer und Zentrifugation bei 4 ° C 500 xg für 5 min.

4. FACS Färbung der Einzelzellsuspension (Zeitaufwand: ~ 30-60 min)

  1. Die Zellen in eiskaltem FACS-Puffer (PBS + 1% FBS).
  2. Graf lebensfähigen Zellen unter Verwendung von Trypanblau und einer Hämozytometer oder automatisierten Zellzählers.
  3. Bestimmen Sie die Gesamtkeimzellausbeute pro Volumen. Diese Daten können verwendet werden, um zu extrapolierenabsolute Zahlen tumorinfiltrierender Leukozyten in Kombination mit FACS-Daten.
  4. Bestimmen der Anzahl von Zellen, gefärbt und durch FACS analysiert. Dies wird durch verschiedene Faktoren (zB Tumorhistologie Typ, Tumor Alter und Größe, durchschnittliche Prozentsatz der infiltrierenden Leukozyten, etc.) beeinflusst werden.
    HINWEIS: In B16 Melanom, fanden wir einen geringen Prozentsatz an Tumor-infiltrierenden Leukozyten (TIL, typischerweise <5%) im Vergleich zu Tumorzellen. Somit sind zumindest 1 x 10 6 gesamt (Tumor infiltrierenden Leukozyten +) Zellen wurden typischerweise über FACS zur Analyse gesammelt.
    1. Mit Hilfe der Trypanblau gefärbten Zähldaten, um berechnete Volumen von Zellen für FACS gefärbt werden. Wenn zum Beispiel TIL machen typischerweise 5% der Gesamttumorzellen (viele der Tumorzellen tot auf Trypanblau-Färbung sein kann), um Faktor dieses in der Gesamtzahl der Tumoreinzelzellsuspension gefärbt.
    2. Für weniger häufig Leukozytenuntergruppen zB CCR9 + PDC) verwenden, eine größere Anzahl von insgesamt Tumorzellen (Beispiel 2-3 x 10 6) für die FACS-Färbung, angesichts der relativ geringen Häufigkeit dieser Zellen in der Einzelzellsuspension.
  5. Färben Sie das Tumoreinzelzellsuspension für FACS.
    1. Für Live / Dead-Diskriminierung, verwenden Sie eine fixierbare Fleck oder nicht feststellbar Fleck (zB Propidiumiodid) verwendet werden. Wenn Zellen ohne Live / Dead Diskriminierung gebeizt, muss Vorsicht geboten gegeben werden das Potenzial für nicht-spezifische Bindung von Antikörpern.
    2. Flecken auf der Zellsuspension für spezifische Leukozyten-Untergruppen mit einem Standard-FACS-Färbung Protokoll. Block-Zellen auf nicht-spezifische Antikörperbindung mit PBS / FBS, das 1% Rattenserum und Fc Block (anti-CD16 / 32) für 10 Minuten vor der Antigen-spezifische Antikörper-Färbung zu vermindern. Fügen Sie die richtigen Isotypenkontrolle Antikörper, um sicherzustellen, Färbung spezifisch ist.
    3. An diesem Punkt, nachdem der FACS-Färbung abgeschlossen ist, zu fixieren Proben mit 4% Formaldehyd oder ähnliche Fixiermittel. Proben bei 4 ° C in der dark (wie zum Abschrecken der Fluorophore zu vermeiden) werden bis zur Sammlung und Analyse.
      HINWEIS: Speichern fester Proben für lange Zeiträume kann zu einer Veränderung in der Signalstärke und der Fluorophore 21 führen.
    4. Sammeln Sie die Proben mit einem Durchflusszytometer. Optimale Durchflusszytometer Einstellungen werden je nach Art des Instruments und Laser / Detektor-Setup ändern.
      HINWEIS: Zusätzlich kann es Variabilität zwischen Experimenten auch bei Verwendung der gleichen Maschine sein. So führen Sie die entsprechenden Maschineneinrichtung (zB mit der Kalibrierung Perlen) eine angemessene Entschädigung Einstellung vor der FACS Sammlung und Analyse von jedem Versuch zu gewährleisten.
  6. Analyse leukoctye Teilmengen
    1. Mit FACS Datenanalyse-Software, die Daten zu analysieren. Für eine lebend / tot-Färbung, starten durch Gating aus toten Zellen. Verwenden Sie Antikörpers gegen ein Leukozyten-spezifischer Marker (zB Anti-CD45) auf Leukozyten innerhalb der lebenden Zellen zu identifizieren.
      1. Danach verwenden verschiedene gating Systemen an bestimmte Untergruppen zu identifizieren, in Abhängigkeit von dem Färbungsprotokoll. Um beispielsweise CD4 + T-Zellen zu identifizieren, wählen Sie die SSC lo Region aus der CD45 + Population und wählen Sie die CD19-CD3 + Zellen; aus dieser CD4 + T-Zellen identifiziert werden, 22.
    2. Analysieren von Daten und präsentieren sie in einer Reihe von verschiedenen Möglichkeiten, um die Konsistenz zu gewährleisten und bestimmte Muster oder Trends (dh, Gesamtzahlen, Prozentsätze oder Verhältnisse auf Teilmengen zu quantifizieren).
      HINWEIS: Zum Beispiel haben wir uns mit Gesamtlebend CD45 + Zellen in Prozent der Gesamttumorzellen gesammelt (Abbildung 1). Zusätzlich haben wir dann den prozentualen Anteil der einzelnen Leukozyten-Untergruppe (beispielsweise CD4 + T-Zellen) innerhalb des Tumors berechnet und diese als Verhältnisse zwischen den Kontroll- und Testgruppen (Abbildung 3).

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Ergebnisse

Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Überexpression von Chemerin in murine B16-Tumoren gezwungen Augmented den Prozentsatz an Tumor-infiltrierenden Leukozyten (TILs). Zusätzlich Änderungen des relativen Verhältnisses der Leukozyten-Untergruppen innerhalb der Tumormikroumgebung Chemerin Expression assoziiert dargestellt wurden identifiziert. Re-Print mit Erlaubnis von Pachynski et al. 6.

1 zeigt, dass es eine signifikante Zunahme der gesamten CD45 + Zellen (T...

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Diskussion

Darstellende detaillierte Analyse der Tumor-Mikroumgebung ist kritisch bei der Bestimmung der Mechanismen und Wirkungen der Immunmodulation. Mit der zunehmenden Anwesenheit von Immuntherapeutika in der menschlichen klinischen Bereich, das Verständnis der Auswirkungen dieser Mittel auf die Tumor-infiltrierenden Leukozyten immer erforderliche in ihrem Wirkmechanismus definieren. Beim Menschen gibt oft existieren klinische und / oder logistischen Schwierigkeiten bei der Beschaffung und Analyse von Tumorgewebe für die Leuko...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse R01-CA169354 unterstützt   und R01-047822   von den National Institutes of Health und Merit Award aus dem Department of Veterans Affairs (EZB). RKP wurde vom NIH T32 CA009287-30A1, einem ASCO Young Investigator Award, California Breast Cancer Research Project Fellowship, und ein American Cancer Society Mentorierte Forschung Scholar Grants unterstützt; BAZ wurde vom NIH Zuschusses AI079320 unterstützt. JM wurde von Stipendien von NIH T-32 Ausbildungsförderung T32-AI07290- 25. T32-AI07290-24 und American Cancer Society Post-Doc-Stipendium PF-12-052-01-CSM unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
RPMICellgro10-040http://cellgro.com; keep on ice
FBSCellgro35-011-CVhttp://cellgro.com
50 ml konische RöhrchenFalcon14-432-22fischersci.com
40 μ m filterFalcon08-771-1fischersci.com
5 ml SpritzeBD14-823-35fischersci.com
chirurgische Schere/PinzetteRobozRS-5910roboz.com
PBSCellgroMT-21-030-CMhttp://cellgro.com; keep on ice
trypan blueCellgroMT-25-900-CIfischersci.com
HämazytometerHausser Scientifice 02-671-54 fischersci.com
Lebende/tote FleckenLife TechnologiesL34957lieftechnologies.com
FlowJo SoftwareTreeStar, Incflowjo.com

Referenzen

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Tumorinfiltrierende LeukozytenDurchflusszytometrische AnalyseB16 MelanomzellenLeukozyten Subset MarkerEinzelzellsuspensionMehrfarben DurchflusszytometrieAnalyse der TumormikroumgebungProfiling von ImmunzellenChemerin exprimierende Tumore
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