Schwimmende Mammosphären-Assays können die Untergruppe von stammähnlichen Brustkrebszellen untersuchen, die unter Suspensionsbedingungen überleben und eine erhöhte Tumorgenese zeigen, wenn sie in Mäuse implantiert werden. Dieses Protokoll bietet eine bequeme in vitro Messung der kugelbildenden Fähigkeit, einen Proxy für die in vivo Tumorgenese, und erleichtert gleichzeitig die Analyse der stammassoziierten Transkriptionslandschaft.
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Methodenartikel
Mammosphere Formation Assay von Menschen Brustkrebs Geweben und Zelllinien
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Ähnlich wie bei gesunden Geweben, viele Blut und solide Tumore sind jetzt vermutlich hierarchisch organisiert werden, mit einer Teilmenge der stielartigen Krebszellen, die selbst zu erneuern, während, die zu differenzierteren Nachkommen. Das Verständnis und die Ausrichtung dieser Krebsstammzellen bei Brustkrebs, die verstärkt Chemo- und Strahlenresistenz im Vergleich zu den nicht-Stammtumormasse besitzen kann, ist zu einem wichtigen Forschungsgebiet. Die mammosphere Assay wurde auch bekannt durch ihre Fähigkeit, im Nachhinein zu ermitteln kugel- verwendet: Markierungen einschließlich CD44, CD24 und ALDH-Aktivität kann unter Verwendung von Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) prospektiv isolieren Zellen, die eine verbesserte Tumorigenität anzuzeigen, wenn in immunsupprimierten Mäusen implantiert beurteilen bildenden Zellen, die aus einzelnen Stammzellen wie Klone zu entwickeln. Hier beschreiben wir Ansätze für die entsprechende Kultivierung mammospheres von Zelllinien oder primären Patientenproben, ihren Passagieren und Berechnungen zur Sphäre f schätzenorming Effizienz (SFE). Zuerst diskutieren wir wichtige Überlegungen und Fallstricke in der entsprechenden Planung und Auslegung von mammosphere Experimente.
Einleitung
Die Existenz von Tumorzelllinien durch stielartigen Krebsstammzellen geleitet hat wesentlich zum Verständnis der Tumorheterogenität aufgenommen. Während einige phänotypische Vielfalt in Tumoren nicht aus der klonalen Auswuchs von genetisch unterschiedlichen Klone entstehen, wird ein wesentlicher Bestandteil von epigenetischen Unterschiede ergeben: Krebszellen zwischen Stammzellen, Vorläufer und differenzierte Staaten über die Aktivierung oder Unterdrückung der spezifischen Gens (manchmal auch reversibel) übergehen kann Ausdruck Programme 1-3. Dies kann Zelle intrinsische oder extrinsische Faktoren widerspiegeln, was die Genexpression Programm, das gerade in einer Zelle mit ihrer resultierenden autokrine Signalisierung in Verbindung mit parakrinen Signalisierung von benachbarten Krebs, Stromazellen oder Immunzellen liefert modulierende Faktoren exprimiert und microenviromental Bedingungen, wie der Grad der Hypoxie 2,4,5.
Obwohl innovative Linie Tracing Ansätzeavancieren unsere Fähigkeit, vermeintliche Krebsstammzellen in ihrer in vivo Nische 6 studieren - 8, bleiben Kugel bildenden Tests zu einem beliebten und bequemen Umgang mit potenziellen Brustkrebszellen 'schätzen, wie Stammzellen zumindest unter den Testbedingungen verwendet verhalten. Es wird häufig neben retrospektiven Verfahren zur Reinigung von Krebsstammzellen verwendet wird, durch ihre Expression von Membranmarker CD44 und CD24 9 und Aktivität des Enzyms ALDH (Aldehyd Dehydrogenase) 10, Marker, die vorgeschlagen wurden, um entsprechen mehr mesenchymal- und epithelialen -ähnliche Krebsstammzellen bzw. 11. Die Kugelbildung Ansatz wurde zuerst als Neurosphäre Assay entwickelt, um somit das Wachstum von putativen Stammzellen aus einzelnen Klonen in nichthaftenden, serumfreien Bedingungen mit der Zugabe von epithelialen Wachstumsfaktor (EGF) 12, wobei später nutzbringend auf normalen und kanzerösen angewendet Brustgewebe.
Die Identität der Kugel bildenden Gründerzelle, und die gemischten Zelltypen, aus denen die Kugel Masse, sind für die Folgerungen, die sich aus Mammographie oder andere Kugel bilden Tests gemacht werden können relevant. Langfristige Ruheknochen fide Stammzellen, gedacht, um in G0-Phase ruhen, nicht die genaue Kombination von Faktoren, die Aktivierung in vivo begünstigen würde zu erleben. Die mammosphere Assay ermöglicht stattdessen das Wachstum von Zellen entweder balanciert für mitotische Teilung oder bereits Division 13. Diese Vorläuferzellen, die aber nicht eine wirklich ruhende Zelle kann die Zell-Stadium, die mit den im Test verwendeten EGF und basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) Mitogene vermehrt sein. Trotzdem enthalten sie eine Reihe von aktivierten Stammzellen-assoziierten Signalwege 14. Darüber hinaus ist die Geschwindigkeit ihrer Entstehung betrifft die Tumorigenität der Gewebe sie abgenommen hat, wenn sie durch ihre Wirksamkeit in begrenzter Verdünnung Assays in Maus-Xenotransplantaten 2,15,16 gemessen </ Sup>.
Hier stellen wir ausführliche Protokolle um einzelne Zellen zu isolieren, und zum Generieren von Primär mammospheres sowohl von menschlichen Brustkrebs-Zelllinien und klinischer Proben von Brusttumoren. Wir beschreiben auch, wie serielle Passagen von Primär mammospheres durchführen, um die Selbsterneuerung zu bewerten und wie zu berechnen Sphäre Bildungseffizienz, die einen Vergleich zwischen verschiedenen Einsaatdichten (siehe Schema in Abbildung 1) ermöglicht.
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Protokoll
Die Verfahren sind speziell ethisch von Imperial College, London zugelassen.
1. Erzeugung von Primär Mammospheres von menschlichen Brustkrebszelllinien
HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte unter einer Sterilkultur Kapuze.
- Bereiten Mammosphere Medien DMEM / F12 mit 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin, 100 U / ml Streptomycin. Bereiten komplettem Medium unmittelbar vor der Verwendung durch Zugabe von 20 ng / ml rekombinanten menschlichen epidermalen Wachstumsfaktor (EGF; Sigma), 10 ng / ml rekombinantem humanem basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF; R & D Systems) und 1x B27 Supplement.
- Absaugen Medien aus Kolben mit adhärenten MCF-7 oder MDA-MB-231-Zellen (oder eine Brustkrebszelllinie Ihrer Wahl; 70-80% Konfluenz), waschen zweimal in 1x PBS und trypsinieren Zellen.
- Zentrifuge Zellen bei 200 · g bei Raumtemperatur für 5 min. Dekantieren und resuspendieren Zellen in 5.1 ml mammosphere Medien. Pipettenach oben und unten und ggf. mit einer 40 um Zellsieb Kappe Filter auf Einzelzellsuspension zu erhalten. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um sicherzustellen, eine Einzelzellsuspension gebildet hat (wenn nicht, verwenden Sie eine 25 G Nadel, um die Zellsuspension bis 3 mal spritze).
- Ggf. Isolat CD44 + CD24- Zellmenge über FACS unter Verwendung von Anti-CD24-Phycoerythrin (PE) und Anti-CD44-Fluoresceinisothiocyanat (FITC) -Antikörper 9. Alternativ zu isolieren, wie Bevölkerung mit einem Magnetrührer aktivierte Zellsortierung (MACS) System mit Anti-CD44 und anti-CD24-Biotin kombinierten Mikroperlen nach Herstellerangaben. Führen Sie eine positive Selektion mit LS Spalten und negative Selektion mit LD Spalten und bestätigen Sie die Phänotypen aller isolierten Zellen mittels Durchflusszytometrie 17.
- Berechnung der Anzahl der lebensfähigen Zellen pro ml unter Verwendung von Trypanblau.
HINWEIS: Die Lebensfähigkeit der Zellen wird als die Anzahl der lebensfähigen Zellen innerhalb der Gitter geteilt durch die Gesamtzahl der Zellen an der hemocy berechnetenMeter. Zellen, die bis zu Trypanblau gelten als nicht lebensfähig. Das folgende Verfahren wird verwendet, um genau zu bestimmen Anteil der lebensfähigen Zellen.- Bereiten Sie eine 0,4% ige Lösung von Trypanblau in PBS. Fügen Sie 0,1 ml Trypanblau-Stammlösung zu 1 ml der Zellen. Legen Sie eine Zählkammer und unverzüglich zu untersuchen unter dem Mikroskop bei geringer Vergrößerung. Zählen die Anzahl der Gesamtzellen und der Anzahl der blauen Färbung Zellen.
Lebensfähige Zellen = [1.00 - (Anzahl der blauen Zellen ÷ Anzahl der gesamten Zellen)] × 100. - Um die Anzahl der lebensfähigen Zellen pro ml Kultur zu berechnen, verwenden Sie die folgende Formel. Denken Sie daran, für den Verdünnungsfaktor zu korrigieren.
Anzahl der lebensfähigen Zellen × 10 4 × 1,1 = Zellen / ml Kultur
- Bereiten Sie eine 0,4% ige Lösung von Trypanblau in PBS. Fügen Sie 0,1 ml Trypanblau-Stammlösung zu 1 ml der Zellen. Legen Sie eine Zählkammer und unverzüglich zu untersuchen unter dem Mikroskop bei geringer Vergrößerung. Zählen die Anzahl der Gesamtzellen und der Anzahl der blauen Färbung Zellen.
- Resuspendieren eine vorgegebene Menge an Zellen in 2 ml Komplett mammosphere Medien in jede Vertiefung einer 6-Well-Ultra-Low-adhärenten Platte. Die Aussaatdichte beträgt normalerweise 500-4000 Zellen / cm 2 Zelle pro Vertiefung. Optional Verwendung low Aufsatz 24-Well-Platten, während Impfen Zellen mit gleicher Dichte in 0,5 ml Medium.
HINWEIS: Wir empfehlen, die Optimierung der Aussaatdichte und Zeit der Kultur für jeden Zelllinien von Interesse. - Für 5-10 Tage (abhängig von der Zelllinie und der Größe mammospheres) Inkubieren ultra low-Anlage 6-Well-Platten bei 37 ° C und 5% CO 2, ohne die Platten zu stören, insbesondere während der Wachstumsphase der ersten 5 Tage .
2. Erzeugung von Primär Mammospheres von Human Breast Cancer klinischen Proben
HINWEIS: Menschliche Brustkrebsgewebe von Patienten einer Operation zur Entfernung von Brusttumoren erhalten werden. Speicher Gewebe auf Eis für bis zu 24 h in 50 ml sterile Röhrchen in Kulturmedien, die 100 U / ml Penicillin und 100 U / ml Streptomycin. Führen Sie folgende Schritte im Rahmen einer Sterilkultur Kapuze.
- Übertragen der Probe in eine 100 mm Gewebepetrischale mit einem kleinen Volumen von Medien. Remove das Fettgewebe mit Hilfe einer sterilen Schere, Skalpell und Pinzette.
- Fügen Sie 2-3 ml DMEM / F12 und Blatt vor der Probe in 1 mm 3 Stück mit einem sterilen Skalpell oder einer Rasierklinge, bis keine großen Stücke bleiben.
- Resuspendieren der Gewebestücke in vorgewärmter 10 ml DMEM mit proteolytischen Enzymen (3.000 U / ml Kollagenase und 1.000 U / ml Hyaluronidase) und bei 37 ° C in einem Rotationsschüttler, bis alle Gewebefragmenten verdaut werden. In der Regel vollständige Verdauung dauert 1-3 Stunden. Stellen Sie die Kochzeit nach pathologischen Zeichen von Tumoren. (Zum Beispiel Brust-Adenokarzinom ist in der Regel schwerer zu verdauen, verglichen mit muzinösen Karzinomen, die empfindlicher ist und benötigt kürzere Aufschlusszeit). Bewerten Sie den Grad der Verdauung jede halbe Stunde durch die Beobachtung 20 ul Suspension unter Zählkammer.
- Ermöglichen die Fragmente für 5 min sedimentieren, dann den Überstand in einem 15 ml konischen Polypropylen-Röhrchen und zentrifugiert bei 200 g für 10 min bei Raum temtur. Dekantieren Sie vorsichtig von den Überstand und resuspendieren Zellen in 1-5 ml mammosphere Medien.
- Folgen Sie den oben für Zelllinien zu erhalten und plattenEinzelZellSuspensionen beschriebenen Schritte 1,1-1,4. Pass-Zellen durch die Spritze 25 G für bis zu 2-mal, wenn notwendig, schädlichen Zellen zu begrenzen.
3. Mammosphere Forming Wirkungsgrad (%) Berechnung
- Nach der Kulturzeit, zählen die mammospheres (größer als 40 um) Durchmesser unter einem Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung. Digital Bild 5 zufälligen Feldern mit einer Digitalkamera auf einem Lichtmikroskop und bestimmen den mammospheres Größe mit der Erfassungssoftware. Verwenden Sie eine Bildanalyse-Software.
- Berechnen Mammosphere Bildungseffizienz (MFE%) mittels der folgenden Gleichung:
MFE (%) = (Anzahl der mammospheres pro Vertiefung) / (Anzahl der Zellen pro Vertiefung ausgesät) x 100
4. Serien Passagieren von Mammospheres zur Bewertung der Selbsterneuerung
- Pipette die Medien, die die mammospheres aus jeder Vertiefung in eine 15-ml-Tube. Waschen Sie die Vertiefungen mit PBS und fügen Sie den gesammelten Medien. Zentrifuge bei 115 × g für 10 min bei Raumtemperatur.
- Überstand verwerfen und das Pellet in 500 ul vorgewärmtem 0,5% Trypsin / 0,2% EDTA. Inkubationszeit von 2-3 min.
- Fügen Sie 500 ul FCS Trypsin zu neutralisieren. Zentrifuge bei 500 × g für 5 min. Überstand verwerfen und Pellet in 100 ul mammospheres Medien, Auf- und Abpipettieren zu Kugeln zu zerlegen.
- Zählen Sie die Zellen mit Hämozytometer und festzustellen, ob Zellen in Einzelzellsuspension. Wenn nicht durch eine 25 G passieren Spritze bis zu 3 mal, um Einzelzellen zu erhalten. Samen, die Zellen in eine neue Ultra Low-Befestigung 6-Well-Platte mit der gleichen Dichte im Primärerzeugung verwendet.
- Nach 5-10 Tagen rechnen Bereichen> 40 & mgr; m und berechnen Sphäre Bildungseffizienz mit Hilfe der Formel bereits berichtet.
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Ergebnisse
Verschiedene Proben oder Personen unterschiedlichen Behandlungen unterworfen wird, kann die Anzahl der mammospheres> 40 um, die nach der Normalisierung für Ausgangszellen ausgesät bilden variieren. Berechnen mammosphere Bildungseffizienz (MFE) für jede Behandlung in drei Exemplaren gezüchtet. Dies ermöglicht Experimente mit verschiedenen Einsaatdichten verglichen werden. Die Daten werden am besten auf einem Balkendiagramm dargestellt, idealerweise mit Positiv- und Negativkontrollen, und die Anzeige der Standardabweic...
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Diskussion
Erfolgreiche Bewertung der primären und sekundären mammospheres stützt sich auf Zellen, die bei ausreichend niedrigen Dichten, die Form mammospheres von Einzelklonen, mit minimalen Bereich Aggregation überzogen. Jedoch bei Dichten, die zu niedrig sind, können zu wenige mammospheres bilden, um die Auswirkungen der Behandlungen statistisch unterscheiden. Für jede Zelllinie verwendet, da sie erheblich in ihrer Sphäre bildet Effizienz variieren können, sollten Aussaatdichte optimiert werden (die niedrigen E-Cadherin exprimi...
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass es keinen Interessenkonflikt gibt, der als Beeinträchtigung der Unparteilichkeit dieses Artikels angesehen werden könnte.
Danksagungen
Diese Arbeit wird von der kaiserlichen BRC, dem Nationalen Institut für Gesundheitsforschung und Krebsbekämpfung mit besonderer Erwähnung Hilary Craft und Sir Douglas Myers unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 | Lonza | CC-3151 | |
| 2 mM L-Glutamin | Sigma Aldrich | G8540 | |
| 100 U/ml Penicillin & Streptomycin | Sigma Aldrich | P4083 | |
| 20 ng/ml Rekombinanter humaner epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 | |
| 20 ng/ml Rekombinanter humaner basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) | R& D systems | 233-FB-025 | |
| 1x B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Thermo Scientific | 12399902 | |
| 0,5 % Trypsin/0,2 % EDTA | Sigma Aldrich | 59418C | |
| Fötales Kälberserum | First Link UK | 02-00-850 | |
| Trypanblau | Sigma Aldrich | 93595 | |
| 6-Well-Platten mit geringem Aufsatz | Corning | CLS3814 | |
| Kollagenase Typ 1A | Sigma Aldrich | C9891 | |
| Hyaluronidase | Sigma Aldrich | H3506 | |
| Sterile Rasierklingen | Fisher Scientific | 12443170 | |
| Steriles Skalpell | Fisher Scientific | 11758353 | |
| Sterile Mikrodissektion Schere | Sigma Aldrich | S3146 |
Referenzen
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