Auf Papier basierende Vorrichtungen zur Isolierung und Charakterisierung von extrazellulärer Vesikel

Summary

Diese Protokollinformationen ein Verfahren zur extrazellulären Vesikeln (EVs), kleine membranöse Teilchen aus Zellen freigesetzt zu isolieren, von so wenig wie 10 ul Serumproben. Dieser Ansatz umgeht die Notwendigkeit von Ultrazentrifugation, nur wenige Minuten von Testzeit erfordert und ermöglicht die Isolation von Elektrofahrzeugen aus Proben von begrenzten Mengen.

Abstract

Extrazellulären Vesikeln (EVs), membranartige Partikel aus verschiedenen Arten von Zellen freigesetzt, halten ein großes Potenzial für die klinische Anwendung. Sie enthalten von Nukleinsäuren und Proteinen Ladung und werden zunehmend als Mittel zur interzellulären Kommunikation sowohl eukaryote und prokaryote Zellen verwendet erfasst. Aufgrund ihrer geringen Größe, aktuelle Protokolle zur Isolierung von Elektrofahrzeugen sind oft zeitaufwendig, umständlich und erfordert große Probenvolumina und teure Ausrüstung, wie zum Beispiel einer Ultrazentrifuge. Um diese Einschränkungen zu begegnen, haben wir eine papierbasierte Immunaffinitäts Plattform zur Trennung von Untergruppen von Elektrofahrzeugen, die einfach, effizient ist und erfordert Probenvolumen von nur 10 & mgr; l. Biologische Proben können direkt auf Papier Testzonen, die chemisch mit Fängermolekülen, die eine hohe Affinität zu bestimmten EV Oberflächenmarker haben die modifiziert wurden, pipettiert werden. Wir bestätigen die Assays unter Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie (SEM), auf Papierbasis enzymgebundenen immunosorbent-Tests (P-ELISA) und Transkriptom-Analyse. Diese Papier-basierte Geräte ermöglichen das Studium von Elektrofahrzeugen in der Klinik und der Forschung Einstellung zu helfen unser Verständnis von EV-Funktionen in Gesundheit und Krankheit.

Introduction

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind heterogene membranöse Partikel mit einer Größe von 40 nm bis 5.000 nm und werden von vielen Zelltypen aktiv über verschiedene Biogenese-Routen^{freigesetzt 1-9}. Sie enthalten einzigartige und ausgewählte Untergruppen von DNA, RNA, Proteinen und Oberflächenmarkern aus Elternzellen. Ihre Beteiligung an einer Vielzahl zellulärer Prozesse, wie z. B. interzelluläre Kommunikation¹⁰, Immunmodulation¹¹, Angiogenese¹², Metastasierung¹², Chemoresistenz¹³ und die Entwicklung von Augenkrankheiten⁹, wird zunehmend anerkannt und hat ein großes Interesse an ihrem Nutzen in diagnostischen, prognostischen, therapeutischen und grundlegenden biologischen Anwendungen geweckt.

EVs können klassisch als Exosomen, Mikrovesikel, apoptotische Körper, Onkosomen, Ektosomen, Mikropartikel, Telerosomen, Prostatosomen, Kardiosomen und Vexosomen usw. kategorisiert werden, basierend auf ihrer Biogenese oder zellulären Herkunft. Zum Beispiel werden Exosomen in multivesikulären Körpern gebildet, während Mikrovesikel durch Knospung direkt aus der Plasmamembran erzeugt werden und apoptotische Vesikel aus apoptotischen oder nekrotischen Zellen stammen. Die Nomenklatur ist jedoch noch zu wenig verfeinert, was zum Teil auf ein mangelndes Verständnis und eine mangelnde Charakterisierung von Elektrofahrzeugen zurückzuführen ist. Zur Reinigung von Elektrofahrzeugen wurden mehrere Methoden entwickelt, darunter Ultrazentrifugation¹⁴, Ultrafiltration¹⁵, magnetische Kügelchen¹⁶, polymere Fällung^17-19 und mikrofluidische Techniken^20-22. Das gebräuchlichste Verfahren zur Reinigung von Elektrofahrzeugen umfasst eine Reihe von Zentrifugationen und/oder Filtrationen, um große Ablagerungen und andere zelluläre Verunreinigungen zu entfernen, gefolgt von einer abschließenden Hochgeschwindigkeits-Ultrazentrifugation, einem Prozess, der teuer, langwierig und unspezifisch ist^14,23,24. Leider ist der technologische Bedarf an einer schnellen und zuverlässigen Isolierung von Elektrofahrzeugen mit zufriedenstellender Reinheit und Effizienz noch nicht gedeckt.

Wir haben ein papierbasiertes Immunaffinitätsgerät entwickelt, das eine einfache, zeit- und kostensparende, aber dennoch effiziente Möglichkeit bietet, Untergruppen von EVs²² zu isolieren und zu charakterisieren. Zellulosepapier, das in eine definierte Form geschnitten wird, kann mit Hilfe von zwei Kunststoffplatten mit registrierten Durchgangslöchern angeordnet und laminiert werden. Im Gegensatz zu der allgemeinen Strategie, die Flüssigkeitsgrenze in papierbasierten Geräten durch den Druck von hydrophobem Wachs oder Polymeren^25-27 zu definieren, sind diese laminierten Papiermodelle beständig gegen viele organische Flüssigkeiten, einschließlich Ethanol. Papiertestzonen werden chemisch modifiziert, um eine stabile und dichte Abdeckung von Fängermolekülen (z. B. zielspezifischen Antikörpern) zu gewährleisten, die eine hohe Affinität zu spezifischen Oberflächenmarkern auf EV-Untergruppen aufweisen. Biologische Proben können direkt auf die Papiertestzonen pipettiert werden, und gereinigte EVs bleiben nach den Spülschritten erhalten. Die Charakterisierung isolierter EVs kann durch REM, ELISA und transkriptomische Analyse erfolgen.

Protocol

Ein allgemeines Diagramm des Betriebs ist in Abbildung 1 zur Verfügung gestellt. Mit ethischen Praktiken, sammelten wir Blutproben von gesunden Probanden und erhalten Kammerwasser-Proben von Patienten durch die Taichung Veterans General Hospital (TCVGH), Taichung, Taiwan unter IRB zugelassen Protokolle ( IRB TCVGH Nr CF11213-1).

1. Herstellung von Papier Material

1. Geschnitten Chromatographiepapier in Kreise von 5 mm im Durchmesser, um das gleiche Layout wie einer 96-Well-Mikrotiterplatte ist. Sandwich diese Papierstücke mit zwei Polystyrolplatten mit einem Stammdurchgangslöchern, und Laminat.
2. Ändern Papier Geräte mit dem in den folgenden Schritten ²⁸ beschrieben chemische Konjugation Verfahren.
   1. Saures Papier Geräte mit Sauerstoffplasma (100 mW, 1% Sauerstoff, 30 sec) in einer Plasmakammer.
      ACHTUNG: Besondere Vorsicht ist bei der Arbeit mit 3-Mercaptopropyltrimethoxysilan und N -γ-Maleimidobutyryloxy Succinimid genommen werden(GMBS), da sie sowohl feuchtigkeitsempfindlich und toxisch sind. Schutzhandschuhe und ein Einatmen zu vermeiden oder mit Haut und Augen zu kontaktieren. Halten Sie die Vorratsflasche fest verschlossen und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur vor dem Öffnen um eine Kondenswasserbildung zu vermeiden Gleichgewicht. Alternativ öffnen Sie die Vorratsflasche in einem mit Stickstoff gefüllten Handschuhbeutel oder Kasten. Aliquot in kleine Fläschchen häufiges Öffnen der Vorratsflasche zu vermeiden.
   2. Unmittelbar inkubieren behandelte Papier Vorrichtungen in einer 4% igen (v / v) Lösung von 3-Mercaptopropyltrimethoxysilan in Ethanol (200 proof) für 30 min.
   3. Papier Geräte Spülen mit Ethanol und Inkubation sie mit 0,01 mmol / ml GMBS in Ethanol für 15 min.
   4. Spülen mit Ethanol (200 proof) und inkubieren Papier Vorrichtungen mit 10 ug / ml Avidin-Lösung in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) für 1 h bei 4 ° C. Lagerung bei 4 ° C, wenn nötig, und innerhalb von 4 Wochen.
3. Befeuchten jeder Papiertestzonen mit 10 ul PBS, enthaltend 1% (w / v) Rinderserumalbumin (BSA) Für 3 x 10 min vor Spek 10 ul biotinylierten Fängermoleküle für 3 x 10 min. Verwenden anti CD63-Antikörper (20 ug / ml in PBS, das 1% (w / v) BSA und 0,09% (w / v) Natriumazid) oder Annexin V (1:20, v / v in Annexin V-Bindungspuffer), wie Fängermoleküle.
4. Abspülen ungebundenen anti-CD63-Antikörper oder Annexin V-Moleküle unter Verwendung von 10 & mgr; l entspricht, PBS, das 1% (w / v) BSA oder Annexin V-Bindungspuffer Lösungen für 3 × 1 min auf.

2. Serum und Kammerwasser Probenerhebung und Datenverarbeitung

1. Serumgewinnung.
   1. Sammeln Sie 10 ml peripheren Blut durch Venenpunktion in Serumtrennröhrchen und sanft das Röhrchen fünfmal. Stellen Sie die Röhre in einer vertikalen Position und für weitere 30 min.
   2. Zentrifuge bei 1200 × g für 15 min. Das Serum von der oberen Schicht in ein sauberes Röhrchen, und erneut zentrifugieren bei 3.000 × g für 30 min.
   3. Übergeben Sie den Überstand durch ein 0,8 um filter. Halten Sie die Probe bei -80 ° C bis zur Verwendung.
2. Kammerwasser Kollektion: sammeln Kammerwasser-Proben von Patienten durch einen Augenarzt direkt durch invasive Verfahren und Lagerung von Proben bei -80 ° C bis zur Verwendung diagnostiziert.

3. Isolierung der extrazellulären Vesikeln

1. Stichproben auf jeder Papiertestzone mit einer Geschwindigkeit von 5 ul / min.
2. Abspülen ungebundenen EVs mit 10 ul entsprechenden PBS, das 1% (w / v) BSA oder Annexin V-Bindungspuffer Lösungen für 3 × 1 min für die Papiervorrichtungen funktionalisiert mit Anti-CD63-Antikörper oder Annexin V-Moleküle sind. Führen Sie die folgenden Downstream-Assays.

4. Downstream Testbeispiel 1: Scanning Electromicrographs

1. Fix EVs auf funktionalisierten Papiertestzone mit 10 ul 0,5 x Karnovsky Fixativ für 10 Minuten eingefangen.
2. Spülen Sie die Proben mit ausreichend PBS für 2 x 5 min.
3. Entwässern derProben mit anschließender 35% Ethanol für 10 min, 50% Ethanol für 2 × 10 min, 70% Ethanol für 2 x 10 min, 95% Ethanol für 2 × 10 min und 100% Ethanol für 4 x 10 min.
4. Critical trocken und Sputter-Beschichtung der Proben mit Palladium / Gold und untersuchen mit einem Rasterelektronenmikroskop bei geringer Elektronenbeschleunigungsspannung betrieben (~ 5 kV).

5. Downstream Testbeispiel 2: Papier-basierten ELISA

1. Fügen Sie ein 5 ul-Lösung, die Anti-CD9 primären Antikörper bei 1: 1000 Verdünnung in PBS zu jeder Testzone, die gefangen genommen EVs. Warten Sie 1 Minute.
2. Mit 30 Spülen Sie die Proben ml PBS bei 100 Umdrehungen pro Minute für 30 Sekunden geschüttelt.
3. Hinzufügen einer 5 & mgr; l Lösung, die Meerrettich-Peroxidase (HRP) -verknüpften-sekundären Antikörper bei 1: 1000 Verdünnung in PBS und 1 min warten.
4. Mit 30 Spülen Sie die Proben ml PBS bei 100 Umdrehungen pro Minute für 30 Sekunden geschüttelt.
5. Hinzufügen eines kolorimetrischen Substrats 5 ul, das 1: 1-Volumenverhältnis von Wasserstoffperoxid eind 3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) und scannen Sie mit einem Desktop-Scanner.

6. Nachgeschaltete Testbeispiel 3: RNA-Isolierung

1. Tauchen Sie die Proben in 35 ul von Polyvinylpyrrolidon-basierte RNA-Isolierung Hilfe und 265 ul Lyse / Bindungspuffer auf EVs erfasst lysieren. Vortex kräftig.
2. In 30 ul Homogenat bei der Isolation Kit zum Lysat zur Verfügung gestellt. Vortex kräftig und auf Eis für 10 Minuten gestellt.
3. Extrahieren der RNA unter Verwendung von Säure in den folgenden Schritten beschrieben, mit Phenol-Chloroform-Trennung.
   1. Nehmen 330 ul Phenol-Chloroform von der Bodenschicht der Flasche und in den Homogenats / Lysat. Vortex kräftig.
   2. Zentrifugieren bei 10000 × g für 5 min. Übertragen Sie die wässrige (obere) Phase in ein sauberes Röhrchen und das Volumen entfernt.
4. Fällt die Gesamt-RNA mit 100% Ethanol das Volumen, das 1,25-fache des Volumens der wäßrigen Phase in der vorhergehenden Stufe und co entfernt istllect die RNA in der Elutionslösung auf 95 ° C vorgewärmt.
5. Eine Konzentration und weiteren Reinigung der RNA unter Verwendung eines RNA-Cleanup Kit nach dem Protokoll des Herstellers.

Results

Die Fähigkeit des Papiers Gerät Gruppen von EVs isolieren stützt effizient auf seine empfindliche und spezifische Erkennung von EV-Oberflächenmarker. Die stabile Modifikation von Papierfasern mit Fängermolekülen wird durch die Verwendung von Avidin-Biotin-Chemie als anderswo ^28-30 beschrieben ist. Die Wirksamkeit der chemischen Konjugation, und dass der Physisorption Verfahren unter Anwendung der fluoreszenzbasierten Auslesungen beurteilt. Die Papier Prüfzonen folgenden Protokoll Schritt 1) ​​mit Ausnahme der...

Discussion

Die wichtigsten Schritte zur erfolgreichen Isolierung von Untergruppen von extrazellulären Vesikeln sind: 1) eine gute Wahl des Papiers; 2) stabile und hohe Abdeckung der Fängermoleküle auf der Oberfläche der Papierfasern; 3) die richtige Handhabung der Proben; und 4) allgemeine Laborhygienemaßnahmen.

Poröse Materialien haben sich in vielen preiswerten und Ausrüstung freien Tests genutzt. Sie haben abstimmbare Porengrße, vielseitige Funktionalität, niedrige Kosten und hohe Oberfläche-zu-Volu...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chromatographie-Papier	GE Healthcare Life Sciences	3001-861	Whatman® Zellulosepapier der Klasse 1
(3-Mercaptopropyl), Trimethoxysilan	Sigma Aldrich	175617	Diese Chemikalie reagiert mit Wasser und Feuchtigkeit und sollte in einem mit Stickstoff gefüllten Handschuhbeutel aufgetragen werden. Augen- und Hautkontakt vermeiden. Atmen Sie keine Dämpfe ein und atmen Sie keine Dämpfe ein.
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818	Absolut, 200 Proof, molekularbiologisches
Rinderserumalbumin (BSA)	BioShop Canada Inc.	ALB001	Oft auch als Cohn-Fraktion V bezeichnet.
N-γ-Maleimidobutyryloxysuccinimidester (GMBS)	Pierce Biotechnology	22309	GMBS ist ein Amin-zu-Sulfhydryl-Vernetzer. GMBS ist feuchtigkeitsempfindlich.
Avidin	Pierce Biotechnology	31000	NeutrAvidin hat 4 Bindungsstellen für Biotin und sein pI-Wert beträgt 6,3, was neutraler ist als natives Avidin
Biotinylierte Maus Anti-Human-Anti-CD63	Ancell	215-030	Klon AHN16.1/46-4-5
biotinyliertes Annexin V	BD Biosciences	556418	Annxin V hat eine hohe Affinität zu Phosphatidylserin (PS)
Primäres Anti-CD9 und sekundäres Antikörper	System Biosciences	EXOAB-CD9A-1	Der Sekundärantikörper ist Meerrettichperoxidis-konjugierte
Serum-Trennröhrchen	BD Biosciences	367991	Gerinnungsaktivator und Gel für die Serumtrennung
Annexin V Bindungspuffer	BD Biosciences	556454	10x; vor Gebrauch auf 1x verdünnen.
TMB-Substrat-Reagenzien-Set	BD Biosciences	555214	Das Set enthält Wasserstoffperoxid und 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB)
[header]
RNA-Isolationskit	Life Technologies	AM1560	MirVana RNA-Isolationskit
Polyvinylpyrrolidon-basiertes RNA-Isolationshilfsmittel	Life Technologies	AM9690	Pflanzliche RNA-Isolierungshilfe enthält Polyvinylpyrrolidon (PVP), das an Polysaccharide bindet.
RNA-Aufreinigungskit	Qiagen Inc.	Das 74004	MinElute RNA-Aufreinigungskit ist für die Aufreinigung von bis zu 45 % ausgelegt. μ g-RNA.
Plasmakammer	March Instruments	PX-250
Rasterelektronenmikroskop	Hitachi Ltd.	S-4300
Desktop-Scanner	Hewlett-Packard Company	Photosmart B110	Es wurden 8-Bit-Farbbilder aufgenommen. Kameras und Smartphones können ebenfalls verwendet werden.
Bildaufzeichnungssystem	J& Es	GeneSys G:BOX Chemi-XX8	aufgenommen. Es können auch Fluroszenmikroskope verwendet werden.