Nutzung der Koloniebildung in Weichagar-Assay auf Inhibitoren der Tumorigenität in Brustkrebs-Zellen zu identifizieren

Sowohl nicht transformierte (normale) als auch transformierte Zellen können sich in einer 2D-Monolayer-Kultur leicht vermehren. Diese Form des adhärenten Zellwachstums unterscheidet sich stark von derjenigen, die in vivo stattfindet, wo sich die Zellen in ihrer Mikroumgebung ohne mitogene Stimulation oft nicht schnell teilen. Der Soft-Agar-Assay hingegen unterscheidet sich von 2D-Kultursystemen, da er die Tumorigenität quantifiziert, indem er die Fähigkeit einer Zelle misst, sich zu vermehren und Kolonien in Suspension innerhalb eines halbfesten Agarosegels^{zu bilden 1}. In dieser Umgebung sind nicht-transformierte Zellen nicht in der Lage, sich ohne Verankerung an der extrazellulären Matrix (ECM) schnell zu vermehren und durchlaufen eine Apoptose, ein Prozess, der als Anoikis bekannt ist. Im Gegensatz dazu verlieren Zellen, die eine maligne Transformation durchlaufen haben, ihre Verankerungsabhängigkeit aufgrund der Aktivierung von Signalwegen wie Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K)/Akt und Rac/Cdc42/PAK. Daher sind diese Zellen in der Lage, innerhalb der halbfesten Weichagar-Matrix² zu wachsen und Kolonien zu bilden.

Eine häufige Verwendung des Soft-Agar-Assays besteht darin, zu testen, ob bestimmte Verbindungen, wie z.B. PADI-Inhibitoren, in der Lage sind, das Tumorwachstum in vitro zu unterdrücken. Im Allgemeinen handelt es sich bei der Koloniezahl oder der Koloniegröße um quantitative Messwerte aus dem Assay, die zwischen Kontroll- und Behandlungsgruppen verglichen werden können, um Unterschiede in der zellulären Tumorigenität zu beurteilen. Wenn man also feststellt, dass die Koloniebildung umgekehrt mit zunehmender Wirkstoffkonzentration korreliert, dann könnte man daraus schließen, dass das Medikament in vitro ein wirksamer Inhibitor der Tumorigenität ist. Auf der anderen Seite, wenn das Medikament die Koloniebildung nicht beeinflusst, ist das Medikament entweder nicht in der richtigen Dosierung oder es ist kein wirksamer tumorigener Inhibitor. Neben der Verwendung eines Soft-Agar-Assays zum Testen der Anti-Tumor-Wirkung eines Medikaments kann dieser Assay auch verwendet werden, um die Beziehung zwischen einem bestimmten Gen und der Tumorgenese zu untersuchen. Zum Beispiel kann der Effekt der Unterdrückung der PADI2-Expression auf die Tumorigenität durch eine PADI2-spezifische siRNA-Behandlung behoben werden.

PADIs sind calciumabhängige Enzyme, die Proteine posttranslational modifizieren, indem sie positiv geladene Argininreste in neutral geladenes Citrullin in einem Prozess umwandeln, der als Citrullinierung oder Deiminierung^3-5 bekannt ist. Wir haben kürzlich herausgefunden, dass Peptidylarginin-Deiminase 2 (PADI2) als neuartiger Brustkrebs-Biomarker fungieren kann und dass PADI-Inhibitoren Therapiekandidaten für Brustkrebs im Frühstadium darstellen⁶. Zum Beispiel haben wir bereits gezeigt, dass ein "pan-PADI"-Inhibitor, Cl-Amidin, die Proliferation von Brustkrebszellen mit Hilfe von 2D-Monolayern unterdrückt und dass der Inhibitor das Wachstum von 3D-Tumorsphäroiden unterdrückt⁶. In diesem Bericht erweitern wir diese Studien und heben den Nutzen des Soft-Agar-Assays hervor, indem wir die Wirksamkeit eines neuen PADI-Inhibitors, BB-CLA, bei der Unterdrückung des Wachstums von MCF10DCIS Brustkrebskolonien testen⁷. Wir stellen fest, dass wir MCF10DCIS Zellen für dieses Experiment verwendet haben, da es sich um onkogene Derivate von nicht transformierten humanen MCF10A-Zellen handelt und weil sie hohe Steady-State-Spiegel des PADI2-Proteins⁸ enthalten. Wir vermuten, dass die enzymatische Aktivität von PADI2 eine Schlüsselrolle bei der Tumorigenität dieser Zelllinie spielt und dass die BB-CLA-vermittelte Hemmung der PADI2-Aktivität das Fortschreiten der Krebserkrankung unterdrückt

1. Herstellung von 3% 2-Hydroxyethyl Agarose

1. In einem sauberen, trockenen 100 ml-Glasflasche, fügen Sie 0,9 g 2-Hydroxyethyl Agarose (Agarose VII), gefolgt von 30 ml destilliertem Wasser.
2. Mikrowelle die Mischung für 15 Sekunden und leicht schwenken. Wiederholen Sie diesen Schritt mindestens drei weitere Male, bis die Agarose-Pulver vollständig auflöst.
3. Autoklavieren der Lösung enthaltende Flasche für 15 min.
4. Lassen Sie die Agarose-Lösung auf RT vor der weiteren Verwendung abkühlen. Bewahren Sie die Lösung bei RT.

2. Herstellung der Unterschicht: 0,6% Agarosegel

1. Vorwärmen mehrere 5 ml und 10 ml-Pipetten in einem Inkubator bei 37ºC, um die Agarose erstarrt in der Pipette bei der Handhabung zu verhindern.
2. Teilweise lösen Sie die Flaschendeckel und Mikrowelle die vorgefertigten 3% 2-Hydroxyethyl Agarose-Lösung für 15 Sekunden. Dann sanft schwenken Sie die Lösung und Mikrowelle für weitere 15 sec. ACHTUNG: Seien Sie vorsichtig beim Schwenken des agarose Lösung, da die Lösung erhebt sich an der Luft und können überschwappen.
3. Wenn es Rest festes Gel in der Flasche, Mikrowelle für ein paar Sekunden.
4. Halten Sie die Flasche mit der Agarose-Lösung in einem 45 ° C Wasserbad während der nächsten Schritte, um die Agarose-Lösung verfestigt vorzeitig zu verhindern.
5. Warm MCF10DCIS Medien in einem 37 ° C Wasserbad. Anmerkung: MCF10DCIS Medien besteht aus DMEM / F12, 5% Pferdeserum, 5% Penicillin-Streptomycin.
6. Übertragungs 3 ml der 3% igen Lösung unter Verwendung der vorgewärmten Pipetten in einem sterilen 50 ml konischen Röhrchen.
7. Sofort im 12 ml warmem MCF10DCIS Medien und vorsichtig umdrehen das konische Röhrchen, um die Agarose mit den Medien zu mischen. Versuchen Sie nicht, alle Blasen zu bilden, wie es mit der Koloniezahl später stören.
8. Vorsichtig 2 ml dieser Mischung in jede Vertiefung einer 6-Well-Kulturplatte hinzufügen, ohne die Bildung von Luftblasen.
9. Inkubieren Sie die 6-well-Kulturplatte horizontally auf einer flachen Oberfläche bei 4 ° C für 1 Stunde, damit die Mischung zu verfestigen.
10. Nachdem die Mischung sich verfestigt, legen Sie die Platte in einem 37 ° C Inkubator für 30 Minuten. Die untere Schicht ist jetzt einsatzbereit.

3. Herstellung der zellhaltigen Schicht: 0,3% Agarosegel

1. Trypsinize MCF10DCIS Zellen und verdünnen, um eine Zellkonzentration von 4 x 10 ⁴ / ml.
2. Nehmen Sie 2 ml der 3% igen mit vorgewärmten Pipetten und Überführung in eine sterile 50 ml konischen Röhrchen.
3. Sofort an den konischen Rohr 8 ml MCF10DCIS Medien und vorsichtig umdrehen, um die Agarose mit den Medien zu mischen. Vermeiden Sie bilden keine Blasen.
4. Nehmen Sie 2 ml der MCF10DCIS Zellen (4 x 10 ⁴ / ml) und behandle mit BB-CLA (0 uM (DMSO) oder 1 & mgr; M).
5. In einem 1: 1-Verdünnung, Mischen der Zellen mit 0,6% Agarose.
6. Nimm 1 ml der Zelle-Agarose-Mischung und schonend hinzuzufügen auf die untere Schicht der 6-Well-Kultur pspät (2 x 10 ⁴ Zellen / ml).
7. Platzieren Sie die 6-well-Kulturplatte horizontal auf einer flachen Oberfläche bei 4 ° C für mindestens 15 Minuten, damit die obere Schicht zu verfestigen.
8. Nachdem die Mischung sich verfestigt, legen Sie die Platte in einem 37 ° C Inkubator für eine Woche vor der Zugabe des Fütterungsschicht.

4. Vorbereitung der Feeder-Schicht: 0,3% Agarosegel

1. Mikrowelle die vorgefertigten 3% 2-Hydroxyethyl Agarose-Lösung für 15 Sekunden. sanft schwenken Sie die Lösung und Mikrowelle für weitere 15 sec.
2. Äquilibrieren Sie die Agarose-Lösung Flasche in einem 45 ° C Wasserbad.
3. Wärmen Sie die MCF10DCIS Medien in einem 37 ° C Wasserbad.
4. Mix 1 ml 3% Agarose-Lösung mit 9 ml warmem MCF10DCIS Medium in einem 50 ml konischen Röhrchen und vorsichtig umgedreht, um die Agarose zu den Medien mischen. Vermeiden Sie Luftblasen bilden.
5. Behandlung der Mischung mit BB-CLA (0 & mgr; (DMSO) oder 1 & mgr; M).
6. Vorsichtig 1 ml dieser Mischung (ohne fürming Blasen) in jedes Well der 6-Well-Kulturplatte, die den Boden und weichen Schichten.
7. Platzieren Sie die 6-well-Kulturplatte horizontal auf einer flachen Oberfläche bei 4 ° C für mindestens 15 min, die Mischung zu verfestigen.
8. Nachdem der Feeder-Schicht erstarrt, legen Sie die Platte in einem 37 ° C Inkubator.
9. Wiederholen Sie diese Prozedur Zufuhr wöchentlich durch Überlagerung von 1 ml 0,3% Agarose / mittel / Behandlungslösung auf den vorhandenen Futterschicht, um die Zellen mit neuen Medien aufzufüllen, bis die Koloniebildung beobachtet. Hinweis: Agar in den weichen und Feeder-Schichten sehr weich ist, und daher wird die zugesetzten Nährstoffe aus der Feeder-Schicht leicht in die Zellen enthaltende Schicht diffundieren, um die Zellen zu erreichen.

5. Data Collection

1. Nach 2,5 Wochen Zellwachstum in dem weichen Agar, zählen die Anzahl der Kolonien in jeder Vertiefung unter Verwendung eines Lichtmikroskops. Um eine Quantifizierung zu ermöglichen, drucken Sie ein Raster auf eine Transparenz und befestigen Sie das Raster, um die6-Well-Platte, um zu lokalisieren, wo die Zellen während der Zählung sind. Da Koloniegröße (wie durch den Durchmesser jeder Kolonie quantifiziert) variiert vordefinieren eine Referenzkoloniegröße zu bestimmen, welche Kolonien erzielt wird. Beispielsweise umfassen Koloniegrößen von 70 um oder in der Datenanalyse größer.
2. Lagern die Proben bei 4 ° C weiter Koloniebildung und für zukünftige Zählung zu verhindern. Verschließen Sie den 6-Well-Kulturplatte mit Parafilm, um die Gele vor dem Austrocknen zu verhindern.

Die Koloniebildung in Weichagar-Assay kann für eine breite Palette von Anwendungen dokumentieren die Tumorigenität von Krebszellen verwendet werden. Ein Hauptvorteil dieser Technik ist, dass die halbfeste Matrix selektiv begünstigt das Wachstum von Zellen, die in einem verankerungsunabhängigen Weise vermehren können. Diese Eigenschaft wird hauptsächlich durch die Krebszellen, aber nicht von normalen Zellen zeigten. Verwendet werden vor allem diese Technik, um die Wirksamkeit der Hemmung des Tumorwachstums durch Medikamente zu testen und um den Effekt der Überexpression oder Erschöpfung der Gene von Interesse, einschließlich PADI Gene zu testen, auf die Tumorigenität von Brustkrebszellen. Hier untersuchten wir die Wirkung von CLA auf die BB-tumorigenen Hemmung PADI2 überexprimierende MCF10DCIS Zellen (Abbildung 1 und 2).

Die Ergebnisse zeigen, daß BB-CLA die Bildung MCF10DCIS Zellen abgeleiteten Kolonien deutlich hemmt. 3 zeigt, dass in Gegenwart eines PADI Inhibitor, t Hier war eine Reduktion sowohl der Koloniebildung und Koloniegröße, verglichen mit der DMSO-Kontrolle. [Anmerkung:. BB-CLA wurde in DMSO gelöst und auf diese Weise wurde DMSO als Kontrolle] Die Grße der Kolonien für BB-CLA behandelt MCF10DCIS Zellen wurden überwiegend im Bereich von 20 bis 100 um, während die Größe der Kolonien auf die DMSO Steuer zeigte einen größeren Bereich von 70 bis 150 & mgr; m nach 2,5 Wochen Wachstum.

Kolonien von mehr als 70 um wurde gezählt und analysiert (Abbildung 4). Es war ein Durchschnitt von 3536 Kolonien in der DMSO-Kontrolle während nur 1.967 Kolonien wurden in der BB-CLA behandelten Gruppe nach 2,5 Wochen der Soft-Agar-Kultur gesehen. Dies stellt eine 44% ige Abnahme der durchschnittlichen Koloniebildung in Gegenwart von 1 uM BB-CLA, was auf eine signifikante Hemmung der tumorigenen Brustkrebszellen (MCF10DCIS Zellen) durch den PADI Inhibitor.

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Abbildung 1: Chemische Struktur von BB-CLA.

Abbildung 2. Schematische Übersicht des Protokolls für die Koloniebildung in Weichagar-Assay. Jede Vertiefung der 6-Well-Kulturplatten wurde zunächst mit 0,6% Agarose-Gel (untere Schicht) beschichtet. Ein 0,3% iges Agarosegel Mischung die MCF10DCIS Zellen und entweder das BB-CLA-Inhibitor (1 & mgr; M) oder DMSO (Kontrolle) enthielt, wurde dann auf der Oberseite der 0,6% igen Gel geschichtet. Einmal in der Woche wurde die 0,3% Agarose-Gel-Mischung (enthaltend BB-CLA) auf der weichen Schicht zugegeben. Nach 2 bis 4 Wochen wurde die Koloniebildung beobachtet und für die Datenanalyse gezählt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Bilder der Koloniebildung in BB-CLA-behandelten MCF10DCIS Cells. MCF10DCIS Zellen wurden in Weichagar in der Gegenwart (1 & mgr; M BB-CLA) oder Abwesenheit von BB-CLA (0 uM DMSO) gewachsen. Nach 2,5 Wochen Kolonien wurden mit einem inversen Mikroskop mit geringer Vergrößerung für Bilder und ein Lichtmikroskop auf hoher Vergrößerung Bilder abgebildet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4. Quantifizierung MCF10DCIS Koloniezahl nach BB-CLA Behandlung. MCF10DCIS Zellen wurden in Weichagar mit unterschiedlichen Konzentrationen von BB-CLA (0 & mgr; (DMSO) oder 1 & mgr; BB-CLA) gezüchtet. Nach 2,5 Wochen einzelnen Kolonien größer thund 70 & mgr; m gezählt. Experimente wurden 4 mal wiederholt (n = 4). Die statistische Signifikanz der Gesamtzellzahl Differenz zwischen Behandlungs- und Kontrollproben wurde durch zwei Stichproben Student-t-Test (* p <0,005) bestimmt wird.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.