Concentric Gel-System, um die biophysikalische Rolle der Matrix Mikromilieu auf 3D-Zellmigration Studieren

Zusammenfassung

Die mechanischen Eigenschaften und die Mikrostruktur der extrazellulären Matrix stark beeinflussen 3D Migration von Zellen. In vitro-Verfahren, um die Raumzeit-Zellmigrationsverhalten in biophysikalisch variable Umgebungen sowohl Bevölkerung und einzelnen Zellebenen zu studieren, wird beschrieben.

Zusammenfassung

Die Fähigkeit von Zellen zur Migration entscheidend ist in einer Vielzahl von Zellfunktionen während des gesamten Lebens aus embryonalen Entwicklung und bei der Wundheilung zur Tumor- und Krebsmetastasierung. Trotz intensiver Forschung, die grundlegenden biochemischen und biophysikalischen Prinzipien der Zellwanderung immer noch nicht vollständig verstanden, insbesondere in ihre physiologisch relevanten dreidimensionalen (3D) Mikroumgebungen. Hier beschreiben wir ein in vitro Test zur quantitativen Untersuchung der 3D-Zellmigration Verhalten ermöglichen. Das Verfahren nutzt mechanosensing Fähigkeit der Zelle, und die Neigung, in vorher unbesetzten extrazellulären Matrix (ECM) zu migrieren. Wir nutzen die Invasion von hochinvasiven Brustkrebs-Zellen, MDA-MB-231, in Kollagengele als Modellsystem. Die Verbreitung der Zellpopulation und die Migrationsdynamik einzelner Zellen über Wochen Kultur kann mit Abbildung lebender Zellen überwacht und analysiert, um raumzeitlich aufgelösten Daten zu extrahieren. Darueber HinausDas Verfahren ist für verschiedene extrazelluläre Matrizen leicht an und bietet so eine einfache, aber leistungsstarke Möglichkeit, die Rolle der biophysikalischen Faktoren in der Mikroumgebung auf die Zellmigration zu untersuchen.

Einleitung

Migration von Zellen spielt eine wichtige Rolle bei verschiedenen physiologischen Reaktionen, wie der Embryonalentwicklung, Hämostase und Immunantwort als auch in pathologischen Prozessen, wie Gefäßerkrankungen, Entzündungen und Krebs ^1. Sezieren der biochemischen und biophysikalischen Faktoren Zellmigration ist es daher von grundlegender Bedeutung nicht nur für die Grundprinzipien der zellulären Funktionen zu verstehen, sondern auch für verschiedene biomedizinische Anwendungen, wie zB im Tissue Engineering, Anti-Metastasen und entzündungshemmenden Medikamentenentwicklung voranzutreiben. Da in vivo Beobachtung ist technisch anspruchsvoll, hat viel....

Protokoll

1. Zellernte

1. Erhalten MD-MBA-231-Zellen aus dem 37 ° C, 5% CO ₂ -Inkubator. Nehmen Zellen aus Gewebekulturplatte mit 0,5% Trypsin-EDTA-Lösung. Verwenden Sie 1 ml Trypsin-EDTA-Lösung für die Zelle in einem T25-Kolben kultiviert.
2. Pellet-Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen durch Zentrifugation bei 200 × g für 4 min, saugt den Überstand, und die Zellen in 5 ml Kulturmedium.
3. Zählen der Zelldichte, ρ, unter Verwendung eines Hämocytometers.
   Hinweis: Um die Zellaussaat inneren Gel herzustellen, wird die Zellsuspension später verdünnt werden 10 x, um die endgültige Zellaussaatdichte zu erreichen. Daher ist 10 × ko....

Ergebnisse

Die konzentrische Geltest hier vorgestellt wurde unter Verwendung hochinvasiven Brustkrebszellen MDA-MB-231 mit 2,4 mg / ml inneren Kollagen-Gel und einer Zellansiedlungsdichte = 2 x 10 ⁶ Zellen / ml, als Beispiel. Wie in Abbildung 2 dargestellt, in der Regel nach wenigen Tagen Kultur verletzt die Zellen die Innen-Außen-Gel-Grenzfläche und damit begonnen, die äußeren Gel einzudringen. Die Zellpopulation verbreiten überwiegend radial nach außen.

Die Polymerisations.......

Diskussion

In diesem Protokoll beschreiben wir einen in vitro Assay zur Untersuchung des 3D-Migrationsverhaltens von Zellen in Matrixumgebungen, die topologisch ECMs ähneln, die in vivo angetroffen werden. Es gibt drei Hauptstärken dieses Assays im Vergleich zu anderen derzeit verfügbaren Methoden. Erstens ermöglicht dieser Assay die gleichzeitige Untersuchung der Zellmigrationsmechanismen sowohl auf Populationsebene als auch auf der Ebene einzelner Zellen. Dies eröffnet Möglichkeiten, die kollektive Zellmigration.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Zellkultur-Inkubator	Fisher Scientific Pte Ltd	Modell: 371, S/Nr 318854-6055
Konfokales Mikroskop	Nikon A1R		Inverses konfokales Laser-Scanning-Mikroskop mit Inkubatorkammer
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Life Technologies	11965-092
Fötales Rinderserum (FBS)	Life Technologies	10082-147
Fluoreszierender CellTracker-Farbstoff CMTMR	Life Technologies	C2927
Glasbodenschale	IWAKI Cell Biology	3931-035	Schale mit 35 mm Durchmesser und Vertiefung mit Glasboden mit 12 mm Durchmesser
Hämozytometer	iN CYTO	DHC-N01 (Neubauer Improved)
Mikroprozessor-pH-Meter	Hanna Instruments	pH 211
Nutragen Collagen	Advanced BioMatrix	#5010-D	Säurelösliches Rinderkollagen Typ I (Stamm pH ~ 2)
Objektiv	Nikon		CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8,2-6,9mm, NA 0,45.
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15140-122
pH-Messgerät	Sartorius	S/No 29153352	Basic pH Meter PB-11
Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400-054