Quantitative Analyse der Kletter Defekte in einem Drosophila Modell von neurodegenerativen Erkrankungen

Summary

Wir präsentieren einen optimierten, kostengünstigen und zuverlässigen negativen Geotaxis-Assay in Drosophila melanogaster als Modell für neurodegenerative Erkrankungen. Da dieser Assay empfindlicher auf leichte Defekte des Bewegungsapparates reagiert, hilft er bei der Suche nach potenziellen genetischen Wechselwirkungen und Wirkstoffzielen.

Abstract

Locomotive Mängel von neurodegenerativen Erkrankungen resultiert, kann ein später Beginn Symptom der Krankheit, nach Jahren der subklinischen Degeneration und damit aktuelle therapeutische Behandlungsstrategien sind nicht kurativ. Durch die Verwendung von Voll Exoms Sequenzierung, eine zunehmende Anzahl von Genen identifiziert worden, eine Rolle in menschlichen Fortbewegung spielt. Trotz der Identifizierung dieser Gene, ist es nicht bekannt, wie diese Gene sind entscheidend für die normale Bewegungsfunktion. Daher ist ein zuverlässiger Test, der Modellorganismen verwendet, um die Rolle dieser Gene, um neue Targets von therapeutischem Interesse zu identifizieren aufzuklären, ist mehr denn je erforderlich. Wir haben eine sensibilisierte Version der negativen geotaxis Assay, der zum Nachweis von Mängeln milder früheren ermöglicht, und die Fähigkeit hat, diese Mängel über der Zeit erfasst gestaltet. Der Test wird in einem Glas durchgeführt Meßzylinder, der mit einem Wachsbarriere-Film abgedichtet ist. Durch die Erhöhung der Schwellenabstand um 17,5 c bestiegen werdenm und die Erhöhung der Versuchsdauer bis 2 Minuten haben wir eine größere Empfindlichkeit beim Nachweis von mild Mobilitätsstörungen beobachtet. Der Test wird kostengünstig und erfordert keine umfangreiche Ausbildung zu hoch reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Dies macht es eine ausgezeichnete Technik für das Screening von Wirkstoffkandidaten in Drosophila-Mutanten mit Bewegungsfehler.

Introduction

Verheerenden neurodegenerativen Erkrankungen wie Parkinson-Krankheit, amyotrophe Lateralsklerose und Spastische Paraplegie werden zunehmend anerkannt. Leider sind die meisten dieser neurodegenerativen Erkrankungen noch ohne Behandlungen. Die weit verbreitete klinische Anwendung von genomweiten, unvoreingenommene Gentests wie Voll Exom-Sequenzierung hat zu einer wachsenden Anzahl von Genen geführt, dass in der menschlichen Bewegungsapparates verwickelt. Trotz dieser Fortschritte die pathologische Progression von früh bis spät Bühnen, in weiter Ferne in dieser Erkrankungen. Drosophila stellt ein mit den genetischen Werkzeuge zum Studium Gen Anforderung in einer kontrollierten Art und Weise räumlich und zeitlich. Darüber hinaus hat Drosophila nützlich beim Screening Medikamenten für neurologische Erkrankungen wie der ^{Parkinson-1, Alzheimer-2,} geistiger Behinderung und Epilepsie ^{3,4 5,6} ua bewährt. Unser Ziel war es, eine kostengünstige Entwicklungund zuverlässigen Assay, der Analyse mit hohem Durchsatz, die noch ausreichend empfindlich gegenüber kleinen Änderungen in der Motorleistung zu detektieren würde ermöglichen würde.

Es gibt verschiedene Tests verwendet, um die Effekte der genetischen Mutation und / oder Umgebungsbedingung auf Drosophila Kletterverhalten zu quantifizieren. Die meisten der Tests zu profitieren auf die natürliche Tendenz von Fliegen zu klettern, als negative Geotaxis oder Kletter Assay bekannt. Benzer ⁷ vorgeschlagen 1967, dass der Gegenstrom-Vorrichtung für die Untersuchung der Phototaxis verwendet könnte auch zur Gravitaxis untersuchen. Seitdem haben Ganetzki ⁸ und viele andere ^{9 -12} auf der ersten Test gebaut. Das Prinzip ist, um eine bekannte Anzahl der Fliegen in einem Fläschchen zu stellen und tippen Sie auf die Fläschchen kräftig gegen eine harte Oberfläche, wodurch die Fliegen an den Boden des Fläschchens fällt. Da es ein angeborenes Verhalten, werden die Fliegen versuchen, auf der Oberseite des Fläschchens, der Schwerkraft entgegengesetzt zu klettern. Dieser Test ist quantitativ und measures, wie viele Fliegen haben während einer vorgegebenen Zeit an einer Markierung auf dem Fläschchen kletterte. Messung der Geschwindigkeit anstatt der gesamten Anzahl der Fliegen Steigen zu einem verlässlichen Parameter und in Fällen, wo die Anzahl der Fliegen Kriterien nicht signifikant war ¹³ gezeigt Defekten.

Die Steig Assay in der Studie von vielen neurodegenerativen Erkrankungen einschließlich Parkinson-Krankheit ¹⁴ bewährt. Allerdings haben wir festgestellt, dass Lok Mängel möglicherweise nicht nachweisbar sein zum Zeitpunkt, wo Neurodegeneration ist bereits in pathologischen Studien ¹⁴ zu sehen. Somit kann die Verwendung des herkömmlichen Assay die Fähigkeit, die frühen Stadien der Krankheit zu untersuchen Pathogenese begrenzen. Das Aussehen der Lokomotive Defekte während späteren Phasen der Pathologie kann eine Krankheit, deren Progression zu fortgeschritten für komplette Rettungs reflektieren.

Dies wirft ein mögliches Problem mit der Empfindlichkeit des traditionellen Kletter Assay. Der potenzielle Unfähigkeit des tradinalen Klettern Assay zu mild Lokomotive Mängel erkennen kann, um die Höhe, auf die die Fliegen sind erforderlich, um zu klettern zurückzuführen. Die herkömmlichen Assay ^15,16 misst die Anzahl der Fliegen, um erfolgreich über eine Höhe von 2 bis 5 cm steigen in 10 bis 20 Sekunden.

Protocol

Forschung an Drosophila melanogaster wurde in Übereinstimmung mit der Universität Forschungs Richtlinien Albertas.

1. Fly-Sammlung

1. Sammeln Sie 20 Fliegen mit CO _{2 (g)} Betäubung und in eine 25 mm x 95 mm Sammelgefäß haltige Speisen.
2. Shop Stechflaschen mit Fliegen horizontal zu vermeiden Trapping Fliegen in allen Flüssigkeiten, die in den Boden anreichern kann das Fläschchen.
3. Entfernt inkubiere für mindestens 21 Stunden bei 22 ° C bei 45% Luftfeuchtigkeit in einem Brutschrank für ca. 15 Stunden. Stellen Sie den Inkubator mit einem 12 Stunden Licht: Dunkel-Zyklus.

2. Climbing Assay

1. Am nächsten Morgen, Transfer 20 Fliegen aus einer Ampulle in einen 250-ml-Glasmesszylinder. Markieren Sie die Position des Zylinders, um sie konstant zu halten jeden Tag. Verwenden Sie einen Glaszylinder pro Genotyp um eine Kreuzkontamination zwischen den Genotypen zu verhindern. Waschen Sie am Ende jedes Experiments und rotate sie zwischen den Genotypen.
   1. Führen die Versuche im Umgebungslicht (oder rotes Licht, wenn es einen potentiellen Defekt in Vision) bei der Temperatur und Feuchtigkeit von 22 ° C bzw. 40%. Um zirkadianen Rhythmus verwechseln zu vermeiden, führen Sie immer Experimente zur gleichen Tageszeit.
2. Verschließen Sie die Oberseite des Zylinders mit einer Sperrfolie (Wachsfilm), um das Entweichen jeglicher Fliegen zu verhindern (Abbildung 2).
3. Richten Sie die Videokamera auf einem Stativ. Fokus-Kamera auf der Linie 190 ml der 250 ml-Messzylinder (17,5 cm).
4. Die Anzahl der toten Fliegen am Boden des Zylinders und in der Lebensmittelfläschchen. Tragen Sie diese Nummer als die Sterblichkeit.
5. Sehr leicht den Zylinder gegen einen geschlossenzelligen Schaumpolster wiederholt tippen mit genügend Kraft, um die Fliegen an der inneren Bodenfläche zu verdrängen. Tippen Sie auf 5 bis 10 mal, während mit der anderen Hand auf Rekord auf der Kamera drücken.
6. Drücken Sie die "Record" Taste an der Kamera.
7. Starten Sie das video Kameraaufnahme und auf den Zylinder, sechs Mal in einem ausgeprägten nicht-rhythmische Muster.
8. Leiten jeden Versuch für 2 min von der Zeit die Fliegen letzten abgegriffen und notieren Sie die Anzahl der Fliegen der Höhe von 17,5 cm (190 ml) zu jedem gewählten Zeitpunkt (zu quantifizieren alle 10 sec) überqueren. Hinweis: Das ml Markierung auf dem Zylinder wird von einem Zylinder-Modell zum anderen variieren je nach Durchmesser. Um Fehler zu vermeiden, messen Sie die Höhe an jedem Zylinder verwendet.
9. Sobald die Studie beendet ist, entsorgen Sie fliegt in 95% Ethanol.
10. Wiederholen Sie die Schritte 2,1-2,9, bis alle Wiederholungen wurden mit frischen Fliegen jedes Mal getestet.
    Hinweis: Obwohl 5 Wiederholungen können genug mit einer Mutation, die eine starke Wirkung auf die Fortbewegung ist, wird 10 biologischen Replikate von 20 Fliegen (200 entfernt) empfohlen, um kleinere Unterschiede zu erkennen.
11. Bei Beendigung des Versuchs, wäscht die Zylinder im Labor Spül- und Trocken O / N wiederverwendet werden.

3. Analyse

1. Analyze Videos von jeder fliegen Studie. Jede 10 Sekunden, notieren Sie die Gesamtzahl der Fliegen, die die Ziellinie passieren.
   1. Wenn eine Fliege klettert wieder nach unten und fällt, Datensatz, der als -1 fliegen und zählen Sie die nächste Fliege, um die Ziellinie als die gleiche Anzahl wie die Fliege, die wieder nach unten stieg oder fiel überqueren. Zum Beispiel, wenn der ^15. fly unter die Ziellinie, die nächste Fliege, die Linie ^(16. Fliegen) gilt als der ^15. Fliege und nicht der ^16. überqueren.
2. Subtrahiere die Mortalität aus der Gesamtzahl von Fliegen (20), um die Anzahl der Fliegen, die in der Studie bleiben erhalten. Zu jedem Zeitpunkt, erhalten die Fraktion von Fliegen über der Ziellinie.
3. Zeichnen Sie jeden Prozentsatz zu jedem Zeitpunkt (siehe Abbildung 3).
4. Analysieren Sie die Leistung am 120 s Datenpunkt und führen Sie Student t-Test bei 2 Gruppen vorhanden sind oder ANOVA und einen Post-Test für multiple Vergleiche (mit Bonferroni Modifikation für geplante und ungeplante Tukey für Zusammenarbeitmparisons). Der Kolmogorov-Smirnov-Tests ¹⁷ wird auch durchgeführt, um Normalität und gleiche Varianz zu ermitteln, sondern auch, um die Verteilungen des Mutanten-Gruppe an die Steuerung zu vergleichen.
5. Um die Daten über Alterung zu präsentieren, zeichnen den Prozentsatz von Fliegen Klettern bei 120 sec mit Fliegen unterschiedlichen Alters (2 Tage, 1 Woche, 2 Wochen), um zu sehen, ob es eine fortschreitende Defizit (Abbildung 4).

Results

Klettern ist eine starke und reproduzierbare Verhalten. Tatsächlich erreichen einen Tag alt Wildtyp-Fliegen die Zielentfernung Kletterleistung schnell (25-30 sec). Mutierten Fliegen präsentieren ein Leistungsbereich von mild (oder verzögert) die Unfähigkeit, die dem Ziel klettern abzuschließen. Wir veranschaulichen dies hier mit zwei verschiedenen mutierten Allelen. Die erste ist eine schwere Allel des Gens Spastin durch eine vollständige Löschung des Spastin Gen (Spas ^{5,75) 18} verursacht. In dieser Zeile (Sp...

Discussion

Drosophila hat bereits bewiesen, dass ein ausgezeichnetes Modell der Parkinson-Krankheit ¹⁴ und andere neurodegenerative Erkrankungen ^1,2 sein. Zusätzlich zu den genetischen Werkzeugen von Drosophila, wird dessen Genom sehr für Gene in neurologischen Erkrankungen beteiligten ¹⁹ konserviert. Das Aufkommen der genomweite genetische Screening-Methoden (einschließlich ganze Exoms Sequenzierung) wird sich wahrscheinlich fortsetzen, um eine größere Liste der Kandidatengene mi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila-Bestände			Die Bestände werden in Abhängigkeit von den Versuchen ausgewählt. Die Temperatur und Luftfeuchtigkeit im Raum und im Brutkasten müssen kontrolliert und konstant sein, um zu vermeiden, dass die Fliegen zu statisch oder zu nass werden.
Videokamera			Jeder digitale Camcorder ist geeignet. Stellen Sie sicher, dass sie auf nahe Objekte fokussieren können.
Messzylinder	Kimble	20028W	Verschiedene Modelle von Messzylindern können unterschiedliche Durchmesser haben. Es ist daher wichtig, die Höhe zu messen.
Computer			Jedes Modell ist geeignet. Wir benutzten den Computer, um das Klettern der Fliegen zu überwachen und die Anzahl der Fliegen zu jedem Zeitpunkt aufzuzeichnen.