Methodenartikel

Analysieren der Funktionen von Mastzellen in Vivo mit ' MastCell Knock-in' Mäuse

DOI:

10.3791/52753

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27. Mai 2015

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1Department of Pathology, Stanford University School of Medicine, 2Department of Microbiology & Immunology, Stanford University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir beschreiben eine Methode zur Erzeugung von in vitro abgeleiteten Mastzellen, deren Engraftierung in Mastzell-Mäuse und die Analyse des Phänotyps, der Anzahl und der Verteilung von transplantierten Mastzellen an verschiedenen anatomischen Standorten. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Funktionen von Mastzellen in vivozu bewerten.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mastzellen (MCs) sind hämatopoetische Zellen, die in verschiedenen Geweben leben und besonders häufig an Stellen vorhanden sind, die der äußeren Umgebung ausgesetzt sind, wie Haut, Atemwege und Magen-Darm-Trakt. Am besten bekannt für ihre nachteilige Rolle bei IgE-abhängigen allergischen Reaktionen, MCs haben sich auch als wichtige Akteure in der Wirtsabwehr gegen Gift und eindringende Bakterien und Parasiten. MC-Phänotyp und -funktion können durch Mikroumweltfaktoren beeinflusst werden, die je nach anatomischer Position und/oder je nach Art oder Entwicklungsstadium der Immunantworten abweichen können. Aus diesem Grund haben wir und andere In-vivo-Ansätze gegenüber In-vitro-Methoden bevorzugt, um Einblicke in MC-Funktionen zu gewinnen. Hier beschreiben wir Methoden zur Erzeugung von mausknochenknochenförmigen kultivierten MCs (BMCMCs), deren Adoptivübertragung in genetisch MC-defizitierte Mäuse und die Analyse der Anzahl und Verteilung von adoptiert übertragenen MCs an verschiedenen anatomischen Standorten. Diese Methode, die als"Mastzellen-Knock-in"-Ansatz bezeichnet wird, wurde in den letzten 30 Jahren ausgiebig eingesetzt, um die Funktionen von MCs und MC-abgeleiteten Produkten in vivozu bewerten. Wir diskutieren die Vorteile und Grenzen dieser Methode im Lichte alternativer Ansätze, die in den letzten Jahren entwickelt wurden.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mastzellen (MCs) sind hämatopoetische Zellen, die aus pluripotenten Knochenmarkvorläufern1-3entstehen. Nach der Knochenmarkegression wandern MCs-Vorläufer in verschiedene Gewebe, wo sie sich unter dem Einfluss lokaler Wachstumsfaktoren1-3zu reifen MCs entwickeln. Geweberesidente MCs befinden sich strategisch an Host-Umgebungsschnittstellen, wie der Haut, den Atemwegen und dem Magen-Darm-Trakt, wo sie sich als erste Verteidigungslinie gegen äußere Beleidigungen3-6verhalten. MCs werden häufig auf der Grundlage ihrer "basiskandigen" phänotypischen Eigenschaften und ihrer anatomischen Positionen unterklassifiziert. Bei Mäusen wurden zwei Arten von MCs beschrieben: "Connective Tissue Type" MCs (CTMCs) und Mucosal MCs (MMCs)1-3,7,8. CTMCs befinden sich oft um Venules und in der Nähe von Nervenfasern und befinden sich in serosalen Hohlräumen, während MMCs intraepitheliale Stellen im Darm und der Atemschleimhaut1-3einnehmen.

Zahlreiche Methoden wurden angewandt, um biologische Funktionen von MCs9-13zu untersuchen. Viele Gruppen haben sich auf In-vitro-Ansätze konzentriert, die entweder Zelllinien (wie die menschlichen MC-Linien HMC114 oder LAD215,16), in vitro abgeleitete MCs (wie humane periphere, blutabgeleitete MCs17oder Mausknochenmark-abgeleitete Kultur) verwenden. d MCs [BMCMCs]18, fetale hautabgeleitete kultivierte MCs [FSCMCs]19 und peritoneale zellabgeleitete MCs [PCMCs]20) oder ex vivo isolierte MCs von verschiedenen anatomischen Standorten. Alle diese Modelle sind weit verbreitet, um molekulare Details der MC-Biologie zu studieren, wie Signalwege, die an der MC-Aktivierung beteiligt sind. Ein wichtiger Aspekt der MCs-Biologie ist jedoch, dass ihre phänotischen und funktionellen Eigenschaften(z. B.zytoplasmatische Granulatproteasegehalt oder Reaktion auf verschiedene Reize) durch anatomische Lage und Mikroumgebung moduliert werden können2,7. Da die genaue Mischung solcher Faktoren, die in vivo auftreten, schwierig sein kann, sich in vitrozu reproduzieren, bevorzugen wir die Verwendung von In-vivo-Ansätzen, um Einblicke in mCs-Funktionen zu gewinnen9.

Es gibt mehrere Mausstämme mit genetischem MC-Mangel, wie die weit verbreiteten WBB6F1-Kit W/W-v oder C57BL/6-Kit W-sh/W-sh Mäuse. Diesen Mäusen fehlt es an Expression und/oder Aktivität von KIT (CD117), dem Rezeptor für den wichtigsten MC-Wachstumsfaktor-Stammzellfaktor (SCF)21,22. Infolgedessen haben diese Mäuse einen tiefen MC-Mangel, haben aber auch zusätzliche phänotypische Anomalien im Zusammenhang mit ihrenc-Kit-Mutationen (in den WBB6F1- Kit W/W-v-Mäusen) oder den Auswirkungen der großen chromosomalen Inversion, die zu einer reduzierten c-Kit-Expression führt (im C57BL/6- Kit W-sh/W-sh-Mäuse) 9,10,12,23 . In jüngerer Zeit wurden mehrere Stämme von Mäusen mit c-Kit-unabhängigem konstitutivem MC-Mangel24-26berichtet. Alle diese Mäuse und einige weitere neue Arten von induzierbaren MC-Mangel Mäuse wurden vor kurzem im Detail überprüft9,10,13.

Hier beschreiben wir Methoden zur Erzeugung von mausknochenknochenförmigen kultivierten MCs (BMCMCs), deren Adoptivübertragung in MC-mangelhafte Mäuse und die Analyse der Anzahl und Verteilung von adoptiert übertragenen MCs an verschiedenen anatomischen Standorten. Diese sogenannte Mastzell-Knock-in-Methode kann verwendet werden, um die Funktionen von MCs und MC-abgeleiteten Produkten in vivozu bewerten. Wir diskutieren die Vorteile und Grenzen dieser Methode im Lichte alternativer Ansätze, die in den letzten Jahren entwickelt wurden.

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Protokoll

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Alle Tierpflege- und Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health und mit der spezifischen Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee der Stanford University durchgeführt.

1. Erzeugung und Charakterisierung von Knochenmark-abgeleiteten Cultured Mast Cells (BMCMCs).

Hinweis: Spender-BMCMCs sollten aus Knochenmarkzellen mit demselben genetischen Hintergrund wie die Empfänger-MC-Mäuse erzeugt werden. Männliche Spender-BMCMCs sind nicht für die Transplantation von weiblichen Mäusen geeignet. Weibliche Spender-BMCMCs werden erfolgreich in männliche und weibliche Empfänger eingraviert.

  1. Knochenmark-Extraktion.
    1. Sterile Phosphat-gepufferte Kochung (PBS) in 6 Brunnenkulturplatte (1 gut pro Maus) gießen und auf Eis legen.
    2. Die Sezierinstrumente in 70% Ethanol zur Sterilisation einweichen.
    3. Euthanisieren Sie Spendermäuse durch Kohlendioxid(CO2) Inhalation gefolgt von Zervixdislokation, dann sprühen Sie die Mäuse mit 70% Ethanol an den Standorten der Manipulation.
    4. Verwenden Sie sterile Sezierinstrumente, um die Oberschenkelknochen, Tibia- und Fibelknochen zu extrahieren, ohne Knochenepiphysen zu schneiden.
    5. Während Sie die Knochen mit einer Zange sichern, kratzen Sie das gesamte Gewebe von knochen (und entsorgen Fibeln) mit sterilen Scheren (oder Skalpellklingen). Legen Sie Die Knochen in PBS auf Eis, bis alle Knochen gesammelt sind.
    6. Führen Sie alle verbleibenden Schritte in steriler Gewebekultur Haube. Mit sterilen Instrumenten, sichern Knochen mit Zange und schneiden Sie beide Epiphysen, um die medulläre Höhle zu belichten.
    7. Mit 3 ml Spritzen und 30 G Nadeln und Kaltspülmedium (Dulbecco Modified Eagle Medium [DMEM] ergänzt durch 10% fetales Kalbsserum [FCS, wärmeinaktiviert], 2 mM L-Glutamin, 1% Antimykotiklösung, 50 M -Mercaptoethanol), spülen Sie das rote Knochenmark in eine Petrischale.
    8. Verwenden Sie dieselbe Spritze, um gespülte Knochenmarkzellcluster durch wiederholtes sanftes Absetzen und Auswerfen zu dissoziieren.
    9. Femoral- und Tibiaknochenmark von jeder Maus in ein 15 ml Zentrifugenrohr einfüllen. Füllen Sie das Rohr mit Kaltspülmedium, um Knochenmarkzellen und Zentrifuge bei 400 x g für 5 min bei 4 °C zu waschen.
  2. BMCMCs Kultur.
    1. Entfernen Sie Überstand und erholen Sie pelletierte Knochenmarkzellen in 10 ml Kulturmedium (DMEM ergänzt mit 10% fetalem Kalbsserum [FCS, wärmeinaktiviert], 2 mM L-Glutamin, 1% antimykotische Lösung, 50 M-Mercaptoethanol und 20% WEHI-3-zellkonditioniertes Medium [als Quelle von IL-3; alternativ rekombinante Maus IL-3 bei 10 ng/ml verwenden]).
    2. Legen Sie Zellen in Gewebekulturkolben von entsprechender Größe(z.B.T25 für 1 Maus, T75 für 2 Mäuse, etc.).
    3. 1-2 Tage nach der Beschichtung von Zellen, übertragen Medium und Suspension sentiere Zellen (damit Schutt und anhaftende Zellen am Boden des Kolbens kleben) zu einem neuen Kolben und fügen Sie frisches Kulturmedium (10 ml/Maus).
    4. In den folgenden Wochen füttern Sie Zellen alle 3-4 Tage (10 ml Kulturmedium pro Maus hinzufügen). Beibehaltung der Zelldichte zwischen 2,5 x 105-1 x 106 Zellen/ml. Übertragen Sie nicht anhaftende Zellen einmal pro Woche in einen neuen Kolben, bis keine anhaftenden Zellen im Kulturkolben vorhanden sind. Testreife von Zellen (siehe unten) vor der Verwendung für In-vitro-Assays oder Engraftment in MC-mangelhafte Mäuse.
      HINWEIS: Die vollständige Differenzierung der BMCMCs dauert 4-6 Wochen.
  3. Bewertung der BMCMC-Reife.
    1. Verwenden der Durchflusszytometrie.
      1. Waschzellen (5 x 104-5 x 105 Zellen/Bedingung) mit eiskaltem FACS-Puffer (PBS, 0,5% FCS) in 5 ml Polystyrol-Rundbodenrohr. Zentrifuge bei 400 x g für 5 min bei 4 °C. Aspirat Überstand.
      2. Verdünnung der monoklonalen Anti-Maus-Antikörper CD16/32 (Klon 93 oder 2.4G2) 1:200 (2,5 g/ml) im FACS-Puffer. Fügen Sie jedem Pellet 10 l hinzu und setzen Sie es durch kurze Wirbel wieder aus. Inkubieren Sie 5 min auf Eis, um die Fc-Bindung zu blockieren.
        HINWEIS: Schützen Sie Proben vor direktem Licht für alle verbleibenden Schritte.
      3. Verdünnung von Phycoerythrin (PE) konjugierte Anti-Maus-Fc-RI-α (Klon MAR-1) 1:200 (1 g/ml) und Fluoresceinisothiocyanat (FITC) konjugierte Anti-Maus-KIT (CD117; Klon 2B8) 1:200 (2,5 g/ml) ("Färbelösung") oder die jeweils beschrifteten Isotypkontrollantikörper im FACS-Puffer ("Isotype-Kontrolllösung").
      4. Die Hälfte der blockierten Zellen aus Schritt 1.3.1.2) in ein zusätzliches Polystyrol-Rundbodenrohr aufteilen und 20 l "Färbelösung" in einem Röhrchen und 20 l "Isotyp-Kontrolllösung" in das andere Rohr geben. 30 min auf Eis inkubieren.
      5. 3 ml eiskalten FACS-Puffer und Zentrifuge bei 400 x g für 5 min bei 4 °C hinzufügen. Überstand entsorgen und das Pellet in einem FACS-Puffer von 300 l mit 1 g/ml Propidiumjodid (PI zur Identifizierung abgestorbener Zellen) wieder aufhängen. Fahren Sie mit der Analyse der Durchflusszytometrie fort (siehe Abbildung 2A).
    2. Mit Toluidin blau Färbung.
      1. 1 x 105 Zellen einmal mit PBS durch Zentrifugation bei 400 x g für 5 min bei Raumtemperatur waschen, dann Zellen in 200 l PBS aspirieren und resuspendieren.
      2. Übertragen Sie die Zellsuspension in einen präparierten Zytofunnel, der an einem Mikroskopschlitten befestigt ist, und fahren Sie mit der Zytozentrifugation mit einer Zytozentrifuge (40 x g für 5 min) fort.
      3. Lufttrockenrutschen für 10 min und zeichnen Sie einen Wachskreis um Zellen mit einem PAP-Stift. Fügen Sie 0,1% Toluidin blaue Lösung, um die Zellen zu decken. Inkubieren Sie für 1 min. Waschen Sie Rutschen in fließendem Leitungswasser für 1 min, dann lufttrockene Rutschen für 10 min.
      4. Coverslip-Zellen mit Montagemedium. Zur Lichtmikroskopanalyse (siehe Abbildung 2B)

2. Transplantation von Mastzell-Mangelmäusen mit BMCMCs.

  1. Ohrtransplantation durch intradermale Injektion.
    HINWEIS: Für die Adoptivübertragung von BMCMCs in die Ohrpinnae von MC-Mäusen mit Mangel empfehlen wir die Durchführung von zwei Injektionen von je 1 x 106 Zellen (für insgesamt 2 x 106 Zellen) pro Ohrpinna. Die intradermale Transplantation von BMCMCs in die Ohrpinnae von MC-defizienten Mäusen wurde von vielen Forschern in mehreren Modellen verwendet, einschließlich Modellen der passiven kutanen Anaphylaxie (PCA)24,27, Wirtsabwehr gegen Gifte28, und chronische Überempfindlichkeit (CHS) Reaktionen29,30.
    1. Anzahl und Resuspendieren von Zellen bei 4 x 107 BMCMCs/ml (1 x 106 BMCMCs/ 25 l) in kaltem DMEM. Übertragen Sie die BMCMCs-Lösung in eine 1 ml Spritze, die mit einer 30 G Nadel ausgestattet ist. Auf Eis bis zur Injektion.
    2. Anästhetisieren Sie 4-6 Wochen alte MC-mäuse mit Isofluran (2,5% v/v). Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie durch Zehenkneifen, stellen Sie Isofluran ein, falls angegeben, und überwachen Sie weiterhin die Atmung und die Reaktion auf die Zehenkneifung während des gesamten Verfahrens. Ophthalmologische Salbe mit einer Q-Spitze auftragen, um Trockenheit der Augen zu verhindern.
    3. Mit dem Zeigefinger, erstellen Sie vertikalen Druck auf die dorsale Fläche der Ohrpinna, um die ventrale Fläche zu belichten und zu dehnen.
    4. Führen Sie zwei 25-l-i.d.-Injektionen der BMCMC-Lösung in zwei verschiedene Stellen der ventralen Fläche der Ohrpinna durch, die erste Injektion in der Mitte des Ohres und die zweite Injektion in Richtung der Spitze der Ohrpinna. Warten Sie 4-6 Wochen nach der i.d. Engraftment, bevor Sie In-vivo-Experimente durchführen.
      Anmerkung: Unserer Erfahrung nach ist die Anzahl der MCs/mm2 derMis im zentralen Teil der Ohrpinna im Allgemeinen ähnlich wie an der entsprechenden Stelle bei Wildtypmäusen, während die Anzahl der MCs/mm2 in der Peripherie der Ohrpinnae in der Regel wesentlich niedriger ist als bei den entsprechenden Wildtypmäusen27,28. Dies sollte bei der Entwicklung von Experimenten mit solchen MC-engrafted Mäusen berücksichtigt werden(z. B.sollten Wirkstoffe mit möglichen Auswirkungen auf die MC-Funktion in den zentralen Teil der Ohrpinnae injiziert werden, und die Analyse der Auswirkungen solcher Behandlungen sollte sich ebenfalls auf diesen Bereich konzentrieren).
  2. Peritoneale Hohlraumtransplantation durch intraperitoneale Injektion(i.p.).
    HINWEIS: Die Adoptivübertragung von BMCMCs in die Peritonealhöhle von MC-mäusen mit Mangel erfordert eine Injektion von 2 x 106 Zellen pro Maus. Solche i.p. Injektionen von BMCMCs in MC-defizient Ecmgen wurden von vielen Gruppen verwendet, um die Rollen von peritonealen MCs in verschiedenen Modellen zu untersuchen, einschließlich Modellen der Wirtsabwehr gegen Gifte31 oder bakterielle Sepsis32,33.
    1. Zählen Sie die entsprechende Anzahl von Zellen und setzen Sie sich bei 1 x 107 BMCMCs/ml (2 x 106 BMCMCs/ 200 l) in kaltem DMEM wieder aus. Übertragen Sie die BMCMCs-Lösung in eine 1 ml Spritze, die mit einer 25 G Nadel ausgestattet ist. Auf Eis bis zur Injektion.
    2. Führen Sie 1 Injektion von 200 l BMCMCs-Lösung in die Peritonealhöhle von 4-6 Wochen alten MC-Mäusen mit Mangel durch. Warten Sie 4-6 Wochen nach der i.p. Engraftment, bevor Sie In-vivo-Experimente durchführen.
  3. Transplantation durch intravenöse Injektion( i.v.).
    ANMERKUNG:Die Adoptive Übertragung von BMCMCs durch i.v. Injektion in MC-mäuse mit Mangel erfordert eine Injektion von 5 x 106 Zellen pro Maus. Intravenöse (i.v.) Injektionen von BMCMCs in MC-defizide Mäuse wurden von vielen Gruppen verwendet, um die Rolle von MCs in verschiedenen Krankheitsmodellen zu untersuchen, einschließlich Modelle der Blaseninfektion34, Asthma35, Lungenfibrose36und antikörpervermittelte Arthritis37.
    1. Zählen Sie die entsprechende Anzahl von Zellen und setzen Sie sich bei 2,5 x 107 BMCMCs/ml (5 x 106 BMCMCs/200 l) in kaltem DMEM wieder aus. Übertragen Sie die BMCMCs-Lösung in eine 1 ml Spritze, die mit einer 30 G Nadel ausgestattet ist. Auf Eis bis zur Injektion.
    2. Anästhetisieren Sie 4-6 Wochen alte MC-mäuse mit Isofluran (2,5% v/v). Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie durch Zehenkneifen, stellen Sie Isofluran ein, falls angegeben, und überwachen Sie weiterhin die Atmung und die Reaktion auf die Zehenkneifung während des gesamten Verfahrens. Ophthalmologische Salbe mit einer Q-Spitze auftragen, um Trockenheit der Augen zu verhindern.
    3. Führen Sie eine Injektion von 200 l BMCMC-Lösung in die Schwanzvene (oder alternativ die retro-orbitale Vene) einer MC-mangelhaften Maus durch. Warten Sie 12 Wochen nach der i.v. Engraftment, bevor Sie In-vivo-Experimente durchführen.

3. Analyse von transplantierten Mastzell-Mangel Mäusen.

  1. Ohrtransplantationsanalyse.
    1. Am Ende des Experiments, euthanisieren Mäuse durch CO2-Inhalation gefolgt von Zervixdislokation.
    2. Isolieren Sie die Ohrpinnae und fixieren Sie in 10% (vol/vol) gepuffertes Formalin über Nacht bei 4 °C. Feste Ohrpinnae in Paraffin einbetten, 4 m Abschnitte der Ohrpinnae schneiden und auf Glasschlitten montieren.
    3. Beflecken Sie die Dias mit einer 0,1% Toluidinblaulösung für 1 min bei Raumtemperatur. Spülen Sie Rutschen in Leitungswasser für 1 min, dann lufttrockene Dias für 10 min bei Raumtemperatur.
    4. Coverslip-Dias mit Montagemedium, dann zählen Sie die Anzahl der eingezäunten MCs pro Pinnae-Abschnitte mit einem Lichtmikroskop. Bewerten Sie die Transplantationseffizienz, indem Sie den Prozentsatz und die Verteilung von MCs in der Ohrhaut von transplantierten Mäusen mit Wildtypmäusen vergleichen.
  2. Peritonealhöhlen-Entransplantat-Analyse.
    1. Auswertung der Mastzellenzahl in der Peritonealhöhle.
      1. Am Ende des Experiments, euthanisieren Mäuse durch CO2-Inhalation gefolgt von Zervixdislokation. Entfernen Sie sorgfältig die ventrale Haut der Mäuse, ohne die Peritonealhöhle zu brechen.
      2. Injizieren Sie 5 ml Kälte- oder Raumtemperatur PBS in die Peritonealhöhle mit einer 5 ml Spritze, die mit einer 25 G Nadel ausgestattet ist. Verwenden Sie kalte PBS, um das Risiko der Aktivierung von Peritonealzellen zu reduzieren (dies ist sehr wichtig bei der Bewertung der peritonealen MC-Degranulation oder des Gehalts einiger MC-abgeleiteter Produkte in der peritonealen Spülflüssigkeit). Führen Sie eine Massage des Bauches für 20 Sek. zur Ernte von Peritonealzellen durch.
      3. Langsam die Peritonealspülung mit einer 5 ml Spritze mit einer 22 G Nadel ansaugen. Zeichnen Sie das Volumen der angesaugten Lava (erwarten Sie, bis zu 80% des injizierten Volumens zu erholen).
      4. Peritonealspülflüssigkeit in ein 5 ml Polystyrol-Rundbodenrohr und Zentrifuge bei 400 x g für 5 min bei 4 °C übertragen. Aspirat Überstand. Stellen Sie das Pellet in 400 l kalten PBS wieder her.
      5. Zählen Sie die Gesamtzahl der Peritonealzellen mit einer Hämozytometerkammer. Verwenden Sie die Hälfte der Zellsuspension für eine Durchflusszytometrieanalyse (wie in Schritt 1.3.1 beschrieben), um den Prozentsatz und die Markerexpression von transplantierten MCs in der Peritonealhöhle zu bewerten. Multiplizieren Sie die Gesamtzahl der Peritonealzellen mit dem Prozentsatz der MCs, um die absolute Anzahl der peritonealen MCs zu erhalten.
      6. Führen Sie eine Zytozentrifugation mit den verbleibenden Zellen durch, wie in Schritt 1.3.2.2 beschrieben. Lufttrockenrutschen für 10 min bei Raumtemperatur und zeichnen Sie einen Wachskreis um Zellen mit einem PAP-Stift.
      7. Decken Sie Zellen mit unverdünnter May-Grünwald Färbung lösung für 5 min, gefolgt von Waschen in PBS für 5 min, beide bei Raumtemperatur. Decken Sie Zellen mit Giemsa-Färbung 1:20 mit entionisiertem Wasser und inkubieren 20 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie Dias 2 mal in Leitungswasser für 1 min, dann lufttrockene Rutschen.
      8. Abdeckungsrutschzellen mit Montagemedium und berechnen den Prozentsatz der transplantierten MCs mit einem Lichtmikroskop (durch Zählen von mindestens 400 Gesamtzellen). Bewerten Sie die Transplantationseffizienz, indem Sie den Prozentsatz der MCs in der peritonealen Lavage von transplantierten Mäusen mit Wildtypmäusen vergleichen.
    2. Auswertung von Mastzellen in den mesenterischen Fenstern.
      1. Nach der in Schritt 3.2.1 beschriebenen peritonealen Spülung, schneiden Sie die Peritonealmembran auf, um den Darmtrakt der Mäuse freizulegen. Ordnen Sie 4 bis 5 mesenterische Fenster pro Maus auf eine Folie an.
      2. Fixieren Sie die Dias für 1 Stunde in Carnoy-Lösung (3:2:1 vol/vol/vol von Ethanol, Chloroform und Eisessig) bei Raumtemperatur. Lufttrockene Rutschen und entfernen Sie den Darm (die festen mesenterischen Fenster bleiben an den Rutschen befestigt).
      3. Die Präparate für 20 min bei Raumtemperatur mit Csaba (Alcian blue/Safranin O) Färbelösung färben.
        1. Um 500 ml Csaba-Färbung herzustellen, 500 ml Acetatpuffer vorbereiten, indem Sie 100 ml 1 M Natriumacetatlösung mit 120 ml 1 M HCl mischen. Mit entionisiertem Wasser bis zu 500 ml auffüllen und pH auf 1,42 einstellen. Dann 90 mg Safranin [identifiziert 'reife MCs' in rot], 1,8 g Alcian blau [identifiziert 'unreife MCs' in blau] und 2,4 g ferrisches Ammoniumsulfat NH4Fe(SO4)2 in 500 ml Acetatpuffer.
      4. Coverslip-Dias mit Montagemedium, dann zählen Sie die Anzahl der eingezäpierten MCs pro mesenterischem Fenster mit einem Lichtmikroskop. Bewerten Sie die Transplantationseffizienz, indem Sie den Prozentsatz und die Verteilung von MCs in den mesenterischen Fenstern von transplantierten Mäusen mit Wildtypmäusen vergleichen.
  3. I.v. Transplantationsanalyse.
    1. Am Ende des Experiments, euthanisieren Mäuse durch CO2-Inhalation gefolgt von Zervixdislokation, und Ernten Gewebe von Interesse(z. B. Lunge, Haut oder Milz) und fixieren über Nacht in 10% (vol/vol) gepuffertes Formalin bei 4 °C.
    2. Einbetten von festem Gewebe in Paraffin, Schneiden von 4 m Abschnitten und Montage auf Glasrutschen. Beflecken Sie die Dias mit einer 0,1% Toluidinblaulösung für 1 min bei Raumtemperatur. Spülen Sie Rutschen in Leitungswasser für 1 min, dann lufttrockene Rutschen für 10 min.
    3. Coverslip-Dias mit Montagemedium und Auswertung der Anzahl und Verteilung der transplantierten MCs pro Gewebeabschnitte mit einem Lichtmikroskop.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine Übersicht über den Ansatz desMastzell-Knock-insist in Abbildung 1dargestellt und enthält die Erzeugung von BMCMCs, die Anzahl der Zellen, die i.p., i.d. oder i.v. in MC-mäuse einzusiedeln (die Zahl kann variiert werden, wenn sie auf der Grundlage des experimentellen Entwurfs angegeben wird) und das Intervall zwischen Engraftment und Experiment je nach Injektionsstelle (dieses Intervall kann auch variieren, wenn angegeben; z.B.steigt der Gehalt an gespeicherten Mediatoren in MC-Zyto...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fast 30 Jahre nach seiner ursprünglichen Beschreibung38, liefert der Ansatz "Mastzellen-Knock-in" weiterhin wertvolle Informationen darüber, was MCs in vivotun können oder nicht tun können. Die Funktionen von MCs galten lange Zeit als auf ihre Rolle bei Allergien beschränkt. Daten, die mit dem "Mastzell-Knock-in"-Ansatz generiert wurden, haben diese Ansicht geändert, indem sie Beweise dafür liefern, dass MCs unter anderem eine entscheidende Rolle bei der Wirtsabwehr gegen bestimmte K...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

N.G. ist Stipendiat der französischen "Fondation pour la Recherche Médicale FRM" und der Philipp-Stiftung; R.S. wird von der Lucile Packard Foundation for Children es Health und der Stanford NIH/NCRR CTSA Award Nummer UL1 RR025744 unterstützt; P.S. wird unterstützt durch ein Max Kade Fellowship der Max Kade Stiftung und der Österreichischen Akademie der Wissenschaften sowie ein Schroedinger Stipendium des Wissenschaftsfonds (FWF): J3399-B21; S.J.G. unterstützt die Stipendien der National Institutes of Health U19 AI104209, NS 080062 und des Tobacco-Related Disease Research Program an der University of California; L.L.R. unterstützt die Arthritis National Research Foundation (ANRF) und die National Institutes of Health Stipendium K99AI110645.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1% Antibiotisch-antimykotische LösungCorning cellgro30-004-Cl
3 ml SpritzeFalcon309656
35 mm x 10 mm SchaleCorning cellgro430588
5 ml Polystyrol RundbodenröhrchenFalcon352058
Essigsäure GletscherFisher ScientificA35-500
Alcian Blue 8GXRowley Biochemical Danver33864-99-2
Allegra 6R ZentrifugeBeckman
Anti-Maus CD16/32 (Klon 93) AufgereinigteBioscience14-0161-81
2-MercaptoethanolSigma AldrichM7522
BD 1 ml TB SpritzeBD Spritze309659
BD 22 G x 1 (0,7 mm x 25 mm) NadelnBD Precision Glide Nadel205155
BD 25 G 5/8 NadelnBD Spritze305122
BD 30 g x 1/2 NadelnBD Precision Glide305106
Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylen Konisches RöhrchenFalcon352097
ChloroformFisher ScientificC298-500
Cytoseal 60 EinbettmediumRichard-Allan Scientific8310-4
Cytospin3ShandonNA
DakoCytomation penDakoS2002
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1xCorning cellgro15-013-CM
EthanolSigma AldrichE 7023-500ml
Fötales Rinderserum HitzeinaktiviertSigma AldrichF4135-500ml
FITC-konjugiertes IgG2b K Ratten-Isotyp-KontrolleeBioscience14-4031-82
Fluorescein-Isotiocyanat (FITC) Konjugiertes Anti-Maus-KIT (CD117; Klon 2B8)eBioscience11-1171-82
FormaldehydFisher ScientificF79-500
Giemsa-Fleck modifiziertSigma AldrichGS-1L
IsothesieHenry Schein Tiergesundheit29405
May-Grunwald StainSigma AldrichMG-1L
Multiwell 6-Well-PlattenFalcon35 3046
Olympus BX60 MikroskopOlympusNA
Paraplast Plus Tissue Embedding MediumFisher Brand23-021-400
PE Konjugiertes IgG Armenischer Hamster Isotyp KontrolleeBioscience12-4888-81
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 1xCorning cellgro21-040-CV
Phycoerythrin (PE) konjugiertes Anti-Maus-FceRIa (Klon MAR-1)eBioscience12-5898-82
Propidiumiodid-FärbelösungeBioscience00-6990-50
Rekombinante Maus IL-3Peprotech213-13
Safranin-o-zertifiziertSigma AldrichS8884
Gewebekulturflaschen T25 25 cm2Beckton Dickinson353109
Gewebekulturflaschen T75 75 cm2Beckton Dickinson353110
Toluidinblau 1% wässrigLabChem-IncLC26165-2
Rekombinante Maus SCFPeprotech250-03

Referenzen

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