Wir beschreiben eine Methode zur Erzeugung von in vitro abgeleiteten Mastzellen, deren Engraftierung in Mastzell-Mäuse und die Analyse des Phänotyps, der Anzahl und der Verteilung von transplantierten Mastzellen an verschiedenen anatomischen Standorten. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Funktionen von Mastzellen in vivozu bewerten.
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Methodenartikel
Analysieren der Funktionen von Mastzellen in Vivo mit ' MastCell Knock-in' Mäuse
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mastzellen (MCs) sind hämatopoetische Zellen, die in verschiedenen Geweben leben und besonders häufig an Stellen vorhanden sind, die der äußeren Umgebung ausgesetzt sind, wie Haut, Atemwege und Magen-Darm-Trakt. Am besten bekannt für ihre nachteilige Rolle bei IgE-abhängigen allergischen Reaktionen, MCs haben sich auch als wichtige Akteure in der Wirtsabwehr gegen Gift und eindringende Bakterien und Parasiten. MC-Phänotyp und -funktion können durch Mikroumweltfaktoren beeinflusst werden, die je nach anatomischer Position und/oder je nach Art oder Entwicklungsstadium der Immunantworten abweichen können. Aus diesem Grund haben wir und andere In-vivo-Ansätze gegenüber In-vitro-Methoden bevorzugt, um Einblicke in MC-Funktionen zu gewinnen. Hier beschreiben wir Methoden zur Erzeugung von mausknochenknochenförmigen kultivierten MCs (BMCMCs), deren Adoptivübertragung in genetisch MC-defizitierte Mäuse und die Analyse der Anzahl und Verteilung von adoptiert übertragenen MCs an verschiedenen anatomischen Standorten. Diese Methode, die als"Mastzellen-Knock-in"-Ansatz bezeichnet wird, wurde in den letzten 30 Jahren ausgiebig eingesetzt, um die Funktionen von MCs und MC-abgeleiteten Produkten in vivozu bewerten. Wir diskutieren die Vorteile und Grenzen dieser Methode im Lichte alternativer Ansätze, die in den letzten Jahren entwickelt wurden.
Einleitung
Mastzellen (MCs) sind hämatopoetische Zellen, die aus pluripotenten Knochenmarkvorläufern1-3entstehen. Nach der Knochenmarkegression wandern MCs-Vorläufer in verschiedene Gewebe, wo sie sich unter dem Einfluss lokaler Wachstumsfaktoren1-3zu reifen MCs entwickeln. Geweberesidente MCs befinden sich strategisch an Host-Umgebungsschnittstellen, wie der Haut, den Atemwegen und dem Magen-Darm-Trakt, wo sie sich als erste Verteidigungslinie gegen äußere Beleidigungen3-6verhalten. MCs werden häufig auf der Grundlage ihrer "basiskandigen" phänotypischen Eigenschaften und ihrer anatomischen Positionen unterklassifiziert. Bei Mäusen wurden zwei A....
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Protokoll
Alle Tierpflege- und Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health und mit der spezifischen Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee der Stanford University durchgeführt.
1. Erzeugung und Charakterisierung von Knochenmark-abgeleiteten Cultured Mast Cells (BMCMCs).
Hinweis: Spender-BMCMCs sollten aus Knochenmarkzellen mit demselben genetischen Hintergrund wie die Empfänger-MC-Mäuse erzeugt werden. Männliche Spender-BMCMCs sind nicht für die Transplantation von weiblichen Mäusen geeignet. Weibliche Spender-BMCMCs werden erfolgreich in männliche und weib....
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Ergebnisse
Eine Übersicht über den Ansatz desMastzell-Knock-insist in Abbildung 1dargestellt und enthält die Erzeugung von BMCMCs, die Anzahl der Zellen, die i.p., i.d. oder i.v. in MC-mäuse einzusiedeln (die Zahl kann variiert werden, wenn sie auf der Grundlage des experimentellen Entwurfs angegeben wird) und das Intervall zwischen Engraftment und Experiment je nach Injektionsstelle (dieses Intervall kann auch variieren, wenn angegeben; z.B.steigt der Gehalt an gespeicherten Mediatoren in MC-Zyto.......
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Diskussion
Fast 30 Jahre nach seiner ursprünglichen Beschreibung38, liefert der Ansatz "Mastzellen-Knock-in" weiterhin wertvolle Informationen darüber, was MCs in vivotun können oder nicht tun können. Die Funktionen von MCs galten lange Zeit als auf ihre Rolle bei Allergien beschränkt. Daten, die mit dem "Mastzell-Knock-in"-Ansatz generiert wurden, haben diese Ansicht geändert, indem sie Beweise dafür liefern, dass MCs unter anderem eine entscheidende Rolle bei der Wirtsabwehr gegen bestimmte K.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
N.G. ist Stipendiat der französischen "Fondation pour la Recherche Médicale FRM" und der Philipp-Stiftung; R.S. wird von der Lucile Packard Foundation for Children es Health und der Stanford NIH/NCRR CTSA Award Nummer UL1 RR025744 unterstützt; P.S. wird unterstützt durch ein Max Kade Fellowship der Max Kade Stiftung und der Österreichischen Akademie der Wissenschaften sowie ein Schroedinger Stipendium des Wissenschaftsfonds (FWF): J3399-B21; S.J.G. unterstützt die Stipendien der National Institutes of Health U19 AI104209, NS 080062 und des Tobacco-Related Disease Research Program an der University of California; L.L.R. unterstützt die Arthritis National Research Found....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1% Antibiotisch-antimykotische Lösung | Corning cellgro | 30-004-Cl | |
| 3 ml Spritze | Falcon | 309656 | |
| 35 mm x 10 mm Schale | Corning cellgro | 430588 | |
| 5 ml Polystyrol Rundbodenröhrchen | Falcon | 352058 | |
| Essigsäure Gletscher | Fisher Scientific | A35-500 | |
| Alcian Blue 8GX | Rowley Biochemical Danver | 33864-99-2 | |
| Allegra 6R Zentrifuge | Beckman | ||
| Anti-Maus CD16/32 (Klon 93) Aufgereinigt | eBioscience | 14-0161-81 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M7522 | |
| BD 1 ml TB Spritze | BD Spritze | 309659 | |
| BD 22 G x 1 (0,7 mm x 25 mm) Nadeln | BD Precision Glide Nadel | 205155 | |
| BD 25 G 5/8 Nadeln | BD Spritze | 305122 | |
| BD 30 g x 1/2 Nadeln | BD Precision Glide | 305106 | |
| Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylen Konisches Röhrchen | Falcon | 352097 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Cytoseal 60 Einbettmedium | Richard-Allan Scientific | 8310-4 | |
| Cytospin3 | Shandon | NA | |
| DakoCytomation pen | Dako | S2002 | |
| Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x | Corning cellgro | 15-013-CM | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E 7023-500ml | |
| Fötales Rinderserum Hitzeinaktiviert | Sigma Aldrich | F4135-500ml | |
| FITC-konjugiertes IgG2b K Ratten-Isotyp-Kontrolle | eBioscience | 14-4031-82 | |
| Fluorescein-Isotiocyanat (FITC) Konjugiertes Anti-Maus-KIT (CD117; Klon 2B8) | eBioscience | 11-1171-82 | |
| Formaldehyd | Fisher Scientific | F79-500 | |
| Giemsa-Fleck modifiziert | Sigma Aldrich | GS-1L | |
| Isothesie | Henry Schein Tiergesundheit | 29405 | |
| May-Grunwald Stain | Sigma Aldrich | MG-1L | |
| Multiwell 6-Well-Platten | Falcon | 35 3046 | |
| Olympus BX60 Mikroskop | Olympus | NA | |
| Paraplast Plus Tissue Embedding Medium | Fisher Brand | 23-021-400 | |
| PE Konjugiertes IgG Armenischer Hamster Isotyp Kontrolle | eBioscience | 12-4888-81 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 1x | Corning cellgro | 21-040-CV | |
| Phycoerythrin (PE) konjugiertes Anti-Maus-FceRIa (Klon MAR-1) | eBioscience | 12-5898-82 | |
| Propidiumiodid-Färbelösung | eBioscience | 00-6990-50 | |
| Rekombinante Maus IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Safranin-o-zertifiziert | Sigma Aldrich | S8884 | |
| Gewebekulturflaschen T25 25 cm2 | Beckton Dickinson | 353109 | |
| Gewebekulturflaschen T75 75 cm2 | Beckton Dickinson | 353110 | |
| Toluidinblau 1% wässrig | LabChem-Inc | LC26165-2 | |
| Rekombinante Maus SCF | Peprotech | 250-03 |
Referenzen
- Kitamura, Y. Heterogeneity of mast cells and phenotypic change between subpopulations. Annu. Rev. Immunol. 7, 59-76 (1989).
- Galli, S. J., Borregaard, N., Wynn, T. A. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity....
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Nachdrucke und Genehmigungen
