Methodenartikel

Verfahren zur Messung der Aktivität von Deubiquitinierungsenzyme in Zelllinien und Gewebeproben

DOI:

10.3791/52784

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10. Mai 2015

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1Department of Neuroscience, University of Minnesota, 2Institute for Translational Neuroscience, University of Minnesota, 3Department of Obstetrics, Gynecology, and Women’s Heath, University of Minnesota, 4Masonic Cancer Center, University of Minnesota

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Auf den aktuellen Protokollinformationen ein Verfahren zur Messung der Aktivität der funktionell homolog Deubiquitinierungsenzyme. Specialized-Sonden, die das Enzym kovalent modifizieren und lassen für die Erkennung. Dieses Verfahren hält das Potenzial, neue therapeutische Targets zu identifizieren.

Zusammenfassung

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Das Ubiquitin-Proteasom-System wurde vor kurzem in verschiedenen Pathologien einschließlich neurodegenerativen Krankheiten und Krebs in Verbindung gebracht. In diesem Licht sind, Verfahren für die Untersuchung der Regulationsmechanismus des Systems wesentlich, die Aufklärung der zellulären und molekularen Prozesse der zuvor genannten Erkrankungen. Die Verwendung von Hämagglutinin abgeleitet Ubiquitin Sonden vorliegenden Ausführungen dient als wertvolles Werkzeug zur Untersuchung des Systems. Dieses Papier Details eines Verfahrens, das dem Benutzer ermöglicht, Tests, die eine direkte Visualisierung der deubiquitinierenden Enzymaktivität geben, durchzuführen. Deubiquitinierungsenzyme steuern proteasomalen Abbau und teilen funktionelle Homologie in ihren aktiven Zentren, die es dem Benutzer, um die Aktivität mehrerer Enzyme in einem Test untersucht werden können. Lysate werden durch sanfte mechanische Zellaufschluss erhalten und mit der aktiven Stelle gerichtet Sonden inkubiert. Functional Enzyme werden mit den Sonden markiert, während inaktiver Enzyme ungebunden bleiben. Durch Laufning dieser Test erhält der Benutzer Informationen sowohl über die Aktivität und möglichen Expression mehrerer Deubiquitinierungsenzyme in einer schnellen und einfachen Weise. Das gegenwärtige Verfahren ist wesentlich effizienter als die Verwendung von einzelnen Antikörper für die vorhergesagten hundert Deubiquitinierungsenzyme in der menschlichen Zelle.

Einleitung

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Der Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) als eine der wichtigsten Abbauwege in der Säugerzelle ist. Substrate für den Abbau im Proteasom gebunden sind kovalent mit Polymeren von Ubiquitin (Ub) 1 markiert. Bevor die gezielte Substrat das Proteasom für den Abbau eintritt, muss der Poly-Ubiquitin-Tag entfernt werden. Eine Klasse von Enzymen als Deubiquitinierungsenzyme (DUBs) bekannt ist, ist für die Beseitigung und Verwertung von Ubiquitin-Moleküle 2 verantwortlich. Es wurde aus dem menschlichen Genom vorhergesagt, dass es fast hundert DUBs arbeiten in der Zelle 3. Mit solch einer großen Anzahl von DUBs Steuerung Ub-vermittelte zelluläre Prozesse, das Studium dieser Enzyme ist eine Herausforderung, da mRNA Techniken nicht geben Auskunft über Aktivität und Western-Blot nur gibt Informationen über die Expressionsniveaus.

Die Verwendung von Influenza-Hämagglutinin (HA) versehen, Ub abgeleitete aktive Zentrum gerichteten Sonden ermöglicht eine kovalente modifizierung der funktionellen DUBs und deshalb ergibt eine direkte Visualisierung der Aktivität dieser Enzyme auf einem Western-Blot-4. Die Sonden haben eine C-terminalen Thiol reaktionsfähigen Gruppe, die als Suizid-Substrat für das aktive Zentrum Cysteinrest 5 dient. Bei diesen Sonden ist es möglich, die Aktivität und möglichen Expression vieler DUBs unter beiden pathologischen und physiologischen Zuständen der Zelle zu untersuchen.

Änderungen DUB Aktivität wurden in einer Reihe von pathologischen Zuständen, wie Parkinson, Alzheimer, Anämie und verschiedene Krebs 6-10 gebracht. Diese Technik bietet ein leistungsstarkes Werkzeug zur Untersuchung von Krankheiten. In der vorliegenden Arbeit zeigen wir die Anwendung dieser Technik in HeLa und M17-Zellen unter Verwendung von Glasperlen, die aufgeschlossen haben. Zusätzlich beschreiben wir, wie man diese Methode in der Maus Rückenmark Gewebeproben zu verwenden. Die von dieser Technik erhaltenen Informationen können als Ausgangspunkt für die Identifizierung verwendet werdentherapeutische Ziele sowie die Schaffung Modelle für die Untersuchung von verschiedenen Krankheitszuständen. Der wahre Nutzen dieser Technik liegt in ihrer Fähigkeit, Informationen zu mehreren DUBs in einem einzigen Assay bereitzustellen.

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Protokoll

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1. Lysis Buffer Vorbereitung

  1. Löse Saccharose in deionisiertem (DI) Wasser, um eine 2 M Stammlösung zu machen. Filtern einer 2 M Lösung von Saccharose mit einer Vakuum angetrieben 0,22 um aus Polyvinylidenfluorid (PVDF) Filter.
  2. Löse Dithiothreitol (DTT) in DI-Wasser, um eine 500 mM-Stammlösung und speichern unter anaeroben Bedingungen zu machen. Löse Magnesiumchlorid (MgCl 2) in DI-Wasser, um eine 100 mM-Stammlösung zu machen. Löse Adenosintriphosphat (ATP) Dinatrium-Hydrat in DI-Wasser, um eine 50 mM Stammlösung zu machen.
  3. Bilden eine Tris-Lösung bei pH 7,4 durch Auflösen Trizma-Hydrochlorid in entionisiertem Wasser und Einstellen des pH unter Verwendung von Natriumhydroxid (NaOH).
  4. Kombinieren Abschnitte der Stammlösungen in VE-Wasser auf einen Lysepuffer mit einer Saccharose-Konzentration von 250 mM, DTT einer Konzentration von 1 mM, einer MgCl 2 -Konzentration von 5 mM, einem ATP-Konzentration von 1 mM und einer Tris-Konzentration von 50 mM zu machen . Beispielsweise mischen 535,3 ul Tris, 500 & mgr; l MgCl 2, 1,25 ml Saccharose, 20 & mgr; l DTT, 200 & mgr; l ATP und 7,4947 ml DI-Wasser, um 10 ml Lysepuffer. Dies kann etwa 20 Experimente eingesetzt werden.

2. Kultivieren von Zellen für das Experiment

  1. Stellen Medien durch Aliquotieren von 30 ml DMEM + 10% fötalem Rinderserum (FBS) in einem 50 ml konischen Röhrchen.
  2. Übertragen gefrorenen M17 oder HeLa-Zellen aus Flüssigstickstofflager um einen kleinen Becher mit lauwarmem Wasser.
  3. Übertragen der Zellen an die 50 ml konischen Röhrchen. Fügen Sie zunächst einige Medien zur Zellfläschchen. Dann übertragen Sie die resuspendierten Zellen innerhalb von 5 Sekunden nach dem Auftauen.
  4. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 450 xg für 5 min, um ein Zellpellet zu erhalten. 20 ml Medium in einem T75-Kolben.
  5. Entfernen Sie die Medien aus den Zellen mit Absaugung. Mit 5 ml frischem Medium zu dem Zellpellet und resuspendieren.
  6. Übertragen die 5 ml Zellsuspension in 20 ml Medium in T75-Kolben und Inkubieren bei 37 ° C. Change die Medien alle 3 Tage.

3. Zellernte

  1. Entfernen Sie die Medien über Saug-, man aufpassen, die Zellen nicht zu berühren.
  2. Mit 5 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen, die Zellen. Entfernen PBS mit Absaugung.
  3. 3 ml Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) an den T75-Kolben und Inkubieren bei 37 ° C für 3 min.
  4. 6 ml frischem Medium in den Kolben gegeben und die Zellen resuspendieren.
  5. Übertragen Sie die Suspension auf eine 15 ml konischen Rohr und Zentrifuge bei 290 xg 5 Minuten.
  6. Entfernen Sie den Überstand und 5 ml PBS. Klopfen Sie leicht den Boden der Röhre zum Aufbrechen der Pellets. Zentrifuge bei 290 × g für 5 min.
  7. Wiederholen Sie Schritt 3.6 dreimal.
  8. Entfernen PBS und Resuspendieren der Zellen in 1 ml frischem PBS. Übertragen auf die Eppendorf-Röhrchen (1,5 ml). Spin bei 290 xg für 5 min.

4. Cell Lysis

  1. Messen Sie den ungefähren Volumen des Pellets mit einer Pipette eind abwiegen Glasperlen in einer Masse: Volumen-Verhältnis von 1: 1. Ist die doppelte Volumen des Pellets in Lyse-Puffer.
    Hinweis: Fügen Sie den Puffer vor der Zugabe der Glasperlen.
  2. Lysieren die Zellen im Eppendorf-Röhrchen bei der maximalen Rühren für 30 min bei 4 ° C durch Verwirbeln in einem kalten Raum.
  3. Kurz zentrifugieren bei 200 · g für 30 Sekunden, um die Perlen zu begleichen. Sammeln Sie den Überstand.
  4. Das gleiche Volumen von Glasperlen als vor dem Überstand.
  5. Wirbel wieder bei maximaler Rühren für 30 min bei 4 ° C.
  6. Kurz zentrifugieren bei 200 · g für 30 Sekunden, um die Glasperlen zu begleichen. Sammeln Sie den Überstand.
  7. Zentrifuge bei 5.030 xg für 5 Minuten, um die Kerne, Membranen und aufgebrochene Zellen zu entfernen. Sammeln Sie den Überstand, der das Zell-Lysat ist.

5. Gewebehomogenisierung

  1. Einen Masse: Volumen von 1: 9 Lösung von Maus-Rückenmarkgewebe zu Lysepuffer.
    Hinweis: Dieses Verfahren ist für eine Vielzahl von unterschiedlichent Gewebeproben.
  2. Homogenisierung mittels einer Einstellung der Ebene 2 auf der Homogenisator 30 sec lang in das Gewebe, um sicherzustellen, daß es keine Klumpen bleiben.
  3. Spin down bei 5.030 × g für 3 min, um die Kerne, Membranen und aufgebrochene Zellen zu entfernen.
  4. Sammeln Sie den Überstand, der das Lysat.

6. Proben Derivatisierung

  1. Führen eine Bicinchoninsäure (BCA) in einer 96-Well-Platte Analyse, um die Proteinkonzentration der Gewebelysat Verwendung eines kolorimetrischen 96-Well Plattenlesegerät, wie durch den Pierce BCA Protein Assay Kit Protokoll spezifiziert zu bestimmen.
  2. Bringen eines Aliquots, die 20 & mgr; g Gesamtprotein zu 50 & mgr; l mit deionisiertem (DI) Wasser.
  3. Add 2 ul 1,35 uM HA-Ub-Vinylsulfon (VS) zu der Lösung und Inkubation für 1 h bei 37 ° C. Dies führt zu 20 ug Lysat bis 50 nM Sonde in der endgültigen Reaktionsmischung. Dies ist zum großen molaren Überschuß an Kennzeichnungs funktioneller DUBs gewährleisten.
  4. ICHncubate die Probe in Laemmli-Probenpuffer für 5 Minuten bei 95 ° C. Für eine 52 & mgr; l Reaktionsvolumen Einsatz 26 ul 2x Probenpuffer, 13 ul Probenpuffer 4x oder 6x 8,87 ul Probenpuffer.
  5. Kühle auf Eis vor dem Laden des Gels.

7. Western Blot

  1. Laden Sie eine 12-Well-4-20% Tris-Glycin-Gel mit 40 ul der vorbereiteten Probe
  2. Führen Sie das Gel bei 95 V, bis der Ionenfront den Boden erreicht.
  3. Führen Sie eine Übernachtung Transfer des Gels auf eine Polyvinylidendifluorid (PVDF) Membran.
  4. Inkubieren der Membran in dem Amidoschwarz Fleck und tasten den membane um ein Bild, das die Menge an Protein in jeder Spur erhalten.
  5. Entfärben der Membran und Inkubation in 5% Milch in PBS für 1 Stunde zu blockieren.
  6. Inkubieren der Membran in dem primären anti-HA-Antikörper in einer Konzentration von 1: 10.000 in 5% Milch in PBS entweder über Nacht bei 4 ° C oder für 4 h bei Raumtemperatur.
  7. Führen Sie 3 Waschungen foder jeweils 5 min in PBS mit 0,1% Tween-20 Detergens.
  8. Inkubieren der Membran in eine Maus Meerrettichperoxidase in einer Konzentration von 1: 10.000 in 5% Milch in PBS für mindestens 2 Std.
  9. Zuführen 3 Waschungen jeweils 5 min in PBS mit 0,1% Tween-20 Detergens.
  10. Führen Sie 1 Wasch für 5 min in PBS.
  11. Inkubieren der Membran in eine chemilumineszierende Nachweisreagenz für 10 min und zu detektieren unter Verwendung eines Chemilumineszenz-Detektor. Verwenden Sie die automatische Belichtungseinstellung auf dem Detektor.

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Ergebnisse

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Kultiviert M17 und HeLa-Zellen wurden unter Verwendung des Verfahrens in dem Protokoll (3. Zellernte) detailliert und Maus-Rückenmarksgewebe wurde erhalten geerntet. Das Zellpellet / Rückenmarksgewebe wurde in ein Röhrchen mit der in der Zubereitung der Reagenzien beschrieben Lysepuffer gegeben. Zellpellets mit Glasperlen (1A) und Rückenmark der Maus Gewebeproben wurden unter Verwendung eines Homogenisators (1B) homogenisiert lysiert. Nach der Lyse oder Homogenisierung wurde die Probe d...

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Diskussion

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Seit Ubiquitinierung ist eine grundlegende zelluläre Aktivität, könnte das Verständnis der Regulationsmechanismen der Schlüssel, um auszugraben die Prozesse der Krankheit und Pathologie. Die Verwendung von HA getaggt Ub abgeleitete aktive Zentrum gerichteten Sonden hier berichteten bietet eine einfache, aber sehr zutreffend Methode zur Untersuchung Ub-vermittelten Proteinabbau. Dieses Verfahren ist schneller und weniger kostspielig als das Studium jedes der DUBs einzeln.

In diesem Verfahren ...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

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Wir möchten die Lee-Labor der Universität von Minnesota für die Bereitstellung der Maus Rückenmark Gewebeproben, die verwendet wurden bedanken. Diese Arbeit wurde durch das Department of Defense Ovarian Cancer Research Program (OCRP) OC093424 auf MB, die von den Randy Shaver Cancer Research und Gemeinschaftsfonds zur MB und die Minnesota Ovarian Cancer Alliance (MOCA) bis MB. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerhebung und -analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder zu Erstellung des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
PowerGen 125 (Homogenisator)Fischer Scientific14-261-02P
Vakuum-Filter 0,22 & Mikro; mBPV2210
Glasperlen, säuregewaschen & le; 106 &Mikro; m (~140 U.S. Siebe)Sigma-AldrichG4649-10G
SaccharoseFischerScientific S6-212
DL-DithiothreitolSigma-AldrichD0632
MagnesiumchloridSigma-AldrichM8266
Adenosin 5'-triphosphat DinatriumsalzhydratSigma-AldrichA26209
Trizma HydrochloridSigma-AldrichT3253
Dulbecco's Modified Eagle MediumLife Technologies11965-092
Phosphatgepufferte KochsalzlösungLife Technologies10010-023
Gewebekulturkolben 75 cm2 mit Filterbecher 250 ml 120/csCellstarT-3001-2
0,05% Trypsin-EDTA (1x)Life Technologies25300-054
HI FBSLife Technologies16140-071
Monoklonaler Anti-HA-Antikörper, hergestellt in MausSigma-AldrichH9658
Ubiquitin-Vinylsulfon (HA-Tag)Enzo Life SciencesBML-UW0155-0025
Laemmli's SDS-Probenpuffer (4x, reduzierend)Boston BioProductsBP-110R
Pierce BCA Protein Assay-KitThermo Scientific23225

Referenzen

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  1. Ovaa, H., Kessler, B. M., Rolén, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).
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Schlagwörter

Deubiquitinating Enzyme ActivityHA Derived ProbesWestern Blot AnalysisCell Lysate PreparationMechanical Cell LysisProtein Concentration AssayChemiluminescent DetectionActive Site LabelingEnzyme Activity ProfilingPVDF Membrane Transfer

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