Hier präsentieren wir ein Protokoll für die direkte stereotaktische Gehirninfusion von Amyloid-beta. Diese Methodik bietet ein alternatives In-vivo-Mausmodell, um die kurzfristigen Auswirkungen von Amyloid-Beta auf Gehirnneuronen zu untersuchen.
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Methodenartikel
Stereotaktische Infusion von oligomeren Amyloid-beta in die Maus-Hippocampus
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Alzheimer-Krankheit ist eine neurodegenerative Erkrankung, die die Alterung der Bevölkerung. Ein wesentliches Merkmal der neuropathologischen Erkrankungen ist die Überproduktion von Amyloid-beta und die Ablagerung von Amyloid-beta-Plaques in Hirnregionen der betroffenen Individuen. Im Laufe der Jahre haben Wissenschaftler zahlreiche Alzheimer Mausmodelle, die die Amyloid-beta-Pathologie zu replizieren versuchen generiert. Leider sind die Maus-Modellen nur selektiv imitieren die Krankheitsmerkmale. Neuronalen Tod, ein bekannter Effekt im Gehirn von Alzheimer-Patienten wird spürbar fehlt in diesen Mäusen. Formen von Amyloid-beta, die nachweislich die meisten Neuronen toxisch zu sein - - stereotaktisch in das Gehirn Daher haben wir und andere ein Verfahren zum direkten Infusion löslichen oligomeren Spezies von Amyloid-beta beschäftigt. In diesem Bericht verwenden wir männliche C57BL / 6J-Mäusen, diese Operationstechnik zur Erhöhung Amyloid-beta Ebenen in einer ausgewählten Region des Gehirns zu dokumentieren. DieInfusions Ziel dem Gyrus dentatus des Hippocampus, weil diese Gehirnstruktur, zusammen mit dem basalen Vorderhirns, die durch das cholinerge Schaltung verbunden ist, für einen der Bereiche der Degeneration bei der Krankheit. Die Ergebnisse der Hebe Amyloid-beta im Gyrus dentatus über stereotaktischen Infusions offenbaren Steigerungen Verlust von Nervenzellen im Gyrus dentatus innerhalb von 1 Woche, während es einen entsprechenden Anstieg in Zelltod und cholinergen Neuronenverlust in der vertikalen Schenkel des diagonalen Bandes von Broca des basalen Vorderhirns. Diese Effekte werden bis zu 2 Wochen beobachtet. Unsere Daten weisen darauf hin, dass die aktuelle Beta-Amyloid-Infusion Modell bietet eine alternative Maus-Modell zu Region spezifische Neuronen Tod in einem kurzfristig anzugehen. Der Vorteil dieses Modells ist, dass Amyloid-beta in einer räumlichen und zeitlichen Weise erhöht werden.
Einleitung
Amyloid Plaque-Ablagerungen, die von Amyloid-beta (1-42 A & bgr;) zusammengesetzt sind, sind ein wesentliches Merkmal der Pathologie der Alzheimer-Krankheit (AD). Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass hohe oder toxischen Mengen von rekombinantem oligomeren Aß 1-42 entlocken neuronalen Tod, synaptic Dystrophie, Verlust und Funktionsstörung; sowie Lern- und Gedächtnisdefizite 1-4. Hirnregionen betroffen sind der Hippocampus, die Rinde, und subkortikalen Strukturen wie dem basalen Vorderhirns und der Amygdala 5,6. Bis heute gibt es mehrere transgene Mausmodelle, die den A & bgr; 1-42 Pathologie von AD zu simulieren....
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Protokoll
Hinweis: Für alle Tierversuche, institutionelle und nationale Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren wurden befolgt.
1. Bereiten Sie Chirurgische Instrumente und Lösungen für die Chirurgie
- Autoklaven alle chirurgischen Instrumenten aus Edelstahl.
- Bereiten Sie 70% Ethanol durch Verdünnen 200 proof absolutes Ethanol mit sterilem molekularen Grad entionisiertem, destilliertem Wasser.
- Bringen Sie die 29 G Nadel auf die Hamilton-Spritze. Das Innere des Hamilton-Spritze und Nadel reinigen durch die Ausarbeitung und Auswerfen nanoreinem Wasser wiederholt für 1 min. Wiederholen Sie diesen Vorgang m....
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Ergebnisse
Das vorliegende Verfahren zur Herstellung von humanem rekombinantem oligomeren A & bgr; 1-42 ergibt lösliche oligomere Spezies, bestehend aus Monomeren, Dimeren, Trimeren und Tetrameren (1A). Diese niedermolekularen Aß 1-42 Spezies, aber nicht die Fibrillen und Plaques wurden in zahlreichen Einstellungen gezeigt, die meisten Neuronen toxisch 1,4,9,17-19 sein. Um festzustellen, ob oligomeren Aß 1-42 induziert Neuron Tod im Gehirn der Maus Aß 1-42.......
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Diskussion
Um eine erfolgreiche Aß 1-42 Injektion erreichen der Experimentator oder Chirurg muss: 1) Verwenden Sie aseptische Technik; 2) richtig das Gehirn Region von Interesse mit genauen Koordinaten zu identifizieren; 3) in der Lage sein, um die Maus richtig zu sichern in der stereotaktischen Rahmen mit dem Gehirn in den AP und ML-Achse nivelliert; 4) die Fähigkeit, den Mikromanipulator mit Präzision zu arbeiten; 5) eine ordnungsgemäße post-operative Betreuung. Wenn diese Taste Schritte befolgt werden die Maus sollte.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde vom Nationalen Institut für neurologische Erkrankungen und Schlaganfall unterstützt gewähren NS081333 (CMT), Alzheimer-Gesellschaft Zuschuss nirgens-10-171721 und National Institute of Mental Health Zuschuss MH096702 (bis UH) und National Institute on Aging geförderte Alzheimer-Forschung Center an der Columbia University Pilot Zuschuss AG008702 (bis YYJ und JB).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Ketamin HCl (100 mg/ml) | Henry Schein Medical | 1049007 | 100 mg Ketamin pro 1 kg Tier |
| Xylazin (20 mg/ml) | Henry Schein Medical | nicht verfügbar | 10 mg Xylazin pro 1 kg Tier |
| Buprenex (0,3 mg/ml) | Henry Schein Medical | 1217793 | 0,1 mg Buprenex pro 1 kg Tier |
| Aβ 1-42 | David Teplow/UCLA | nicht verfügbar | 100 μ M; Dieses Amyloid wurde in der Arbeit |
| Aβ 1-42 | Bachem | H-1368 | Kann anstelle von Amyloid aus dem Teplow Labor |
| A&beta verwendet werden; 1-42 | American Peptide | 62-0-80B | Kann anstelle von Amyloid aus dem Teplow-Labor |
| verwendet werden Scrambled Aβ 1-42 | American Peptide | 62-0-46B | Kann als Kontrollpeptid zum Vergleich von A & beta verwendet werden; 1-42 |
| NU4 Antikörper (oligomerer Amyloid-Antikörper) | Geschenk von William Klein/Northwestern U. | nicht verfügbar | 1:2.000 Verdünnung |
| Anti-Amyloid Oligomer Antikörper (Polyklonales Kaninchen) | EMD Millipore | AB9234 | Kann anstelle von Nu4 verwendet werden; muss vom Endbenutzer getestet werden |
| 6E10 Antikörper (monoklonale Maus) (Amyloid-Antikörper) | Biolegend | sig-39320 | 1:1.000 Verdünnung |
| ChAT Antikörper (polyklonale Ziege) | Millipore | AB144P | 1:100 Verdünnung |
| DeadEnd Fluorometrisches TUNEL-System | Promega | G3250 | Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für Verwenden |
| Sie Prolong Gold Antifade Reagenz mit DAPI | Invitrogen | P36935 | Verwenden Sie es beim Eindecken von Objektträgern |
| Fluorogold | Fluorochrome, LLC | nicht verfügbar | 2% Lösung |
| Absolutes Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | Zur Herstellung von 70% Ethanol zur Desinfektion und Desinfektion von |
| Novex 10-20% Tricin Gel | Life Technologies | EC6625BOX | Zur Trennung von Aβ 1-42 |
| Novex Tricin SDS Running Buffer (10X) | Life Technologies | LC1675 | Zum Laufen von 10-20% Tricin-Gelen |
| Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Life Technologies | LC3675 | Zum Übertragen von 10-20% Tricin-Gelen |
| SuperSignal Western Blot Enhancer | Thermo Scientific | 46640 | Zur Verbesserung von AΒ 1-42 Signal; Befolgen Sie das Protokoll des Herstellers |
| Protran BA79 Nitrocellulose-Blotting-Membran, 0,1 μ m | GE Healthcare Life Sciences | 10402088 | Für den Transfer von 10-20% Tricin-Gelen |
| Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | Elektrophorese-Aparatus für den Transport von 10-20% Tricin-Gelen |
| GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | nicht verfügbar | Zum Feuchthalten der Mausaugen während der Operation; erhältlich in örtlichen Apotheken |
| [header] | |||
| Refresh Optive Lubricant Eye Drops | Allergan | nicht verfügbar | Um die Augen der Maus während der Operation feucht zu halten; kann in örtlichen Apotheken gefunden werden; Kann anstelle von GenTeal |
| Betadine | Stoelting | 50998 | verwendet werden Zur Desinfektion und Desinfektion |
| von runden/konischen Spateln | VWR | 82027-490 | Zum Öffnen des Tiermauls |
| Bulldog Serrefines Klemmen (Maulmaße 9X1,6 mm; Länge 28 mm) | Fine Science Tools | 18050-28 | Optional; Zum Auseinanderhalten der Kopfhaut während der |
| Injektion Gerade Feinschere (Schneide 25 mm; Länge 11,5 cm) | Fine Science Tools | 14060-11 | Zum Schneiden der Kopfhaut |
| #3 Skalpellgriff | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| #11 Chirurgische Klinge | Fine Science Tools | 10011-00 | Zum Durchführen von Kopfhautschnitten |
| Student Standard Pattern Pinzette (Spitzenmaße 2,5x1,5 mm; Länge 11,5 cm) | Fine Science Tools | 91100-12 | Zum Schließen der Kopfhaut während des Nähens |
| Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | Zum Rasieren von Haaren |
| T/Pump Warmwasser-Umwälzer | Kent Wissenschaftlich | TP-700 | Zum Erwärmen von Tieren während der Operation |
| Wiederverwendbares Warmining Pad (5" x 10") | Kent Scientific | TPZ-0510FEA | Zur Befestigung an der T/Pump-Warmwasserumwälzung, um das Tier während der Operation zu erwärmen |
| Akku-Mikrobohrer | Stoelting | 58610 | Verwenden Sie 0,8 mm Stahlfräser, um Löcher in den Schädel zu bohren |
| Laborstandard-Stereotaxisches Instrument mit Maus & Neugeborenen-Rattenadapter | Stoelting | 51615 | |
| Nur für Maus Stereotaktisches Instrument | Stoelting | 51730 | Kann dies anstelle von Stoelting Cat. #51615 |
| Quintessential Stereotaxic Injector | Stoelting | 53311 | |
| Trockener Glasperlensterilisator | Stoelting | 50287 | Zum Sterilisieren von Edelstahlinstrumenten |
| Steriles chirurgisches Tuch (18" x 26") | Stoelting | 50981 | |
| Hamilton Spritze 50 ml, Modell 705 RN SYR, NDL | Hamilton Company | 7637-01 | Für die Injektion in das Gehirn; verwenden Sie verschiedene Spritzen für verschiedene Lösungen |
| 29 G Nadel, kleine Nabe RN NDL | Hamilton Company | 7803-06 | Zum Befestigen an der Hamilton Spritze für die Injektion des Gehirns |
| 1 ml BD Tuberkulinspritzen | VWR | BD309659 | Für die Verabreichung von Anästhesie und Kochsalzlösung |
| 30 G Nadel (0,5") | VWR | BD305106 | Für die Verabreichung von Anästhesie und Kochsalzlösung |
| Tragbare elektronische Waage der CS-Serie (Ohaus) | VWR | 65500-202 | Zum Wiegen von Tieren zur Bestimmung der Anästhesiedosis |
| Heizplatte (obere Platte mit Abmessungen 7,25 x 7,25 Zoll) | VWR | 47751-148 | Zum Erwärmen von Tieren nach der Operation |
| Sofsilk Silk Suture C-1 Cutting 3/8, 12 mm | Covidien | S1173 | Zum Verschließen von |
| Wunden Vetbond Tissue Adhesive (3M) | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | Optional: zur Unterstützung des Wundverschlusses; Mit Naht verwenden. |
| Sterile Applikatoren mit Holzschaft aus Baumwolle | Fisher scientific | 22-029-488 | Zum Reinigen und Trocknen von Operationswunden |
| Fisherbrand Superfrost Plus Objektträger | Fisher Scientific | 12-550-15 | Zum Sammeln von Hirnschnitten |
| VWR Micro Cover Glass 24 X 50 mm | VWR | 48393241 | Zum Montieren von Objektträgern |
| Thermo Scientific Nalgene Spritzenfilter 0,2 μ m | Fisher Scientific | 194-2520 | Zum Sterilisieren von Kochsalzlösung |
| Sterile Hautmarker mit zwei Spitzen von Viscot Medical | Medline | VIS1422SRL91 | Zum Markieren von Koordinaten auf dem Schädel |
Referenzen
- Baleriola, J., et al. Axonally Synthesized ATF4 Transmits a Neurodegenerative Signal across Brain Regions. Cell. 158 (5), 1159-1172 (2014).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegener....
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Nachdrucke und Genehmigungen
