Encapsulation Thermogenic Präadipozyten für die Transplantation in Fettgewebe Depots

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Verkapselung von katabolen Zellen, die Lipide für die Wärmeerzeugung im intraabdominalen Fettgewebe verbrauchen und die Energiedissipation bei adipösen Mäusen erhöhen.

Zusammenfassung

Verkapselung von Zellen entwickelt worden, um lebensfähige Zellen in semipermeable Membranen einschließen. Die transplantierten Zellen können eingekapselt Gewicht niedermolekularen Metaboliten in Gewebe des behandelten Wirts austauschen, um langfristiges Überleben zu erreichen. Die semipermeable Membran ermöglicht engrafted eingekapselten Zellen um die Abstoßung durch das Immunsystem zu vermeiden. Die Verkapselung Verfahren wurde entwickelt, um eine kontrollierte Freisetzung von bioaktiven Verbindungen, wie Insulin, andere Hormone und Cytokine aktivieren. Hier beschreiben wir eine Methode zur Verkapselung von Abbauzellen, die Lipide für die Wärmeerzeugung und Energieverlust (Thermogenese) im intra-abdominale Fettgewebe von fettleibigen Mäusen verbrauchen. Verkapselung von thermogenic katabolen Zellen können potentiell für die Prävention und Behandlung von Fettleibigkeit und Typ-2-Diabetes. Eine weitere mögliche Anwendung der katabolen Zellen können Entgiftung von Alkoholen oder anderen toxischen Metaboliten und Umweltschadstoffe sind.

Einleitung

Zunehmende Häufigkeit von chronischen Krankheiten ¹ hat Studien über die Transplantation von therapeutischen Zellpopulationen ² stimuliert. Syngenen oder allogenen Stammzellen sind die am häufigsten verwendeten Zelltypen für diese Anwendungen ^2. Jedoch sind diese Behandlungen nicht erlauben Steuerung Differenzierung und Migration von Stammzellen nach der Implantation und sind nicht kosteneffizient. Die Transplantation von genetisch modifizierten Zellen mit nützlichen Funktionen rechnet die Verbesserung der Behandlung vieler Krankheiten. Allerdings sind genetische Zell Änderungen durch den Host-Immunsystem erkannt, deshalb diese Behandlungen benötigen Immunsuppression ^3. Verkapselung von Zellen, die Insulin wurde von Dr. Chang ⁴ entwickelt. Die Technik basiert auf Verkapselung der Zellen im Alginat-Tröpfchen, die in einer Calciumchloridlösung eingetaucht sind, beruht. Alginat Moleküle aus Mannuronsäure (M) und Guluronsäure (G) und können durch Ca ²⁺ verbunden werden. Nach der Gelierung werden die Perlen ein Poly-L-Lysin (PLL) suspendiert. Während dieser Stufe bindet PLL bis G und M in der Alginat-Moleküle, die die Kapselmembran herstellt. Die Porosität der Kapselmembran kann durch Variation der M und PLL-Konzentrationen, die Inkubationszeit und der Temperatur moduliert werden. Die Bindung von PLL hängt auch von der Art und Konzentration des Alginats. Alginat Matrizen mit Ca ²⁺ -Ionen vernetzt, sind instabil in der physiologischen Umgebung oder in gemeinsamen Pufferlösungen mit einer hohen Konzentration an Phosphat und Citrationen. Diese Puffer können Ca ²⁺ aus dem Alginat zu extrahieren und zu verflüssigen den Kern. Verflüssigung des Alginats Kern schafft Platz in den Kapseln für die zelluläre Bewegung und Wachstum. Zellen in polyanionischen Alginats mit polykationische Poly-L-Lysin (APL) eingekapselt sind undurchlässig für Immunglobuline aber Zustrom von Nährstoffen und Ausstrom von Toxinen. Objekte Das APL ermöglichen die langfristige survival von verkapselten Zellen nach Transplantation in genetisch verschiedenen Hosts. Elliott et al. Berichteten über die Überlebensrate von funktionierenden eingekapselt Schweinepankreaszellen in einem menschlichen Patienten neun Jahre nach der Implantation ^5.

Verkapselungstechniken können in Mikroverkapselung (3-800 & mgr; m) und Makroverkapselung (größer als 1000 & mgr; m) klassifiziert werden. Mikrokapseln sind haltbarer als Makrokapseln ^6. Seit seiner Entdeckung durch Dr. Chang und seine Kollegen im Jahr 1964, Mikroverkapselung wurde in großem Umfang für die Verkapselung von anabolen Zellen Insulin produzieren, andere Hormone, und bioaktive Moleküle ⁷ verwendet. Diese Behandlungen konfrontiert mehrere Herausforderungen in das Wirtsgewebe einschließlich Fibrose und Immunantwort ^8. Anfänglich sind die Nebenwirkungen auf die Qualität des Biopolymeren bezogen wurden gelöst. Jedoch Transplantation von anabolen Zellen noch initiiert Nebenwirkungen, wie Fibrose infolge der Hormon overproduktion außerhalb eines spezialisierten Drüse.

In den letzten Jahrzehnten, Fettleibigkeit und Typ-2-Diabetes hat epidemische Ausmaße erreicht ^9. Mehr als 30% der erwachsenen Menschen weltweit sind übergewichtig und fettleibig ^10. Vermehrtem intraabdominellen (IAB) Fettbildung erhöht die Inzidenz der chronischen Entzündung und fördert die Typ-2-Diabetes, Herz-Kreislauf- Erkrankungen, bestimmte Krebsarten und andere Begleiterkrankungen ^11-13. Mehrere Beweis vorgeschlagen, dass Pathogenese mit IAB Fett verbunden sind, können durch spezifische Fettzellen verhindert werden. Jüngste Studien haben gezeigt, dass die Transplantation von subkutanen Fettzellen in IAB-Region kann den Stoffwechsel zu verbessern und die Adipositas und Insulinresistenz bei Nagern in vivo ¹⁴ gezeigt. Senkung von Adipositas und Insulinresistenz mit thermogenic Adipozyten Energie aufnehmend in Form von Wärme ^15,16 in Verbindung gebracht. Thermogenic Änderung der Fettzellen kann durch eine stabile Transfektion erreicht werdenvon Genen, die an der mitochondrialen Protonenentkopplungs wie Abkoppeln Protein 1 (UCP1) oder von Genen regulieren die Expression von UCP1 und andere thermogene Gene ^15,16. Unsere bisherigen Studien zeigten, dass Mängel in der Aldehyddehydrogenase 1 a1 (Aldh1a1) führt zum thermogene Remodellierung von Iab Fett, Fettsucht und Insulinresistenz bei diesen Mäusen ^17,18 verringert. Bemerkenswert ist, Verkapselung von thermogenic Aldh1a1 mangel (Aldh1a1 - / -) Präadipozyten vermittelt gleiche therapeutische Wirkung im IAB Fett bei übergewichtigen Wildtyp-Mäusen, was darauf hindeutet, neue therapeutische Möglichkeiten zur Behandlung der IAB-Fett ^18. In experimentellen Einstellungen verkapselten Zellen können die Forscher die Auswirkungen spezifischer Zellpopulationen in einer kosteneffektiven Weise ¹⁹ zu studieren. Hier diskutieren wir die Methode der Verkapselung eines thermogene katabolen Zelllinie und ihre Labor und therapeutische Anwendung in einem Mausmodell für Fettleibigkeit. Das Protokoll beschreibt three Phasen für die Mikrokapselherstellung (Abbildung 1): die Bildung von Alginat-Mikrokugeln (Figur 1A), die Bildung der polykationische Poly-L-Lysin (PLL) Membranen, die auf der Oberfläche der Mikrokügelchen, (1B), und das Entfernen des Alginat-Kerne (1C).

Protokoll

Das Studienprotokoll wurde von der Ohio State University Ethikkommissionen genehmigt. Tierversuche wurden von IACUC Protokoll genehmigt. Alle Verfahren wurden unter der Ebene 2 Biosicherheitswerkbank mit laminaren Strömung durchgeführt. Wir folgten alle Standard-Sicherheitsanforderungen und Verfahren. Die Mikroverkapselung Technik zur Herstellung von Mikrokapseln wurde beschrieben als ^{17, 18} durchgeführt.

1. Vorbereitungen für Werkstoff

1. Herstellung von 10 ml der 2% igen Natriumalginatlösung in autoklaviert physiologische Salzlösung (0,9% NaCl in Wasser). Vorzubereiten 0,05% PLL-Lösung in physiologischer Kochsalzlösung. Bereiten Sie diese Lösungen am Tag vor und über Nacht gerührt. Filtern Sie die Lösungen mit 0,22 um Filter vor dem Gebrauch.
2. Vorbereitung 50 mM Natriumcitrat und 100 mM CaCl ₂ in 0,9% NaCl-Lösungen und autoklavieren.
3. Autoklaven alle Lösungen, Nadeln, Elektroden, und Becher. Gründlich reinigen Nadeln mit Drähten zu vermeiden Verstopfung.
4. Bestimmung der geeigneten Menge an Zellen für die Kapseln verwenden (102 Mikrokapseln werden für jeden cm ² erforderlich, und auch gibt es ungefähr 500 Zellen pro Kapsel ^18). Verwenden Sie 1 ml Natriumalginat pro zwei Millionen Zellen.
5. Vorbereitung eines "Fibroblast Growth Medium", enthaltend 10% Kälberserum und 100 U / ml Penicillin / Streptomycin in einer hohen Glucose (4.500 mg / l Glucose), Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM).
   1. Vorbereitung einer "Differenzierung Medium I ', das 10% fötales Rinderserum, 10 ug / ml Insulin, 1 & mgr; M Dexamethason, 0,5 mM 3-Isobutyl-1-methyl xanthin und 100 U / ml Penicillin / Streptomycin in DMEM.
   2. Bereiten Sie eine "Differenzierungsmedium II ', das 10% fötales Rinderserum, 10 ug / ml Insulin und 100 U / ml Penicillin / Streptomycin in DMEM.
6. Vorbereitung Lysepuffer enthaltend ein Protease-Inhibitor-Tablette pro 10 ml Radioimmunfällung Assaypuffer (RIPA-Puffer).

2. Alginate Microbeads Vorbereitung (Abbildung 1A)

1. Entfernen Sie alte Medium von Zellkulturflasche. Spülen Zellen mit 10 ml PBS. Bringen Zellen in Suspension mit 0,25% Trypsin-EDTA (2 ml pro einem konfluenten T175-Kolben).
2. Zählen von Zellen in der Zellsuspension unter Verwendung eines Hämozytometers. Verwenden Sie 10 ml Aliquot aus der Zellsuspension und zählen Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers. Zentrifugieren der verbleibenden Zellen in Medium, Zentrifugation bei 480 × g bei Raumtemperatur für 5 min.
3. Suspendiere das Zellpellet in Natriumalginat, wie in Schritt 1.4 beschrieben. Übertragen die Natriumalginat-Zell-Lösung in einen 5 ml-Spritze.
4. Entfernen Sie Luftblasen in der Lösung, fügen Sie eine 23-Gauge-Nadel und drehen Sie die Spritze, um eine 1 ml Luftblase zu erstellen.
5. Setzen Sie einen kleinen Becher (180 ml) enthält 144 ml 100 mM CaCl _{2 -Lösung} unter der Nadel Auslauf des encapsulator. Bringen Sie die Elektrode an das encapsulator mit der Spitze approximLICH 2,5 cm über der Oberfläche des 100 mM CaCl _{2 -Lösung.}
6. Legen fest die Spritze mit dem Natriumalginat-Zell-Lösung in der Spritzenpumpe. Befestigen Sie den Gummischlauch an die Öffnung der Spritze. Drücken Sie den Kolben, bis der Natriumalginat-Zell-Lösung tritt auf halbem Weg durch das Rohr. Stellen Sie die Spannung bis 5,4 kV. Stellen Sie die 12,06 mm Durchmesser in der Spritzenpumpe. Passen Sie die Geschwindigkeit bis 3 ml / h. Starten Sie die Pumpe. Schalten Sie den encapsulator und Aufrechterhaltung der Spannung bei 5,4 kV.
7. Schließen Sie das Fenster der Haube und vermeiden unnötige Vibrationen bis zum Ende der Ausbildung der Alginat-Mikrokügelchen. Schließlich Lösung durch die Nadel spielt erstarren die Alginat kugelförmigen Mikroperlen in der 100 mM _{CaCl2-Lösung} für weitere 20 min vor der Beschichtung mit PLL.

3. Beschichtungs Microbeads mit PLL (1B)

1. Entfernen Sie das Becherglas mit der Natriumalginat-Zell kugelförmigen Mikroperlen und übertragen diese microbEADS in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen. Entfernen CaCl _{2 -Lösung} aus dem Mikrokügelchen Pellets.
2. Durch Zugabe von 30 ml 0,9% NaCl waschen die Alginat-Zell kugelförmigen Mikrokügelchen. Schütteln Sie das Röhrchen mit der Hand sanft. Entfernen Sie 0,9% NaCl mit 25 ml Pipette nach dem die Mikrokügelchen wurden durch die Schwerkraft ausgefällt. Wiederholen Sie zwei weitere Male für insgesamt 3 Waschschritten.
3. Verwenden von 10 ml 0,05% PLL-Lösung pro 1 ml Natriumalginatlösung. Fügen Sie die 0,05% PLL und Wirbel bei 1.000 Umdrehungen pro Minute für 10 Minuten.
   Hinweis: In der Regel ist 10 Minuten ausreichend für PLL-Beschichtung.
4. Nach PLL Mantel gebildet wird, entfernen Sie die PLL-Lösung und waschen Sie die Kapseln 3 mal wie in 3.2 beschrieben.

4. Entfernung von Alginat Core (1C)

1. 30 ml 50 mM Natriumcitrat-Lösung. Warte 5 Minuten oder bis das Natriumalginat aufgelöst ist. Waschkapseln dreimal wie in Schritt 3.1.1 beschrieben.
2. Entfernen Sie die 0,9% NaCl, 20 ml Kulturmedium zu der 50 ml Tubeabtreten und Kapseln mit den Zellen bis zu einer Zellkulturflasche. Griff eingekapselten Zellen unter Standardzellkulturbedingungen ^18.

5. In-vitro-Anwendungen zu Xenograft und Host-Zell-Interaktionen oder Kinetik der Metabolit Influx / Efflux zwischen Zellen zu untersuchen (Abbildung 2)

1. Kultur von Wirtszellen auf Platte mit 24 Vertiefungen bis zur Konfluenz für Co-Kulturen. Verwenden Sie die "Fibroblast Growth Medium 'für die Kultivierung Präadipozyten.
2. Transfer-Mikrokapseln in 24 Well-Platte mit konfluenten Wirtszellen. In Mikrokapseln, um eine Monoschicht zu erreichen (102 Mikrokapseln / cm ² von gut).
3. Induzieren Pre-Adipozyten-Differenzierung mit Differenzierungsmedium I. Jede 48 Stunden, Wechselmedien, um die Differenzierung Medium II für sechs Tage. Lyse-Zellen in RIPA-Puffer. Verwenden Sie 50 ug Protein pro Zustand um die Proteinexpression mittels Western-Blot-Analyse.

6. In vivo-Anwendung für Treatment of Obesity (Abbildung 3)

1. Mischen Sie 4% Isofluran mit Sauerstoff zur Einleitung der Narkose und 2% Isofluran mit Sauerstoff zur Aufrechterhaltung der Anästhesie. Bestätigen ausreichende Narkosetiefe von toe Prise.
   1. Bewerben Anti-Juckreiz Salbe auf die Augen, um die Hornhaut vor dem Austrocknen zu schützen.
2. Verwenden eingekapselten Zellen, die dauerhaft mit künstlichen fluoreszierendes Protein markiert sind, wie grün fluoreszierendes Protein (GFP).
3. Verwenden Sie ein 3-ml-Spritze und einer 20-Gauge-Nadel, um verkapselten Zellen injizieren.
   1. Injizieren 0,5 x 10 ⁶ Zellen in 0,2 ml PBS in jede IAB Fettdepots, die im Bereich zwischen einem intraperitoneale Gonade und Niere angeordnet ist, wie in 3 gezeigt eingestellt. Mit diesem Volumen PBS und die Zellzahl für Mäuse mit einem durchschnittlichen Gewicht von 40 g. Einzustellen Zellzahl und Volumen bei Mäusen, die unterschiedliche Gewichts oder zur Bestimmung der Dosis-abhängigen Wirkung.

Ergebnisse

Figur 1 zeigt, daß jeder Schritt der Mikroproduktion könnte unter dem Mikroskop kontrolliert werden. 2A zeigt, wie man mit einer Monoschicht von eingekapselten Zellen Kokultur Adipozyten. 2B ist ein repräsentatives Beispiel für eine quantitative Untersuchung mit Adipozyten / Mikrokapseln Kokulturen dass wurden in Abschnitt 5 beschriebenen Lysate von Adipozyten wurden mittels Western-Blot analysiert. Eingekapselten Zellen wurden in diesem Experiment untersucht. 1.000 Ver...

Diskussion

Verschiedene Verfahren wurden verwendet, um Zellen, einschließlich Trocknen, Extrudieren und Emulsion ¹⁹ einzukapseln. In diesem Verfahren werden die Alginatkapseln durch eine Nadel extrudiert, dann mit PLL beschichtet und das Alginat Kern aufgelöst wird, um die Verkapselung zu vervollständigen. Obwohl dieses Verfahren seit Jahren verwendet worden ist, ist die Bildung der Kügelchen mit der gewünschten Grße und Kugelform immer noch eine Herausforderung. Die Größe der Kapseln ist stark abhängig von der Viskosit...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Verkapselungsvorrichtung (VAR V1)	Nisco	LIN-0042	Keine
KD wissenschaftliche Spritzenpumpe	KD wissenschaftlich	780100Y	Keine
Olympus Mikroskop	Olympus Optical	IX70-S8F2	Keine
Natriumalginat	Sigma	MKBP8122V	Keine
Poly-L-Lysinhydrobromid (PLL)	Sigma	020M5006V	Keine
Calciumchlorid	Sigma	SLBJ2662V	Keine
Natriumcitrat dreibasisches Dihydrat	Sigma	030M0200	Keine
Natriumchlorid	Sigma	SLBD2595V	Keine
Mini-PROTEAN TGX Gele	Bio-Rad	456-1093	Keine
ATGL Primärantikörper (von Kaninchen)	Cell Signaling	2138S	Keine Sekundärer
Antikörper (Anti Kaninchen)	LI-COR	926-68071	Keine
Puffer für Radio-Immunpräzipitation Assay (RIPA)	Boston BioProducts	D25Y6Z	Keine
Phosphat gepuffert Kochsalzlösung (PBS)	Sigma	RNBD2893	Keine
Trypsin	Gibco	25200-056	Keine
Cortizon 10 Anti-Juckreiz-Salbe	Cortizon 10	C4029138	Keine
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-092	Keine
Serum für neugeborene Kälber (CS)	Sigma	N4762	Keine
Fötales Rinderserum (FBS)	Sigma	F4135	Keine
3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX)	Sigma	I0516	Keine
Dexamethason	Sigma	D4902	Keine
Insulin (Rinder)	Sigma	I5879	Keine
Proteasehemmer Cocktailtabletten	Roche	4693159001	Keine