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Methodenartikel

Direkter Protein Lieferung Säugerzellen mit Zellpermeable Cys

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DOI:

10.3791/52814

⸱

25. März 2015

 , 
1Departments of Chemistry and Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute, 2Shanghai Institute for Advanced Immunochemical Studies, ShanghaiTech University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Zinkfingerdomänen sind eigen zellpermeablen und fähig zur Vermittlung Proteinabgabe in einem weiten Bereich von Säugetierzelltypen. Hier wird eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Durchführung Zinkfinger-Technologie für die intrazelluläre Proteinabgabe dargestellt.

Zusammenfassung

Aufgrund ihrer Modularität und der Fähigkeit, umprogrammiert zu werden, um eine breite Palette von DNA-Sequenzen zu erkennen, haben sich Cys2-His 2 Zinkfinger-DNA-Bindungsdomänen als nützliche Werkzeuge für gezieltes Genom-Engineering erwiesen. Wie viele andere DNA-bindende Proteine besitzen auch Zinkfinger die angeborene Fähigkeit, Zellmembranen zu durchqueren. Wir haben kürzlich gezeigt, dass diese intrinsische Zellpermeabilität für die intrazelluläre Proteinverabreichung genutzt werden kann. Die genetische Fusion von Zinkfinger-Motiven führt zu einem effizienten Transport von Protein- und Enzymfracht in ein breites Spektrum von Säugetierzelltypen. Im Gegensatz zu anderen Proteintransduktionstechnologien hemmt die Verabreichung über Zinkfingerdomänen die Enzymaktivität nicht und führt zu einem hohen Maß an zytosolischer Verabreichung. Hier wird ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Implementierung der Zinkfinger-Technologie für den Proteintransport in Säugetierzellen vorgestellt. Die wichtigsten Schritte zum Erreichen eines hohen Niveaus an intrazellulärer Zink-Finger-vermittelter Abgabe werden hervorgehoben und Strategien zur Maximierung der Leistung dieses Systems werden diskutiert.

Einleitung

Hoch effizient und vielseitig Protein Lieferstrategien sind entscheidend für viele der Grundlagenforschung und therapeutische Anwendungen. Die direkte Lieferung von gereinigten Proteinen in Zellen ist eine der sichersten und einfachsten Methoden, um dies zu erreichen. Im Gegensatz zu 1,2-Strategien, die auf die Genexpression von Nukleinsäuren beruhen, stellt 3-5 Protein Liefer kein Risiko einer Insertionsmutagenese, ist unabhängig von der zelluläre Transkriptions / Translations-Maschinen und ermöglicht eine sofortige Wirkung. Jedoch das Fehlen einfacher und verallgemeinerbar Methoden auszustatten zellpenetrierenden Aktivität an Proteine ​​routine confounds ihrer direkten Eintritt in die Zellen. Aktuelle Verfahren zur Erleichterung der intrazellulären Proteinabgabe auf der Verwendung von natürlich vorkommenden oder 6-8 ausgebildet zellpenetrierenden Peptide 9-12 aufgeladenen Transduktion Domänen 13,14 Nanopartikel 15 und Liposomen, 16 virusähnlichen Partikeln 17,18 basierend und polymere Mikromaterialien. 19. Leider sind viele dieser Ansätze zeichnen sich durch geringe zelluläre Aufnahme Tarife, 20,21 schlechte Stabilität, 22 unbeabsichtigte Zelltyp-Spezifität, 23 Low endosomalen Flucht Objekte 24 und 25 neben Toxizität. behindert, viele Protein Übertragungstechnologien reduzieren die Bioaktivität der Proteine ​​geliefert. 14

In unserem Labor wurde gezeigt, dass Zinkfinger-Nuclease (ZFN) Proteine ​​- chimären Restriktionsendonukleasen aus einem programmierbaren Cys 2 -His 2 Zinkfinger-DNA-Bindungsprotein und die Spaltdomäne des FokI Restriktionsendonuklease 26-28 - inhärent zell- durchlässig. Es wurde gezeigt, 29 Diese überraschende zellpenetrierenden Aktivität eine intrinsische Eigenschaft des kundenspezifischen Zinkfinger-Domäne, einer DNA-bindenden Plattform, die als ein leistungsfähiges Werkzeug für die gezielte Genom en hervorgegangen sein,Engineering, 30-32 und als das Ergebnis der Konstellation von sechs positiv geladene Reste auf der Proteinoberfläche sein. Tatsächlich haben mehrere DNA-bindenden Proteinen, einschließlich c-Jun und N-DEK wurde gezeigt, dass eine angeborene Fähigkeit, Zellmembranen zu durchqueren besitzen. 33 In jüngerer Zeit haben unser Labor auf diese Ergebnisse und zeigten, dass die Zellen eindringende Aktivität zink- Finger (ZiF) Domains können für den intrazellulären Proteintransport genutzt werden. Genetische Fusion von entweder einem oder zwei Finger ZiF Domänen an spezifische Proteinfracht, ergab einen Wirkungsgrad, die viele herkömmliche zellpenetrierende Peptid Abgabesysteme überschritten Aufnahme. 34 Vor allem ZiF-vermittelte Abgabe nicht beeinträchtigen die Aktivität des fusionierten enzymatische Ladung und erleichtert hohe cytosolische Lieferung. Zusammen zeigen diese Ergebnisse zeigen das Potenzial der ZiF Domäne zur Erleichterung der effizienten und einfachen Verabreichung von Proteinen und möglicherweise mehrere verschiedene Arten von MakroMoleküle, in Zellen.

Hier wird eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Implementierung ZiF Technologie für Proteintransport in Säugerzellen präsentiert. Wir zuvor konstruierten eine Reihe von ein-, zwei-, drei-, vier-, fünf- und sechs Finger ZiF Domänen, die die Fähigkeit zur Bindung von DNA, durch Substitution von jeder der α-helicalen DNA-bindenden Reste fehlen, aber fähig sind, liefert Proteine ​​in Zellen 34 (Abbildung 1). Die Herstellung und die Transduktion von Smaragd GFP (EmGFP) in HeLa-Zellen unter Verwendung eines Zwei-Finger-Domäne ZiF beschrieben. Dieses Protokoll ist erweiterbar, um fast jedes Protein in der Lage, lösliche Expression in Escherichia coli und fast jedem Säugerzelltyp. Erwartete Ergebnisse werden bereitgestellt und Strategien für die Maximierung der Leistung des Systems ausgelegt werden ebenfalls diskutiert.

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Protokoll

1. Klonierung

  1. Erhalten Alanin-substituierten Zwei-Finger-ZiF Domänen, die in den pET-28 Expressionsvektorsystem subkloniert haben und sind auf Anfrage erhältlich (pET-2F-ZiF). 34
  2. PCR zu amplifizieren EmGFP aus dem Plasmid pBAD-Smaragd mit den Primern 5 'XmaI-EmGFP (5'-GGAAATTG CCCGGG ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC-3'; XmaI Website in fett) und 3'-SacI-EmGFP (5'-CGGATCT GAGCTC TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3 ' ; SacI-Stelle fett gedruckt).
    1. Verwenden 5 ng Template-DNA, 10 ul 10x-Polymerasepuffer, 1-Einheiten (U) Taq DNA-Polymerase, 0,2 mM von jedem dNTP und 0,2 & mgr; M von jedem Primer in 100 & mgr; l Lösung mit dem Restvolumen bis destilliertem / deionisiertem Wasser . Verwenden Sie die Zyklusbedingungen: 95 ° C für 5 min; 30 Zyklen von 95 ° C für 30 sec, 55 ° C für 30 sec und 72 ° C für 1 min; 72 ° C für 10 min. Ein Reinigen des PCR-Produkts durch Gel extractiauf und bestimmen, DNA-Konzentration unter Verwendung eines Spektrophotometers Mess Abs 260 x 50 & mgr; g / ml.
  3. Digest pET-2F ZIF und das Insert EmGFP mit den Restriktionsenzymen Xma kodiert I und Sac I in empfohlenen Puffer für 3 h bei 37 ° C unter Verwendung von 10 U Enzym pro 1 ug DNA. Visualisieren DNA durch Agarose-Gelelektrophorese unter Verwendung eines fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff wie Ethidiumbromid.
  4. Reinige den verdauten DNA durch Gelextraktionskit und bestimmen, DNA-Konzentration mit einem Spektrophotometer Mess Abs 260 x 50 & mgr; g / ml.
  5. Ligation der gereinigten EmGFP kodierenden DNA in 50 bis 100 ng pET-2F-ZiF mit 1 U T4-DNA-Ligase für mindestens 1 h bei RT. Die besten Ergebnisse erzielen, führen Sie die Ligationsreaktion mit einem 6: Einsatz-zu-Vektor-Molverhältnis 1.
  6. Thaw 50 ul aller chemisch kompetente XL-1 Blue E. coli Zellen auf Eis geben und vorsichtig mischen mit 10-20 ng ligierte pET-2F-ZiF-EmGFP.
  7. Halten Sie auf Eis für 30 min. Hitzeschock die Mischung bei 42 ° C für 90 sec und erholen sich die Zellen in 2 ml SOB-Medium mit Katabolitrepression (SOC) für 1 Stunde bei 37 ° C unter Schütteln.
  8. Verbreiten Sie 100 ul der Erholung Kultur auf einem LB-Medium (LB) Agar-Platte mit 50 ug / ml Kanamycin und Inkubation O / N bei 37 ° C.
  9. Am folgenden Tag inokulieren 6 ml Super Broth (SB) oder LB-Kultur, die 50 ug / ml Kanamycin mit einer Kolonie von der LB-Agar-Platte und Kultur O / N bei 37 ° C.
    Hinweis: Kolonie-PCR unter Verwendung der Primer 5 'XmaI-EmGFP und 3'-SacI-EmGFP könnte verwendet werden, um positive Klone zu identifizieren, bevor Miniprep werden.
  10. Reinige pET-2F ZIF-EmGFP durch Miniprep und Plasmid bestätigt durch DNA-Sequenzierung mit T7-Promotors (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ').

2. Expression und Reinigung

  1. Auftauen 50 ul chemisch kompetente BL21 E. coli-Zellen auf Eis geben und vorsichtig mischen mit 100 ng pET-2F-ZiF-EmGFP plasmid. Transform wie in Schritten von 1,7 bis 1,8 beschrieben.
  2. Am folgenden Tag impfen 10 ml LB-Medium, das 50 ug / ml Kanamycin mit einer Einzelkolonie und wachsen O / N bei 37 ° C unter Schütteln.
  3. Am folgenden Tag, verdünnt den 10 ml des O / N-Kultur in 1 l LB-Medium mit 50 ug / ml Kanamycin, 0,2% Glucose und 100 & mgr; M ZnCl 2 ergänzt. Die Kultur bei 37 ° C unter Schütteln bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm (OD 600) von 0,8 und induzieren Proteinexpression mit 2 mM Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG). Nach 6 Stunden Wachstum bei 37 ° C, Ernten der Zellen durch Zentrifugation bei 5.000 × g für 10 min bei 4 ° C.
    Anmerkung: Induktionsbedingungen sind sehr variabel und hängt von der Stabilität der Proteine ​​exprimiert. Überwachen der OD 600 alle 30 Minuten, bis eine OD 600 von 0,8 erreicht wird.
  4. Zellpellet in 5 ml Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 100 & mgr; M ZnCl 2, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM MgCl 2, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und 10 mM Imidazol, pH 8,0). Lyse der Zellen auf Eis durch Ultraschallbehandlung mit folgender Einstellung: 50% der Leistung, 4 min Prozesszeit mit 5 s an / 10 sec aus Intervallen. Vermeiden Sie eine Überhitzung der Lösung.
  5. Zentrifugieren Sie das Zelllysat bei 25.000 · g für 30 min bei 4 ° C und den Überstand in ein frisches Collection Tube. Die besten Ergebnisse erzielen, führen Sie alle folgenden Schritte bei 4 ° C.
  6. Führen des Überstandes durch eine Säule mit 1 ml äquilibriert Ni-NTA Aufschlämmung vorverpackt. Mit 20 ml Waschpuffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 100 & mgr; M ZnCl 2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl 2 und 30 mM Imidazol, pH 8,0) Waschen des Harzes.
  7. Eluieren des Proteins mit 5 ml Elutionspuffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 100 & mgr; M ZnCl 2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl 2 und 300 mM Imidazol, pH 8,0).
  8. Buffer tauschen die eluierte Protein mit Speicherpuffer (50 mMTris-HCl, 500 mM NaCl, 100 & mgr; M ZnCl 2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl 2 und 10% Glycerin, pH 8,0) und konzentriere das Protein zu mindestens 40 um unter Verwendung einer Spin-Konzentrator durch Zentrifugation gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  9. Bestimmen der Proteinkonzentration von BCA oder Bradford-Test. Mix 2 ul gereinigte Proteine ​​mit 2 & mgr; l 2 × SDS-PAGE-Ladepuffer, Kochen bei 95 ° C für 10 min und dann auf 4% zu lösen -20% Tris-Glycin-SDS-PAGE, um die Proteinreinheit (2) zu bewerten.

3. Protein Lagerung

  1. Aliquot des konzentrierten Protein, Flash Einfrieren in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C. Für EmGFP Fusionsproteine ​​umfassen das Röhrchen mit Aluminiumfolie, um das Protein vor Licht zu schützen.
  2. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Proteinlösung. Hinweis: ZiF-Fusionsproteine ​​sind für mindestens 1 Monat unter diesen Bedingungen stabil. Brachte oder> 4 Monate Lagerung führen kannum Proteinfällung oder Bleichen von EmGFP.

4. Protein Transduction

  1. Pflegen HeLa-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), das 10% (v / v) fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Antibiotikum-Antimykotikum bei 37 ° C in einer vollständig befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2.
    Anmerkung: Die Zellen passagiert mehr als 30 Mal werden für Proteintransduktionsdomäne empfohlen.
  2. Vorbeschichtung eine Platte mit 24 Vertiefungen mit 500 ul von 50 ug / ml poly-Lysin für 30 bis 60 min bei 25 ° C. Saatgutzellen auf eine Platte mit 24 Vertiefungen in einer Dichte von 2 × 10 5 Zellen pro Vertiefung. Bei 24 Stunden nach dem Aussäen oder einmal Zellen zwischen 80% -90% konfluent, entfernen Medien aus jeder Vertiefung und Waschen mit 500 ul vorgewärmtem serumfreiem DMEM (SFM).
  3. Zu jeder Vertiefung, fügen Sie 250 ul SFM mit 2 uM ZiF-EmGFP Protein und 100 uM ZnCl 2. Zellen bei 37 ° C für 1 Stunde. Hinweis: ZiF Domains in die Zellen primarily durch Makropinozytose, 34, die eine energieabhängige Mechanismus ist. Daher müssen die Zellen bei 37 ° C für eine effiziente Protein Internalisierung inkubiert werden.
  4. Entfernen Medien von Zellen, und dreimal mit 500 ul calcium- und magnesiumfreien Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS) mit 0.5 mg / ml Heparin ergänzt. Hinweis: Heparin ist notwendig, um oberflächengebundene Protein, das Downstream-Analysen erschweren könnten, zu entfernen.
  5. (Optional) Wiederholen Sie die Behandlung bis zu dreimal für erhöhte Auslieferung.
  6. Isolieren behandelten Zellen unmittelbar nach Heparin Wasch durch Verdau mit 0,05% Trypsin-EDTA bei 37 ° C für 2 min. Resuspendieren abgelösten Zellen in 0,5 ml DPBS mit 1% FBS ergänzt.
  7. Messen der Fluoreszenzintensität jeder Probe durch Flusszytometrie 35 mit der Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) Kanal (Abbildung 3). Stellen Sie die Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitwärtsstreuung (SSC), die Bevölkerung zu platzierenInteresse auf der Skala, um sicherzustellen, dass Populationen mit unterschiedlichen Eigenschaften voneinander gelöst.
  8. Sammle 10.000 Live-Veranstaltungen für jede Probe und die Daten mit Hilfe der Durchflusszytometrie Datenanalyse-Software. 36 Normalisieren Fluoreszenz von HeLa-Zellen mit ZiF-EmGFP auf diese Zellen nur mit SFM behandelten analysieren.

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Ergebnisse

Zwei-Finger-ZiF-EmGFP Fusionsproteine ​​in E. ausgedrückt werden coli mit> 95% Homogenität und hoher Ausbeute (> 25 mg / ml) (Abbildung 2). Im allgemeinen Ein- und Zwei-Finger kann in Mengen nahezu identisch mit denen des Wildtyp-unmodifizierte Protein ZiF Fusionsproteine ​​hergestellt werden. Jedoch in einigen Kontexten sind fünf- und sechs Finger ZiF Fusionsproteine ​​nicht in Ausbeuten hoch genug für nachfolgende Anwendungen hergestellt werden.

Dir...

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Diskussion

Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für Proteinabgabe mit zellpermeablen Zinkfinger (ZIF) Domänen dargestellt. Das ZiF Domain nicht senken die Aktivität verschmolzen enzymatische Fracht 34; erlaubt die Herstellung und Reinigung von Proteinen in Ausbeuten fast identisch mit denen mit unmodifizierten Protein beobachtet; und kann Proteine ​​und Enzyme mit Wirkungsgraden, die traditionelle zellpenetrierenden Peptid oder Proteintransduktionsdomäne Systeme übersteigen, in einer Vielzahl von Zelltypen zu tra...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (DP1CA174426 Carlos F. Barbas) und ShanghaiTech Universität, Shanghai, China (JL) unterstützt. Molekulare Grafiken wurden mit PyMol erzeugt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
XmaINew England BiolabsR0180L
SacINew England BiolabsR0156L
Expand High Fidelity PCR SystemRoche11759078001
dNTPsNew England BiolabsN0446S
4%-20% Tris-Glycin Mini-Proteingele, 1,5 mm, 10 WellsLife TechnologiesEC6028BOX
2x Laemmli ProbenpufferBioRad161-0737
T4 DNA LigaseLife Technologies15224-017
BL21 (DE3) Kompetent E. coliNew England BiolabsC2527I
IPTGThermo ScientificR0391
ZinkchloridSigma-Aldrich208086-5G
KanamycinsulfatFisher ScientificBP906-5
GlukoseSigma-AldrichG8270-100G
Tris BaseFisher ScientificBP152-25
NatriumchloridSigma-AldrichS9888-25G
DTTFisher ScientificPR-V3151 
PMSFThermo Scientific36978
Ni-NTA AgaroseharzQIAGEN30210
GlycerinSigma-AldrichG5516-500ML
ImidazolSigma-AldrichI5513-25G
Amicon Ultra-15 ZentrifugalfiltereinheitenEMO MilliporeUFC900324
DMEMLife Technologies11966-025
Fötales RinderserumLife Technologies10437-028
Antibiotikum Life Technologies15240-062
24-Well-Platte mit flachem BodenSigma-AldrichCLS3527-100EA
Poly-LysinSigma-AldrichP7280
DPBS, kein Kalzium, kein MagnesiumLife Technologies21600010
HeparansulfatSigma-AldrichH4777
TrypsinLife Technologies
HeLa-ZellenATCCCCL-2
Nano Drop ND-1000 Spektralphotometer Thermo Fisher Scientific
QIAquick PCR-AufreinigungskitQIAGEN28104
QIAquick Gel-ExtraktionskitQIAGEN28704
25300054

Referenzen

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DurchflusszytometrieProteinreinigungGenfusionbakterielle ExpressionZelltransduktionfluoreszierendes Proteincytosolische Delivery
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